Bu çalışma NIH hibe ile desteklenmiştir: R03 DK089061-01 (VKY); NIH: K08 DK068391 (VKY), Diyabet ve Endokrin Araştırma Merkezi-(DERC - P30DK079638) Baylor Tıp Koleji&#39;nde, bir Pilot &amp; Fizibilite hibe DERC (VKY); Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı: JDRF Ödülü # 5-2006-134 (VKY).

<ol>
	<li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+helper-dependent+adenovirus+vector+system:+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal.">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li><li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector.">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li><li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li><li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor.">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li><li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li><li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-efficiency+Cre/loxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors.">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li><li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production.">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li><li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors.">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes.">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice.">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

HDAds erken nesil Reklamlar zayıflığı aşmak ve gen tedavisi uygulaması için koşum geliştirilmiştir. Ancak, teknik sorunlar devam etmektedir. Örneğin, HDAd HDAd paketleme ve vektör amplifikasyonu için HV erken nesil İlanlar kadar verimli değildir gerektirir. HV ilk jenerasyon İlan ve HV uzlaşma HDAd etkililiğini herhangi bir kirlenme olduğunu. Bu nedenle, yüksek verimli transfeksiyon ve her seri geçiş için en uygun koşulları önemlidir. Vektör üretimi için bir başka önemli parametre doğrudan doğruya süspansiyon hücreleri için aşı malzemesi olarak kullanılan 5 sonraki geçiş için kullanılması gereken pasaj (P1-P4) &#39;dir. Deneyim için, en iyi sonuçlar HDAd vektör oran önemli ölçüde aşağıdaki pasaj (Şekil 2&#39;de P3) artmış edildiği geçit ile elde edilmiştir. HDAd vektörleri verim transgen kaseti bağlıdır. Her iki genin altında olduğu için vektör üretimi sırasında, hem transgenlerin ifade edilmiştirher yerde organizatörü. Ngn3 bir transkripsiyon faktörüdür ve BTC olduğunu ifade büyüme hormonu vektör çoğaltma ve paketleme yardımcı olur ise hücre soyu vektör amplifikasyonu inhibe etkileyebileceğini HDAd vektör ifade transkripsiyon faktörü anlaşılacağı bir büyüme faktörüdür. Diyabet salgın boyutlarına varsayarak ile, b-hücre kitlesinin geri yeni yaklaşımlara ihtiyaç vardır. Bu yazıda, adacık büyüme faktörü ile birlikte adacık soy tanımlayan transkripsiyon faktörü, Ngn3 gen transferi etkileyecek HDAd vektörlerin avantajlarından yararlanmak için yöntemler tarif betacellulin karaciğerin periportal bölgelerinde adacık neogenesis ikna etmek. Bu etkinliğini değerlendirmek için, stabil hiperglisemi ile fare seçilir ve uygun kontrollerin her zaman dahil olduğundan emin olmak için önemlidir. Bu gen transferi denemeleri için, boş bir vektör diyabetik farelerde daima kullanılmalıdır tedavi. Buna ek olarak, HDAd-Ngn3 ve HDAd-BTC kullanılarak ayrı ayrı diyabetik mi muamelece adacık neogenesis olarak bu iki genin tek katkı test etmek için kullanılır. Bizim veri yalnız Ngn3 adacık neogenesis ikna etmek için yeterlidir, ancak büyüme faktörü, BTC, ilavesi adacık neogenesis sağlam indüksiyon giden yanıtı artırmak için hizmet verdiğini gösterir gibi. Bu vektör ifade gerçekten hedef doku, karaciğer elde edilir ve aynı zamanda tedavi edilen farelerde plazma içinde test pankreatik insülin yokluğunda göstererek, pankreas adacıklarının kalıntı gelen olmadığını göstermek için test etmek için de önemlidir diyabetik farelerde adacık. Özet olarak, gen aktarımı için HDAd-vektör sisteminin avantajı, ev sahibi içine minimum toksisite kronik hem de vektör olmayan genom entegrasyon doğası ile karaciğerde yüksek bir klonlama kapasitesine, verimli transdüksiyonu ile uzun süreli bir gen ekspresyonu yatmaktadır kromozom. Birincil sınırlamalar üretimini ve yer karmaşık adımlar vardır onunİn vivo uygulama, öncelikle en popüler Reklam serotip 5 ile karaciğer ile sınırlıdır. Islet neogenesis tam Adacık büyüme faktörü, betacellulin birlikte adacık soy belirleyici transkripsiyon faktörü, Ngn3 gen transferi yoluyla karaciğerde adacık neogenesis uyararak plazma insülin ve diyabetik farelerde glukoz toleransı geri indüklenen olabilir. Bu yazıda, yüksek kaliteli HDAd-Ngn3 ve HDAd-BTC oluşturmak için uygun protokol göstermek ve hiperglisemi ters diyabetik farelerin karaciğerinde adacık neogenesis teşvik ve değerlendirmek tekniklerini göstermektedir. Dipnot: viral vektörler ve hücre hatları burada açıklanan Vector Üretim Çekirdek Laboratuvarı, Diyabet Araştırma Merkezi, Baylor College of Medicine (edinilebilir <a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a> ). Bazı ticari kitleri HDAd virüsler (örn. Microbix biosyst üretmek için de kullanılabilirems Inc).

