Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH R03: DK089061-01 (VKY); NIH: K08 DK068391 (VKY), le diabète et d&#39;endocrinologie Centre de recherche-(DERC - P30DK079638) au Baylor College of Medicine, une subvention de pilote et de faisabilité de l&#39;DERC (VKY); Juvenile Diabetes Research Foundation: Prix FRDJ # 5-2006-134 (VKY).

<ol>
	<li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+helper-dependent+adenovirus+vector+system:+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal.">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li><li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector.">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li><li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li><li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor.">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li><li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li><li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-efficiency+Cre/loxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors.">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li><li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production.">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li><li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors.">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes.">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice.">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

HDAds ont été développées pour surmonter la faiblesse des annonces de première génération et à exploiter pour l&#39;application de thérapie génique. Toutefois, des problèmes techniques subsistent. Par exemple, HDAd nécessite HT pour l&#39;emballage HDAd et d&#39;amplification vecteur n&#39;est pas aussi efficace que les premières générations annonces. HV est une annonce de première génération et toute contamination de compromis HV l&#39;efficacité de HDAd. Par conséquent, la transfection très efficace et des conditions optimales pour chaque passage en série sont essentiels. Un autre paramètre essentiel pour la production de vecteurs qui est de passage (P1 à P4) doit être utilisé pour le passage ultérieur 5 qui est directement utilisé comme inoculum pour les cellules en suspension. Pour notre expérience, les meilleurs résultats sont obtenus en utilisant le passage par lequel proportion vecteur HDAd est augmenté de façon spectaculaire dans le passage suivant (P3 de la figure 2). Le rendement des vecteurs HDAd dépend de cassettes transgène. Au cours de la production de vecteurs, les deux transgènes sont exprimés parce que les deux gènes sont souspromoteur ubiquitaire. Ngn3 est un facteur de transcription et de la CTB est un facteur de croissance, ce qui suggère que le facteur de transcription HDAd vecteur exprimant ce qui peut influer sur la lignée cellulaire inhibe l&#39;amplification vecteur tandis que l&#39;hormone de croissance contribue à exprimer la replication du vecteur et de l&#39;emballage. Avec le diabète prend des proportions épidémiques, de nouvelles approches pour restaurer la masse des cellules b sont nécessaires. Dans ce rapport, nous décrivons les méthodes pour exploiter les avantages de vecteurs HDAd pour effectuer le transfert de gènes de l&#39;îlot lignée de définir le facteur de transcription, Ngn3 avec le facteur de croissance des îlots, bêtacelluline pour induire néogenèse des îlots dans les régions périportaux du foie. Pour évaluer l&#39;efficacité de ce fait, il est important de choisir des souris présentant une hyperglycémie stable et s&#39;assurer que les contrôles appropriés sont toujours inclus. Pour ces expériences de transfert de gènes, le vecteur vide ont traité des souris diabétiques doivent toujours être utilisés. En outre, en utilisant HDAd-Ngn3 et HDAd-Btc traitées individuellement diabétique kmCE sert à tester la contribution individuelle de ces deux gènes dans des îlots néogenèse. Comme nos données démontrent que Ngn3 seule est suffisante pour induire îlot néogenèse, mais l&#39;ajout du facteur de croissance, la CTB, sert à augmenter la réponse conduisant à l&#39;induction robuste de l&#39;îlot néogenèse. Il est également important de vérifier que le vecteur d&#39;expression est en effet réalisé dans le tissu cible, le foie et aussi de démontrer que l&#39;insuline dosée dans le plasma des souris traitées ne vient pas des îlots résiduels dans le pancréas, en démontrant l&#39;absence de pancréas îlots chez les souris diabétiques. En résumé, l&#39;avantage du système HDAd-vecteur de transfert de gènes réside dans sa capacité de clonage élevée, une transduction efficace et à long terme l&#39;expression des gènes durable dans le foie avec une toxicité chronique minimale ainsi que la nature de la non-intégration du génome vecteur dans l&#39;hôte chromosome. Les principales limites sont les étapes complexes qui interviennent dans sa production et saapplication in vivo est principalement limité au foie avec le sérotype le plus populaire Ad 5. Islet néogenèse peut être amené à restaurer entièrement l&#39;insulinémie et la tolérance au glucose chez les souris diabétiques en induisant néogenèse des îlots dans le foie par transfert de gène du facteur de transcription îlot lignée définissant, Ngn3 avec le facteur de croissance des îlots, bêtacelluline. Dans ce rapport, nous montrons le protocole optimal pour produire de haute qualité HDAd-Ngn3 et HDAd-Btc, et la démonstration de techniques pour inciter et d&#39;évaluer néogenèse des îlots dans le foie des souris diabétiques pour inverser l&#39;hyperglycémie. Note: Les vecteurs viraux et les lignées cellulaires décrites ici sont disponibles dans le Laboratoire de base Vecteur de production, recherche sur le diabète Center, Baylor College of Medicine ( <a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a> ). Certains kits commerciaux sont également disponibles pour générer des virus (par exemple HDAd Microbix biosystems Inc.)

