Les auteurs tiennent à remercier Jeanette Schermuly pour la préparation de recombinaison ARN polymérase T7 et Ebelt Norman pour l&#39;assistance dans la préparation de la figure 1. Ce travail a été financé par des fonds de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) et la Société Max Planck.

1. Génération de longue pré-crRNA substrats par PCR <ol><li> Conception des amorces de PCR ciblant les régions d&#39;espacement d&#39;un cluster CRISPR. Ajouter l&#39;ARN polymérase T7 séquence promotrice (T7RNAP) (5 &#39;-taatacgactcactata-3&#39;) de l&#39;amorce sens et des sites de restriction pour le clonage du produit de PCR dans un vecteur à deux amorces (par exemple BamHI et HindIII pour pUC19, Fig. 2A) . Remarque: Le T7RNAP nécessite un résidu guanidine pour l&#39;initiation de la transcription correcte. </li><li> Amplifier votre pré-crRNA séquence d&#39;intérêt à partir de l&#39;ADN génomique par PCR. </li><li> Séparer les produits de PCR sur gel d&#39;agarose par électrophorèse sur gel et extraire la bande désirée. Digérer le produit de PCR par les enzymes de restriction pour créer des extrémités cohésives (par exemple BamHI et HindIII, Fig. 2A). Purifiez votre produit PCR avec un kit de purification PCR pour éliminer les sous-produits de clivage. </li><li> Mettre en place une réaction de ligature qui contient l&#39;ADN ligase T4, T4 tampon de ligase d&#39;ADN etun rapport molaire de 3:1 du produit clivé par PCR et le vecteur déphosphorylé linéaire correspondant pUC avec des extrémités cohésives. Incuber le mélange à 16 ° C pendant la nuit. Transformer le mélange de ligation dans des cellules compétentes d&#39;Escherichia coli DH5a par des protocoles standard et utiliser le bleu blanc de dépistage pour identifier ligature réussie. </li><li> Isoler plasmides des colonies blanches en utilisant un kit de préparation de plasmide. Identifier les clones positifs par séquençage du plasmide. Alternativement, une PCR sur colonie pourrait être utilisé pour le dépistage. </li></ol> 2. Génération de pré-intermédiaire crRNA substrats par l&#39;intermédiaire d&#39;un recuit d&#39;oligonucléotides d&#39;ADN <ol><li> Concevoir avant et arrière oligonucléotides avec le CRISPR répétition / entretoise séquence désirée. Les oligonucléotides contiennent la séquence d&#39;un promoteur T7 RNAP ainsi que des sites de restriction terminaux (par exemple BamHI et HindIII pour pUC19). Terminer les oligonucléotides assurer que le formulaire collant se termine après recuit (voir Fig. 2B </strong&gt;). </li><li> 5&#39;-phosphoryle 1 nmol de chaque oligonucléotide dans une réaction séparée contenant 5 pi 20 pi de T4 polynucléotide kinase (PNK), 2 pl de tampon T4 PNK 10x, 2 pl ATP (10 mM). Incuber chaque échantillon pendant 1 heure à 37 ° C. </li><li> L&#39;hybridation des deux oligonucléotides phosphorylés. Mélanger 1 ul du mélange oligo phosphorylée avant (de 2,2.), 1 pl du mélange d&#39;oligo inverse phosphorylée (de 2,2.), 1 pl de tampon ligase d&#39;ADN T4 10x dans une réaction de 10 ul. Incuber les échantillons pendant 5 min à 95 ° C sur un bloc chauffant ou dans l&#39;eau bouillante, éteignez la source de chaleur et laisser le mélange refroidir à température ambiante (~ 2-3 heures). Remarque: Dans cette étape critique, le refroidissement lent favorise le recuit des deux oligonucléotides par rapport à la formation de structures à l&#39;intérieur de chaque oligonucléotide simple. </li><li> Ligaturer 4 pl du mélange d&#39;hybridation, 1 microlitre de vecteur pUC digéré et déphosphorylé (0,1 pg /ul) avec l&#39;ADN ligase T4, T4 ADN ligase tampon 10x et 10 mM d&#39;ATP dans un mélange de 20 ligature ul. Incuber l&#39;échantillon à 16 ° C pendant la nuit. </li><li> Transformer