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> ProFectionR Memeli Transfeksiyon kiti </td><td> Promega </td><td> E1200 </td></tr><tr><td> DNeasy Kan ve Doku Seti (50) </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> Perfecta SYBR Green Supermix, ROX </td><td> Quanta Biosciences </td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td> Sodyum deoksikolatın </td><td> Sigma </td><td> D6750-25G </td></tr><tr><td> MEM tozu </td><td> Invitrogen </td><td> 61100087 </td></tr><tr><td> Penisilin Streptomisin </td><td> Sigma </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biyolojik </td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Higromisin B </td><td> Sigma </td><td> H0654-1G </td></tr><tr&gt; <td> MEM EAGLE JOKLIK </td><td> Sigma </td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> Rnaz </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNaz I, evre II </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Batlarda </td><td> Sigma </td><td> s0130 </td></tr><tr><td> Cam spinner matara </td><td> Corning </td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td> Cam spinner matara </td><td> Corning </td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> A-lyzer Casset kaydırarak </td><td> PIERCE CH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td> Tüp optiseal poli allomer, 11.2 ml </td><td> Beckman Coulter </td><td> 362181 </td></tr><tr><td> Sezyum klorid 1 kg </td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman LE-80K </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optimal LE-80K ultrasantrifüjdeki </td></tr><tr><td> Filtre </td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td> tüp 500 m santrifüjl </td><td> Corning </td><td> 431123 </td></tr><tr><td> tailveiner süzgeç </td><td> Braintree bilimsel, INC </td><td> tv-150 </td></tr><tr><td> İnsülin, Fare ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> microvette CB300 </td><td> Sarstedt </td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-glikoz </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td></tr><tr><td> Fare C-peptid ELISA Kit </td><td> Wako Pure Chemical Industries, Ltd </td><td> # 631-07231 </td></tr><tr><td> kobay anti-insülin antikoru </td><td> Abcam </td><td> ab7842 </td></tr><tr><td> keçi anti-Pdx1 antikoru </td><td> Dr Christopher Wright hediye </td><td></td></tr><tr><td> Fare anti Ngn3 antikor </td><td> Beta Hücre Biyolojisi Konsorsiyumu, Univ. Pennsylvania </td><td> AB2013 </td></tr><tr><td> Fare anti Nkx6.1 antikor </td><td> Beta Hücre Biyolojisi Konsorsiyumu, Univ. Pennsy bölgesininlvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td> Anti-betacellulin antikor </td><td> Hücre Bilimleri </td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT (SGPT) Renk Reaktif SET. </td><td> Teco Diagnostics </td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> AST / (SGOT), Renk Endpoint Reaktif Seti </td><td> Teco Diagnostics </td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Spesifik Reaktifler ve Ekipmanları.

neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer

Tip 1 diyabet pankreasın insülin üreten hücrelerin T hücre-aracılı otoimmün yıkıma neden olur. Adacık transplantasyonu donör durumuna göre ve uzun vadeli immünosupresyon ihtiyacı ile sınırlı kalmıştır, çünkü şimdiye kadar insülin yerine, hala önemli bir tedavi yöntemidir. Neuogenin3 gen transferi (Ngn3), adacık soy tanımlayan spesifik transkripsiyon faktörü ve Betacellulin (BTC) Göre İsteyerek adacık neogenesis, bir adacık büyüme faktörü tip 1 diyabet tedavisi için bir potansiyele sahiptir. Adenoviral vektörlerin (Reklamlar) yüksek verimli gen transferi vektör olmakla birlikte, erken nesil İlanlar vivo kullanımı için çeşitli dezavantajları vardır. Helper bağımlı Reklamları (HDAds) Reklamlar erken nesil güvenlik profilini artırmak ve transgen ekspresyonu 1 uzatmak için geliştirilen en gelişmiş Reklamlar vardır. Viral kodlama dizilerinin 2-5 yoksun ve yalnızca Reklam cis El korumak çünkü kronik toksisite eksikliğivektör çoğaltma ve paketleme için gerekli, anahtar kelimeleri. Bu 36 kb genlerin kadar klonlama sağlar. Bu protokol, biz HDAd-Ngn3 ve HDAd-BTC oluşturmak ve STZ ile indüklenen diyabetik farelerde içine bu vektörler sunmak için yöntem açıklanmaktadır. Bizim sonuçlarımız HDAd-Ngn3 ve karaciğerde HDAd-BTC baskılanması &#39;neo adacık&#39; co-enjeksiyon ve diyabetik farelerde hiperglisemi tersine çevirebilmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer at JoVE.com

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Biz hepatik neo-adacık STZ formasyonu (streptozotosin)-indüklenen helper bağımlı adenoviral vektör (HDAd) ve hiperglisemi ters kullanılarak gen Neurogenin3 transferi (Ngn3) ve Betacellulin (BTC) ile diyabet oluşturulan farelerde. Tarif Bizim metodumuz vivo iletimi ve uzun ömürlü gen ekspresyonu kendi yüksek verimli olan helper-bağımlı adenoviral vektörlerin avantajları alır.

Helper bağımlı adenoviral vektör-Gen Transferi ile Diyabetik Sıçanların Karaciğerinde Neo-Islet Oluşumu

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

neo-islet-formation-liver-diabetic-mice-helper-dependent-adenoviral

Research

JoVE Journal

Medicine

11.7K Görüntüleme.  Baylor College of Medicine. Biz hepatik neo-adacık STZ formasyonu (streptozotosin)-indüklenen helper bağımlı adenoviral vektör (HDAd) ve hiperglisemi ters kullanılarak gen Neurogenin3 transferi (Ngn3) ve Betacellulin (BTC) ile diyabet oluşturulan farelerde. Tarif Bizim metodumuz vivo iletimi ve uzun ömürlü gen ekspresyonu kendi yüksek verimli olan helper-bağımlı adenoviral vektörlerin avantajları alır.