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Kit de transfection de mammifères ProFectionR </td><td> Promega </td><td> E1200 </td></tr><tr><td> DNeasy Blood Kit et de tissus (50) </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> Perfecta SYBR Green Supermix, ROX </td><td> Quanta Biosciences </td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td> Désoxycholate de sodium </td><td> Sigma </td><td> D6750-25G </td></tr><tr><td> MEM poudre </td><td> Invitrogen </td><td> 61100087 </td></tr><tr><td> La streptomycine Pénicilline </td><td> Sigma </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Hygromycine B </td><td> Sigma </td><td> H0654-1G </td></tr><tr&gt; <td> MEM EAGLE Joklik </td><td> Sigma </td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> Rnase </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNase I, grade II </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Streptozocine </td><td> Sigma </td><td> s0130 </td></tr><tr><td> Verre spinner flacons </td><td> Corning </td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td> Verre spinner flacons </td><td> Corning </td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> Faites glisser une casset-lyseur </td><td> PIERCE CH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td> Tube OptiSeal poly allomer, 11,2 ml </td><td> Beckman Coulter </td><td> 362181 </td></tr><tr><td> Chlorure de césium 1 kg </td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman LE-80K </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optimal LE-80K ultracentrifugeuse </td></tr><tr><td> Filtrer </td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td> Centrifuger le tube à 500 ml </td><td> Corning </td><td> 431123 </td></tr><tr><td> tailveiner restrainer </td><td> Braintree scientifique, INC </td><td> tv-150 </td></tr><tr><td> L&#39;insuline, Souris ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> Microvette cb300 </td><td> Sarstedt </td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td></tr><tr><td> Souris C-peptide ELISA Kit </td><td> Wako Pure Chemical Industries, Ltd </td><td> # 631-07231 </td></tr><tr><td> Guinée porc anticorps anti-insuline </td><td> Abcam </td><td> ab7842 </td></tr><tr><td> de chèvre anti-anticorps Pdx1 </td><td> don du Dr. Christopher Wright </td><td></td></tr><tr><td> souris anti Ngn3 anticorps </td><td> Beta Cell Biology Consortium, Univ. de Pennsylvanie </td><td> AB2013 </td></tr><tr><td> souris anti Nkx6.1 anticorps </td><td> Beta Cell Biology Consortium, Univ. de Pennsylvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td> bêtacelluline anticorps anti- </td><td> Cell Sciences </td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT (SGPT) SET Couleur réactif. </td><td> Diagnostics Teco </td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> AST / (SGOT), jeu de réactifs Couleur Endpoint </td><td> Diagnostics Teco </td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Réactifs et équipements spécifiques.

neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer

Diabète de type 1 est causé par des lymphocytes T destruction auto-immune des cellules productrices d&#39;insuline dans le pancréas. Jusqu&#39;à présent remplacement de l&#39;insuline est encore le traitement majeur, car la transplantation d&#39;îlots a été limitée par la disponibilité des bailleurs de fonds et par la nécessité d&#39;immunosuppression à long terme. Induite îlot néogenèse par transfert de gène de Neuogenin3 (Ngn3), l&#39;îlot lignée définir facteur de transcription spécifique et bêtacelluline (BTC), un facteur de croissance îlot a le potentiel de guérir diabète de type 1. Les vecteurs adénoviraux (Ads) sont très efficaces vecteur de transfert de gène, mais Annonces de première génération présentent plusieurs inconvénients pour une utilisation in vivo. Helper-dépendants Annonces (HDAds) sont les annonces les plus avancées qui ont été développées pour améliorer le profil de sécurité de première génération de pub et de prolonger l&#39;expression du transgène 1. Ils manquent de toxicité chronique parce qu&#39;ils n&#39;ont pas les séquences codantes virales 2-5 et ne conserver que l&#39;annonce cis elNTS nécessaires à la replication du vecteur et de l&#39;emballage. Cela permet le clonage des gènes jusqu&#39;à 36 ko. Dans ce protocole, nous décrivons la méthode de production HDAd-Ngn3 et HDAd-Btc et de livrer ces vecteurs dans des souris diabétiques STZ-induits. Nos résultats montrent que la co-injection de HDAd-Ngn3 et «îlots» néo-HDAd Btc induit dans le foie et renverse l&#39;hyperglycémie chez des souris diabétiques.

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Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Nous décrivons hépatique néo-îlots formation en STZ (streptozotocine)-induite des souris diabétiques par transfert de gène de Neurogenin3 (Ngn3) et bêtacelluline (Btc) à l&#39;aide d&#39;aide en fonction de vecteur adénoviral (HDAd) et la reprise de l&#39;hyperglycémie. Notre méthode prend avantages de helper-vecteurs adénoviraux dépendants de leur très efficace dans la transduction in vivo et l&#39;expression du gène de longue durée.

Neo-Islet formation dans le foie des souris diabétiques par Helper-dépendante Transfert de gènes à médiation adénovirale Vecteur

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

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