les plasmides ligaturés dans des cellules compétentes d&#39;Escherichia coli DH5a par des protocoles standard et utiliser dépistage bleu blanc. Isoler et identifier les plasmides des clones positifs par digestion (pour cribler pour des inserts de la taille désirée) et le séquençage du plasmide ultérieur. </li></ol> 3. Génération de courte substrats ARN Cas via la synthèse à façon d&#39;oligonucléotides ARN Conception court Cas ARN substrats (par exemple, des séquences répétitives simples, Fig. 2C) et d&#39;utiliser les installations personnalisées d&#39;ARN de synthèse d&#39;oligonucléotides. Remarque: L&#39;inclusion d&#39;un désoxyribonucléotide à une position spécifiée d&#39;un oligonucléotide d&#39;ARN (Fig. 2C) peut être utilisé pour localiser le site de clivage de l&#39;ARN. 4. T in vitro7 transcription ARN polymérase <ol><li> Isoler plasmides avec votre concept conçu (à partir de 1.9. Ou 2.7.) En utilisant un kit de purification de plasmide maxiprep. </li><li> Linéariser le plasmide avec l&#39;enzyme de restriction qui clive en aval du fragment cloné (par exemple HindIII). Assurer une digestion complète. Remarque: Si un 3 divergent délimité &#39;de l&#39;ARN transcrit est souhaitée, la construction conçu doit contenir un site de restriction spécifique supplémentaire pour &quot;run-off&quot; de la transcription en amont de la séquence HindIII. </li><li> Purifier le plasmide linéarisé par phénol: chloroforme (1:1) et l&#39;extraction de précipitation à l&#39;éthanol. Récupérer les acides nucléiques en remettant en suspension le culot dans de l&#39;eau stérile traitée au DEPC. </li><li> Mettre en place un embryon in vitro T7 ARNP ruissellement mélange de transcription qui contient 40 mM de HEPES / KOH (pH 8), 22 mM MgCl2, 5 mM de dithiothréitol, 1 spermidine mm, 4 mm de chaque nucléoside triphosphate (ATP, CTP, GTP, UTP ), 40-100 pg / ml de digéréPlasmides et 0,1 mg / ml T7 RNAP dans l&#39;eau traitée au DEPC. Incuber pendant 3 heures à 37 ° C. </li><li> Analyser les relevés de notes obtenus ARN sur un gel dénaturant de polyacrylamide 8 M d&#39;urée 12% (figure 3A). Les transcrits d&#39;ARN peut être purifié par Mono Q chromatographie échangeuse d&#39;anions 13 et récupéré par précipitation à l&#39;éthanol des fractions d&#39;ARN et de remise en suspension du culot dans de l&#39;eau DEPC stérile traité. Pour une utilisation ultérieure, conservez l&#39;ARN à -80 ° C. </li></ol> 5. Cas6 test endonucléase <ol><li> Mettre en place un 20 ul in vitro T7 ARNP ruissellement mélange de transcription (voir 4.4) qui contient une quantité réduite de 2 mM d&#39;ATP et est complété avec 2,5 ul-α [32 P] ATP (10 mCi / ml, 5000 Ci / mmol). Purifier les produits de réaction par extraction sur gel dénaturant à partir d&#39;un gel d&#39;urée 8 M polyacrylamide à 12%. Visualiser les bandes par autoradiographie. </li><li> Produire et purifier les protéines recombinantes souhaitées Cas. Dans cet exemple, CAS6 de Clostridium thermocellum a été purifié par précipitations et la chaleur Ni-NTA chromatographie. </li><li> Mettre en place une réaction de dosage endonucléase (par exemple pour Clostridium thermocellum Cas6, le mélange réactionnel contient 20 mM de HEPES (pH 8 KOH), 250 mM de KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 12 000 cpm ARN substrat et 1 uM enzyme et a été incubé à 37 ° C pendant 30 min). </li><li> Chargez 5 ul du mélange réactionnel (+ 10 pl de tampon de chargement ARN contenant 95% de formamide) sur un gel de polyacrylamide 8 M d&#39;urée 12%. Visualisez les produits de clivage après électrophorèse par autoradiographie. