Le protocole combine l’isolement spécifique à l’âge de cultures mixtes spontanées dérivées de cellules souches neurales contenant des cellules précurseurs d’oligodendrocytes différenciantes et des astrocytes, des tests imitant des conditions pathologiques et des lectures robustes et à haute teneur. Ces caractéristiques permettent d’étudier différemment la myélinisation développementale et la remyélinisation adulte dans des conditions physiologiques et pathologiques et dans un microenvironnement qui prend en considération l’apport des astrocytes. Pour l’isolement des cellules souches neurales du jour embryonnaire 13,5 à 14,5 cerveaux antérieurs fœtaux, placez la tête des embryons dans une boîte de Petri propre avec du PBS glacé et utilisez une pince pour retirer la peau du crâne sous grossissement.
Une fois que le cerveau est visible et débarrassé de la peau, utilisez une pince pour presser le cerveau hors du crâne et enlever le cervelet. Utilisez la pince pour enlever les méninges et placer le tissu isolé dans le tampon de dissociation non enzymatique. Lorsque tout le tissu cérébral a été isolé, prélèvez deux à trois échantillons dans 150 microlitres de tampon de dissociation non enzymatique par tube de 1,5 millilitre et incubez les tubes pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius en secouant continuellement.
À la fin de l’incubation, ajouter 850 microlitres de milieu standard à chaque tube et pipette pour mélanger jusqu’à ce que la suspension soit exempte d’amas. Si des tissus non dissociés sont encore visibles, laissez les échantillons reposer pendant deux minutes pour permettre aux tissus de se déposer au fond des tubes. Lorsque la dissociation est terminée, plaquer les cellules à une densité de 10 à 50 cellules par microlitre dans 10 à 30 millilitres de concentration de milieu neurosphère dans une fiole T25 ou T45, et placer la fiole dans l’incubateur de culture cellulaire en position verticale pour empêcher la fixation cellulaire.
à partir de souris adultes de 2,5 mois, placez les cerveaux de quatre à cinq souris adultes dans un tube de 50 millilitres de HBSS glacé et placez un cerveau, côté ventral vers le bas, dans la direction rostrale-caudale sur une fiole stérile recouverte de papier d’aluminium remplie d’eau froide de moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Utilisez une lame de rasoir pour enlever les bulbes olfactifs et couper deux à trois tranches coronales d’un millimètre d’épaisseur du cortex au chiasma optique. Placez les tranches sur la surface froide en position ventro-dorsale et identifiez le corps calleux et les deux ventricules latéraux.
En utilisant le grossissement, isolez les parois des ventricules latéraux, en prenant soin de ne pas inclure de morceaux du corps calleux, et placez le tissu isolé dans cinq à 10 millilitres de tampon de dissociation enzymatique pour une incubation de 15 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, pipettez les tissus au moins 50 fois avant d’incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes supplémentaires. À la fin de l’incubation, neutraliser la trypsine avec cinq millilitres de milieu de culture standard et filtrer la suspension tissulaire à travers un filtre de 70 microns.
Centrifuger la solution filtrée pendant cinq minutes à 400 fois g, et re-suspendre la pastille dans une solution de saccharose pour une deuxième centrifugation. À la fin de la centrifugation, suspendre à nouveau la pastille dans une solution de lavage de l’albumine sérique bovine pour une autre centrifugation, puis suspendre à nouveau la pastille dans un milieu de culture standard pour le comptage et plaquer les cellules dans une fiole verticale T-25 ou T-45. Pour la différenciation de la neurosphère primaire, ajoutez tous les deux jours des fibroblastes de base et des facteurs de croissance endothéliale à la culture de cellules souches neurales.
Lorsque les neurosphères atteignent un diamètre de 100 à 500 microns, les cellules passent par dissociation mécanique selon des protocoles standard. Pour la différenciation de l’oligosphère, traiter les cellules avec le facteur de croissance des fibroblastes de base dans le facteur AA dérivé des plaquettes tous les deux jours. Lorsque les oligosphères atteignent un diamètre de 100 à 150 microns, dissocier les sphères par dissociation mécanique selon les protocoles standard et ensemencer la suspension cellulaire à une densité de 3000 cellules par centimètre carré sur des plaques revêtues de laminine poly-DL-ornithine.
