Este trabalho foi suportado por concessões do NIH: R03 DK089061-01 (VKY); NIH: K08 DK068391 (VKY), o Diabetes e Endocrinologia Centro de Pesquisa (DERC - P30DK079638) no Baylor College of Medicine, uma bolsa de piloto e de viabilidade de do DERC (VKY); Juvenile Diabetes Research Foundation: JDRF Prêmio # 5-2006-134 (VKY).

<ol>
	<li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+helper-dependent+adenovirus+vector+system:+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal.">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li><li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector.">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li><li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li><li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor.">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li><li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li><li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-efficiency+Cre/loxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors.">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li><li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production.">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li><li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors.">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes.">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice.">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

HDAds têm sido desenvolvidas para ultrapassar a fraqueza de anúncios geração inicial e para aproveitar para aplicação de terapia génica. No entanto, os desafios técnicos permanecem. Por exemplo, requer HDAD HV para embalagens HDAD e amplificação vector não é tão eficiente como os anúncios geração antecipada. HV é um anúncio de primeira geração e de qualquer contaminação de compromisso da eficácia da HV HDAD. Portanto, transfecção altamente eficiente e as condições ideais para cada passagem de série são críticos. Um outro parâmetro crítico para a produção de vector é que a passagem (P1-P4) deve ser utilizada para a passagem subsequente de 5, que é directamente utilizado como inoculo para as células em suspensão. Para a experiência, os melhores resultados são obtidos utilizando a passagem pela qual HDAD proporção vector é dramaticamente aumentada na seguinte passagem (P3 na Figura 2). O rendimento de vectores HDAD depende cassetes transgene. Durante a produção de vector, ambos os transgenes são expressos porque ambos os genes estão sobpromotor onipresente. Ngn3 é um factor de transcrição e BTC é um factor de crescimento, o que sugere que o factor de transcrição HDAD vector expressando o que pode influenciar a linhagem de células inibe a amplificação vector, enquanto que a hormona do crescimento expressando ajuda na replicação do vector e embalagem. Com diabetes assumindo proporções epidêmicas, novas abordagens para restaurar b célula de massa são necessários. Neste relatório, nós descrevemos métodos para aproveitar as vantagens de vetores HDAD para efetuar a transferência de genes de ilhota linhagem definir fator de transcrição, Ngn3 juntamente com o fator de crescimento ilhota, betacelulina para induzir neogênese ilhota em regiões periportal do fígado. Para avaliar a eficácia do presente, é importante escolher os ratos com hiperglicemia estável e assegurar que os controlos apropriados são sempre incluídas. Para estas experiências de transferência de genes, o vector vazio trataram ratos diabéticos deve sempre ser utilizado. Além disso, utilizando-HDAD Ngn3 e HDAD-Btc tratadas individualmente diabética mice serve para testar a contribuição desses dois genes em ilhota neogênese. Como os nossos dados demonstram que Ngn3 por si só é suficiente para induzir a ilhota neogénese, mas a adição do factor de crescimento, BTC, serve para aumentar a resposta levando à indução de ilhota neogénese robusto. Também é importante para testar se o vector de expressão é de facto conseguida no tecido alvo, o fígado e também para demonstrar que a insulina testados no plasma de ratinhos tratados não é proveniente de ilhotas residuais no pâncreas, demonstrando a ausência de pâncreas ilhotas nos ratos diabéticos. Em resumo, a vantagem de o sistema HDAD vector para a transferência de gene é a sua capacidade de clonagem elevada, a transdução eficiente e da expressão do gene de longa duração no fígado com toxicidade crónica mínimo, assim como a sua natureza de não integração do genoma do vector no hospedeiro cromossomo. As limitações principais são os passos complexos envolvidos na sua produção e do seuaplicação in vivo é essencialmente limitada ao fígado, sendo o mais popular Ad serotipo 5. Islet neogénese podem ser induzidas a restaurar completamente a insulina no plasma e de tolerância à glucose em ratos diabéticos através da indução de neogénese ilhota no fígado, por transferência de genes de factor de transcrição ilhota linhagem definidora, Ngn3 juntamente com o factor de crescimento das ilhotas, betacelulina. Neste relatório, nós apresentamos o protocolo ideal para gerar alta qualidade HDAD-Ngn3 e HDAD-BTC, e demonstrar técnicas para induzir e avaliar neogênese ilhota nos fígados dos camundongos diabéticos para reverter a hiperglicemia. Nota de rodapé: Os vectores virais e as linhas de células descritas aqui estão disponíveis a partir do núcleo Vector Laboratory Produção, Diabetes Research Center, Baylor College of Medicine ( <a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a> ). Alguns kits comerciais também estão disponíveis para a geração de vírus (por exemplo, HDAD Microbix biosystems Inc.).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> ProFectionR kit Transfecção mamíferos </td><td> Promega </td><td> E1200 </td></tr><tr><td> Kit Blood &amp; Tissue Dneasy (50) </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> Perfecta SYBR Green Supermix, ROX </td><td> Quanta Biociências </td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td> Deoxicolato de sódio </td><td> Sigma </td><td> D6750-25G </td></tr><tr><td> MEM em pó </td><td> Invitrogen </td><td> 61100087 </td></tr><tr><td> Estreptomicina penicilina </td><td> Sigma </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Higromicina B </td><td> Sigma </td><td> H0654-1G </td></tr><tr&gt; <td> MEM ÁGUIA Joklik </td><td> Sigma </td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> Rnase </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNase I, grau II </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Estreptozocina </td><td> Sigma </td><td> s0130 </td></tr><tr><td> Vidro giratório frascos </td><td> Corning </td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td> Vidro giratório frascos </td><td> Corning </td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> Deslize A-lyzer Casset </td><td> PIERCE CH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td> Tubo optiseal poli allomer, 11,2 ml </td><td> Beckman Coulter </td><td> 362181 </td></tr><tr><td> Cloreto de césio 1 kg </td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman LE-80K </td><td> Beckman Coulter </td><td> Ultracentrífuga LE-80K ideal </td></tr><tr><td> Filtrar </td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td> centrifugar m tubo de 500l </td><td> Corning </td><td> 431123 </td></tr><tr><td> tailveiner limitador </td><td> Braintree científica, INC </td><td> tv-150 </td></tr><tr><td> A insulina, Rato ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> microvette CB300 </td><td> Sarstedt </td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td></tr><tr><td> Rato peptídeo C ELISA Kit </td><td> Wako Pure Chemical Industries, Ltd </td><td> # 631-07231 </td></tr><tr><td> cobaia anticorpo anti-insulina </td><td> Abcam </td><td> ab7842 </td></tr><tr><td> anticorpo de cabra anti-Pdx1 </td><td> presente do Dr. Christopher Wright </td><td></td></tr><tr><td> rato anti Ngn3 anticorpo </td><td> Consórcio de Biologia das células beta, Univ. da Pensilvânia </td><td> AB2013 </td></tr><tr><td> rato anti Nkx6.1 anticorpo </td><td> Consórcio de Biologia das células beta, Univ. de Pennsylvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td> anticorpo anti-betacelulina </td><td> Cell Sciences </td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT (TGP) SET Reagente de Cor. </td><td> Teco Diagnóstico </td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> AST / (TGO), Cor conjunto de reagentes Endpoint </td><td> Teco Diagnóstico </td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Reagentes e equipamentos específicos.

neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer

A diabetes tipo 1 é causada pela destruição mediada por células T auto-imune das células produtoras de insulina no pâncreas. Até agora, a reposição de insulina é ainda a terapêutica maior, porque transplante de ilhotas foi limitada pela disponibilidade de dadores e pela necessidade de imunossupressão a longo prazo. Induzida por ilhota neogénese por transferência de genes de Neuogenin3 (Ngn3), a linhagem de ilhotas de definição factor de transcrição específico e betacelulina (BTC), um factor de crescimento de ilhotas tem o potencial de curar a diabetes do tipo 1. Vectores adenovirais (Ads) são vectores de transferência de genes altamente eficiente, no entanto, os anúncios geração iniciais têm várias desvantagens para a utilização in vivo. Ajudante de dependentes de Anúncios (HDAds) são os anúncios mais avançadas que foram desenvolvidos para melhorar o perfil de segurança da primeira geração de anúncios e para prolongar transgene expressão 1. Eles não têm a toxicidade crônica porque faltam seqüências virais codificação 2-5 e manter somente o anúncio cis elements necessárias para a replicação do vector e embalagem. Isto permite a clonagem de genes de até 36 kb. Neste protocolo, descrevemos o método para gerar HDAD-Ngn3 e HDAD-BTC e entregar esses vetores em ratos STZ-induzidos diabéticos. Os nossos resultados mostram que a co-injecção de HDAD-Ngn3 e &quot;ilhéus&quot; neo-HDAD Btc induz no fígado e inverte a hiperglicemia em ratos diabéticos.

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Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Nós descrevemos a formação de neo-hepática ilhota em STZ (estreptozotocina) induzida ratos diabéticos por transferência de genes de Neurogenin3 (Ngn3) e betacelulina (BTC), utilizando ajudante dependente do vector adenoviral (HDAD) e reversão da hiperglicemia. O nosso método tem vantagens do ajudante dependente de vectores adenovirais com a sua grande eficácia na transdução in vivo e a expressão do gene de longa duração.

Neo-Islet Formação em fígado de ratos diabéticos por Helper dependente de Transferência de Gene adenoviral Vector Mediada

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

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