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Un exemple de l&#39;ARN substrats pour l&#39;analyse de l&#39;activité endonucléase Cas est montré sur la figure 3A. Une aliquote de 5 ul d&#39;une analyse 100 pi réaction de transcription in vitro ont été chargés. S&#39;il vous plaît noter que l&#39;efficacité de la production d&#39;ARN varie entre différentes constructions. Certains facteurs tchapeau ont été observés pour influencer la quantité d&#39;ARN obtenus sont (i) la séquence initiale à la suite de la G +1 requis pour l&#39;initiation de la transcription, (ii) la possibilité de formation de structure de l&#39;ARN lors de la transcription et (iii) le choix du site de restriction pour la génération de la position de coupure d&#39;écoulement. L&#39;enquête sur l&#39;activité endonucléase ARN exige à la fois hautement purifiée de protéines recombinantes Cas (Fig. 3B) et des contrôles appropriés négatifs. Idéalement, cet échantillon de contrôle négatif diffère aussi peu que possible de la réaction endonucléase Cas d&#39;une enquête. Ceci peut être obtenu par incubation de l&#39;ARN avec un tampon de réaction et la cellule-lysat sans Cas expression (et la suite de la procédure de purification identique). Un contrôle négatif idéal est l&#39;ajout d&#39;un désoxyribonucléotide au niveau du site de clivage proposé. La figure 3C, le clivage d&#39;une séquence 5 &#39;terminale de répétition marqué est représenté à Clostridium thermocellum Cas6. Sous<html> des conditions identiques, cette répétition n&#39;est pas un substrat plus quand un désoxyribonucléotide est introduit en position -9. Cette méthode fournit également des informations sur le site de clivage. Enfin, une longue interne étiquetés pré-crRNA est clivée par Cas6 et deux fragments de clivage sont respectées. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig1.jpg" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble schématique de CRISPR / Cas activité. La description ci-après l&#39;insertion d&#39;une séquence d&#39;ADN viral (protospacer) dans le groupe CRISPR (adaptation), la transcription et la transformation de la matrice de petites CRISPR dans crRNAs par une endonucléase de Cas6, l&#39;absorption de crRNAs dans le complexe en cascade et le brouillage d&#39;un répétée attaque virale basée sur la complémentarité entre crRNA et protospacer. Protospacer motifs adjacents (PAM) des séquences virales marque protospacer. igure 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg &quot;/&gt; Figure 2. Génération de l&#39;ARN substrats des protéines Cas. Le schéma montre le flux de travail pour produire (A) de longueur pré-crRNA substrats, (B) intermédiaire de pré-crRNA substrats et (C) Cas court ARN substrats pour pré-crRNA production. Exemple des séquences sont présentés pour l&#39;ensemble CRISPR de Clostridium thermocellum. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4277/4277fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig3.jpg" /> Figure 3. Cas6 test endonucléase. A.) Toluidine gel de polyacrylamide bleu teinté d&#39;un oligonucléotide conçu sur mesure ARN (250 pmol) et deux ARN in vitro transcriptions (5 pi d&#39;un type de réaction 100 pi). B.) gel SDS-PAGE d&#39;une préparation Cas6 (80 pmol) de Clostridium thermocellum après la chaleurprécipitation à 50 ° C pendant 1 heure et chromatographie Ni-NTA. C) La détection de endonucléolytique Cas6 activité 5 &#39;terminale des séquences répétées étiquetés et pré-crRNA transcrits in vitro. L&#39;introduction d&#39;un dNTP à position -9 abolit Cas6 clivage d&#39;un substrat à court Cas ARN (S, fig. 2C). A 5 &#39;terminal 8 tag nt est également généré pour la maturation crRNA de longue pré-crRNA substrats (L, Fig. 2A). Les bandes ont été séparés sur un gel dénaturant 8 M d&#39;urée 12% de polyacrylamide et visualisés par autoradiographie.