Après trois jours, remplacer le surnageant de chaque culture par le même volume de milieu de différenciation des oligodendrocytes. Pour effectuer une induction de bloc de différenciation médiée par l’inflammation, après la dissociation des neurosphères et pendant la production d’oligosphères, ajoutez le mélange de cytokines d’intérêt au milieu de culture. Pour induire la mort cellulaire de privation d’oxygène-glucose, deux jours après l’ensemencement dans les plaques multi-puits, transférer le surnageant de chaque culture dans les puits individuels d’une plaque multi-puits.
Ajouter la moitié du volume de milieu OGD aux puits et transférer les cultures dans une chambre d’hypoxie étanche à l’air saturée de 95% d’azote et de 5% de dioxyde de carbone. Placez la chambre dans l’incubateur de culture cellulaire. Après trois heures, remplacez le milieu dans les chambres par le milieu mis de côté de la plaque de culture multipuit.
Après avoir vérifié la qualité de la coloration cellulaire, dans le menu Acquisition du logiciel de criblage à haute teneur, sélectionnez Temps d’exposition fixe et Mini scan, puis sélectionnez 10 champs par puits et deux puits par condition expérimentale pour permettre de définir les paramètres d’analyse dans le sous-ensemble de champs pour l’ensemble de la plaque. Suivez le flux de travail étape par étape pour développer l’ensemble de l’algorithme. Sélectionnez Traiter l’image pour chaque couche et cliquez sur Suppression de l’arrière-plan pour sélectionner le niveau de signal souhaité.
Pour identifier et sélectionner les noyaux par coloration nucléaire, cliquez sur Identifier l’objet primaire, ajustez le seuil pour identifier les noyaux uniques, puis cliquez sur Valider les objets primaires pour définir les seuils en fonction des zones et de la position des objets. Cliquez sur Identifier les taches pour chaque canal correspondant aux marqueurs de lignée spécifiques, puis définissez la largeur de la valeur de l’anneau sur trois et la distance sur zéro pour permettre l’identification de la fluorescence cytoplasmique. Sélectionnez Niveaux de référence dans le flux de travail pour construire l’analyse et permettre le comptage automatique des noyaux condensés en fonction de la taille nucléaire et de l’intensité de coloration nucléaire et des cellules marqueurs positifs spécifiques en fonction de la fluorescence cytoplasmique identifiée par l’anneau, puis cliquez sur Jouer.
Au cours de la première phase de la culture, les cellules souches neurales maintiennent leur expression de nidification. La majorité des cellules sont également NG2-positives. Les cellules CNPase positives correspondant au stade pré-oligodendrocytes sont détectables trois à six jours après l’induction de la différenciation médiée par la T3, tandis que les oligodendrocytes MATUREs MBP-positifs apparaissent dans un pourcentage significatif après six à 12 jours in vitro.
L’analyse de criblage à haute teneur permet la détection de cellules individuelles dans la culture par coloration nucléaire et analyse de l’intensité de fluorescence. La composition de la culture à la fin de la phase de différenciation diffère selon que les cultures sont d’origine fœtale ou adulte, les cultures fœtales étant plus sensibles à la différenciation médiée par la T3 et atteignant un pourcentage plus élevé d’oligodendrocytes matures. Notez que lorsque des cellules précurseurs d’oligodendrocytes dérivées de cellules souches neurales sont ensemencées à haute densité, elles s’agrègent et se répliquent rapidement et les astrocytes qui se répliquent produisent rapidement une couche cellulaire confluente, empêchant l’observation de la forme caractéristique du filet d’araignée des oligodendrocytes matures.
Le blocage de la différenciation induit par l’inflammation induit une forte diminution des oligodendrocytes pré et matures, tels que détectés par la coloration à la CNPase et au MBP dans les cultures fœtales et adultes. Une augmentation du nombre de cellules précurseurs d’oligodendrocytes se produit également dans les cultures adultes traitées par cytokines. Alors que les cellules précurseurs d’oligodendrocytes fœtales et adultes présentent la même chose à l’exposition inflammatoire aux cytokines, seules les cultures dérivées du fœtus sont sensibles à la toxicité de la privation d’oxygène et de glucose.
La méthode peut être mise en œuvre avec n’importe quel type de cellules précurseurs d’oligodendrocytes, processus interférant de différenciation et de maturation, pour tester de nouvelles stratégies visant à lutter contre les maladies affectant la myélinisation ou la remyélinisation