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	<li>Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes.">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315, 1709-1712 (2007).</li><li>Makarova, K. S., Grishin, N. V., Shabalina, S. A., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+RNA-interference-based+immune+system+in+prokaryotes:+computational+analysis+of+the+predicted+enzymatic+machinery,+functional+analogies+with+eukaryotic+RNAi,+and+hypothetical+mechanisms+of+action.">A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action.</a> Biol. Direct. 1, 7 (2006).</li><li>Lillest&#248;l, R. K., Redder, P., Garrett, R. A., Brugger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+viral+defence+mechanism+in+archaeal+cells.">A putative viral defence mechanism in archaeal cells.</a> Archaea. 2, 59-72 (2006).</li><li>Makarova, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+classification+of+the+CRISPR-Cas+systems.">Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9, 467-477 (2011).</li><li>Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes.">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321, 960-964 (2008).</li><li>Carte, J., Pfister, N. T., Compton, M. M., Terns, R. M., Terns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+and+cleavage+of+CRISPR+RNA+by+Cas6.">Binding and cleavage of CRISPR RNA by Cas6.</a> RNA. 16, 2181-2188 (2010).</li><li>Haurwitz, R. E., Jinek, M., Wiedenheft, B., Zhou, K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-+and+structure-specific+RNA+processing+by+a+CRISPR+endonuclease.">Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease.</a> Science. 329, 1355-1358 (2010).</li><li>Gesner, E. M., Schellenberg, M. J., Garside, E. L., George, M. M., Macmillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+maturation+of+effector+RNAs+in+a+CRISPR+interference+pathway.">Recognition and maturation of effector RNAs in a CRISPR interference pathway.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 688-692 (2011).</li><li>Carte, J., Wang, R., Li, H., Terns, R. M., Terns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas6+is+an+endoribonuclease+that+generates+guide+RNAs+for+invader+defense+in+prokaryotes.">Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes.</a> Genes Dev. 22, 3489-3496 (2008).</li><li>Wiedenheft, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+RNA-guided+surveillance+complex+from+a+bacterial+immune+system.">Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system.</a> Nature. 477, 486-489 (2011).</li><li>Garneau, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468, 67-71 (2010).</li><li>Sinkunas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas3+is+a+single-stranded+DNA+nuclease+and+ATP-dependent+helicase+in+the+CRISPR/Cas+immune+system.">Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system.</a> EMBO J. 30, 1335-1342 (2011).</li><li>Jahn, M. J., Jahn, D., Kumar, A. M., S&#246;ll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mono+Q+chromatography+permits+recycling+of+DNA+template+and+purification+of+RNA+transcripts+after+T7+RNA+polymerase+reaction.">Mono Q chromatography permits recycling of DNA template and purification of RNA transcripts after T7 RNA polymerase reaction.</a> Nucleic Acids Res. 19, 2786-2787 (1991).</li><li>Sampson, J. R., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+physical+characterization+of+an+unmodified+yeast+phenylalanine+transfer+RNA+transcribed+in+vitro.">Biochemical and physical characterization of an unmodified yeast phenylalanine transfer RNA transcribed in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 1033-1037 (1988).</li><li>Dreher, T. W., Bujarski, J. J., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+viral+RNAs+synthesized+in+vitro+show+altered+aminoacylation+and+replicase+template+activities.">Mutant viral RNAs synthesized in vitro show altered aminoacylation and replicase template activities.</a> Nature. 311, 171-175 (1984).</li><li>McGinness, K. E., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitution+of+ribonucleotides+in+the+T7+RNA+polymerase+promoter+element.">Substitution of ribonucleotides in the T7 RNA polymerase promoter element.</a> J. Biol. Chem. 277, 2987-2991 (2002).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les méthodes présentées permettent la génération de substrats endonucléase SAE de gammes de tailles différentes et avec plus ou moins de liberté dans la conception de séquence. L&#39;approche la plus straight-forward pour la génération de substrats synthétiques d&#39;oligonucléotides d&#39;ARN est limitée à de courtes créations d&#39;ARN en raison de l&#39;augmentation des coûts et des limitations techniques dans la création de plus oligomères d&#39;ARN. Bien réussir la synthèse d&#39;ARN a été rapportée pour les oligomères d&#39;ARN non modifiés de plus de 100 nucléotides de longueur, le maximum pratique et économique pour l&#39;ARN de synthèse sur mesure est inférieure à 40 nucléotides. Cependant, toute séquence donnée peut être synthétisé et l&#39;introduction ciblée de nucléotides modifiés (par exemple désoxyribonucléotides) peut être utilisé pour analyser des sites de clivage dans le détail. Plus pré-ARNc doit être généré par transcription in vitro. Le recuit d&#39;oligonucléotides qui contiennent un promoteur de T7 ARN polymérase permet la production d&#39;une longueur intermédiaire de pré-CRRNComme. La longueur maximale de routine et économiquement oligonucléotides d&#39;ADN synthétisés se trouve au-dessus de 150 nucléotides et représente le maximum de pré-synthèse crRNAs par cette méthode. L&#39;assemblage de plusieurs paires d&#39;oligonucléotides d&#39;ADN recuit qui forment des extrémités cohésives avec l&#39;autre peut étendre cette durée maximale, mais nécessite des défis croissants dans le clonage de la construction. Le principal avantage de cette méthode est sa capacité à générer des pré-crRNA constructions (et donc Cas endonucléase de substrats) avec un ordre quelconque. Ceci permet à l&#39;essai de prototypes de crRNA synthétiques. Enfin, les grandes pré-crRNAs peut être obtenu à partir de produits d&#39;amplification PCR des éléments entiers CRISPR génomiques ou en fractions. Des altérations de la transcription in vitro dans le modèle plasmide peut être introduit par mutagénèse dirigée pour la génération de pré-crRNA variantes. Ces constructions peuvent être utilisées pour analyser le motif de clivage mondial endonucléolytique au sein d&#39;un ensemblepré-crRNA. Le travail de pionnier pour la production d&#39;ARN non modifié par l&#39;ARN polymérase T7 transcription in vitro a été basée sur 14 ARN de transfert et ARN virus de la mosaïque du brome 15. Le promoteur consensus T7 ARN polymérase est constituée d&#39;un domaine de reconnaissance (-17 à travers -5) et un domaine d&#39;initiation (-4 à travers +6) avec initiation de la transcription à une guanosine essentiel +1 16. En aval des postes de +1 peut être variée qui permet la transcription de presque toute séquence d&#39;ARN désiré. Les méthodes présentées pour générer des modèles de transcription in vitro de ruissellement pour permettre la synthèse in vitro de pré-complets qui correspondent à des régions crRNAs CRISPR génomique ou synthétique pré-crRNA variantes. Les transcrits sont générés en présence d&#39;un triphosphate 5&#39;-terminale à moins que la réaction de transcription est amorcée avec GMP pour obtenir 5 &#39;monophosphate extrémités 14. Ces terminaisons sont nécessaires si les relevés de notes doivent être étiquetésla T4 polynucléotide kinase et γ-[32P]-ATP. Activité de clivage de Cas6 et Cas6 enzymes analogues génère crRNA qui contiennent 5&#39;-hydroxyle et un 2 &#39;, 3&#39;-phosphate extrémités cycliques. Ces ARN peuvent ensuite être analysées pour la reconnaissance par le complexe Cascade.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Antarctique Phosphatase </td><td> ONE </td><td> M0289L </td><td></td></tr><tr><td> dans Triphosphates transcription in vitro ultrapure année nucléotides </td><td> Jena Bioscience </td><td> NU-1010 - NU-1013 </td><td></td></tr><tr><td> Chromatographie en phase liquide, ktapurifier 100 </td><td> GE Healthcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oligonucléotides d&#39;ADN </td><td> MWG Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oligonucléotides d&#39;ARN </td><td> MWG Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel Extraction Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> Kit de purification de PCR </td><td> QIAGEN </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Spin Miniprep </td><td> QIAGEN </td><td> 27106 </td><td></td></tr><tr><td> Maxi Kit plasmide </td><td> QIAGEN </td><td> 12163 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> ONE </td><td> R0136L </td><td></td></tr><tr><td> HindIII </td><td> ONE </td><td> R0104L </td><td></td></tr><tr><td> ADN ligase de T4 </td><td> ONE </td><td> M0202S </td><td></td></tr><tr><td> T4 polynucléotide kinase </td><td> Ambion </td><td> AM2310 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA Polymerase </td><td> propre préparation </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mix Solution désoxynucléotide </td><td> ONE </td><td> N0447L </td><td></td></tr><tr><td> Mini-PROTEAN d&#39;électrophorèse Tetra </td><td> Bio-Rad </td><td> 165-8001 </td><td></td></tr><tr><td> Storm 840 Scanner </td><td&gt; GE Healthcare </td><td> 163723 </td><td></td></tr><tr><td> Stockage Phosphorscreen </td><td> Molecular Dynamics </td><td> 63-0034-81 </td><td></td></tr><tr><td> Mono Q 5/50 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5166-01 </td><td></td></tr><tr><td> Polymérase Phusion ADN haute fidélité </td><td> ONE </td><td> M0530L </td><td> utiliser le tampon GC </td></tr><tr><td> Bleu de toluidine </td><td> Sigma </td><td> T3260 </td><td></td></tr><tr><td> pUC19 </td><td> ONE </td><td> N3041S </td><td></td></tr><tr><td> γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP </td><td> Hartmann Analytic </td><td> SRP-401, PRS-307 </td><td></td></tr></tbody></table>

substrate generation for endonucleases of crispr/cas systems

L&#39;interaction des virus et leurs hôtes procaryotes façonné l&#39;évolution de la vie bactérienne et Archaea. Les procaryotes développé plusieurs stratégies pour échapper aux attaques virales qui comprennent la modification restriction, infection abortive et CRISPR / Cas des systèmes. Ces systèmes immunitaires adaptatives trouvés dans de nombreuses bactéries et les archées se composent de plus lustré c r i egularly nterspaced s hort p alindromic r EPEAT (CRISPR) et un certain nombre de séquences de C RISPR que sociated (CAS) gènes (Fig. 1) 1-3. Différents ensembles de protéines Cas et répète définir au moins trois grands types divergents de CRISPR / Cas systèmes 4. Les protéines universelles CAS1 et CAS2 sont proposées pour être impliqués dans l&#39;absorption de l&#39;ADN viral quigénère un nouveau élément d&#39;écartement entre deux répétitions à l&#39;extrémité 5 &#39;d&#39;une grappe CRISPR s&#39;étendant 5. L&#39;ensemble du cluster est transcrit en un précurseur contenant tous crRNA-entretoise et des séquences répétées et est ensuite traité par une enzyme de la famille diversifiée Cas6 en petits crRNAs 6-8. Ces crRNAs constitués de la séquence flanquée par une entretoise 5 &#39;terminale (8 nucléotides) et une région 3&#39; terminale variable dérivée de la séquence répétée 9. Une infection répétée du virus peuvent maintenant être bloqué comme la nouvelle crRNA sera dirigé par un complexe protéique Cas (Cascade) à l&#39;ADN viral et l&#39;identifier comme tel via 10 la complémentarité de base. Enfin, pour CRISPR / Cas des systèmes de type 1, le CAS3 nucléase va détruire l&#39;envahisseur détecté l&#39;ADN 11,12. Ces processus définissent CRISPR / Cas en tant que système immunitaire adaptatif des procaryotes et a ouvert un domaine de recherche fascinant pour l&#39;étude des protéines impliquées Cas.La fonction d&#39;un grand nombre de protéines Cas est toujours insaisissable et les causes de la diversité apparente des systèmes CRISPR / Cas restent à éclairer. Les activités potentielles de la plupart des protéines ont été prédites par Cas des analyses détaillées de calcul. Une fraction importante de protéines Cas sont soit montré ou proposé à fonctionner comme endonucléases 4. Ici, nous présentons les méthodes pour générer des précurseurs et crRNAs-ARNc pour l&#39;étude de Cas endoribonucléases. Dosages différents exigent des endonucléases de séquences répétées courtes soit qui peuvent être directement synthétisés comme oligonucléotides d&#39;ARN ou des séquences plus crRNA et pré-crRNA qui sont générés in vitro par l&#39;ARN polymérase T7 de ruissellement de la transcription. Cette méthodologie permet l&#39;incorporation de nucléotides radioactifs pour la production de substrats marqués endonucléase interne et la création de crRNAs synthétiques ou mutant. Cas6 activité endonucléase est utilisé pour mûrir pré-crRNAs en crRNAs avec 5&#39;-hydroxyle et un 2 &#39;, 3&#39;-terminales phosphate cyclique.

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Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

CRISPR / Cas systèmes médiate immunité adaptative dans les bactéries et les archées. De nombreuses protéines sont proposées Cas d&#39;agir comme endoribonucléases agissant sur les précurseurs crRNA de longueur variable. Ici, nous illustrons trois approches différentes pour générer des pré-crRNA substrats pour l&#39;analyse biochimique de l&#39;activité endonucléase de Cas.

Génération substrat pour des endonucléases de CRISPR / Cas Systems

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

27.2K vues.  Max-Planck-Institute for Terrestrial Microbiology. CRISPR / Cas systèmes médiate immunité adaptative dans les bactéries et les archées. De nombreuses protéines sont proposées Cas d'agir comme endoribonucléases agissant sur les précurseurs crRNA de longueur variable. Ici, nous illustrons trois approches différentes pour générer des pré-crRNA substrats pour l'analyse biochimique de l'activité endonucléase de Cas.

Vidéo: Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Utiliser Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) pour développer des outils diagnostiques

Recherche

Biologie

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of cells (approximately 25 in C. borealis) which are well characterized. The cells in the STG exhibit a broad range of outputs and are responsible for the motor actions of the stomach. The stomach contains the gastric mill which breaks down food with three internal teeth, and the pylorus which filters the food before it reaches the midgut. The STG produces two rhythmic outputs to control the gastric mill and pylorus known as central pattern generators (CPGs). Each cell in the STG can participate in one or both of these rhythms. These CPGs allow for the study of neuromodulation, homeostasis, cellular and network variability, network development, and network recovery.
The dissection of the stomatogastric nervous system (STNS) from the Jonah crab (Cancer borealis) is done in two parts; the gross and fine dissection. In the gross dissection the entire stomach is dissected from the crab. During the fine dissection the STNS is extracted from the stomach using a dissection microscope and micro-dissection tools (see figure 1). The STNS includes the STG, the oesophageal ganglion (OG), and the commissural ganglia (CoG) as well as the nerves that innervate the stomach muscles. Here, we show how to perform a complete dissection of the STNS in preparation for an electrophysiology experiment where the cells in the STG would be recorded from intracellularly and the peripheral nerves would be used for extracellular recordings. The proper technique for finding the desired nerves is shown as well as our technique of desheathing the ganglion to reveal the somata and neuropil.

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric nervous system (STNS) of the Jonah crab (C. borealis) can be used for electrophysiology, immunohistochemistry, and cell culture studies. The STNS extraction is done in two parts: the gross and fine dissection.

Cancer borealis Stomatogastric dissection du système nerveux

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Dissection brut de l&#39;estomac du homard, Homarus americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Génération de l&#39;homme CD40-B activés cellules

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoprotéomique quantitatives en acide gras Stimulé Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Tri cellulaire activé par fluorescence des protoplastes végétaux

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Synthèse et d&#39;étalonnage des nanosondes phosphorescent pour l&#39;imagerie oxygène dans les systèmes biologiques

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

Tests biophysiques pour sonder les propriétés mécaniques du noyau cellulaire interphase: Application Strain Substrat et manipulation Microneedle

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

L&#39;utilisation de chémostats dans microbienne biologie des systèmes

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Génération de Myospheres De CSEh par Reprogrammation épigénétique

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...