Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der NIH unterstützt: R03 DK089061-01 (VKY); NIH: K08 DK068391 (VKY), die Diabetes und Endokrinologie Research Center-(DERC - P30DK079638) am Baylor College of Medicine, ein Pilot &amp; Feasibility Zuschuss aus Die DERC (VKY); Juvenile Diabetes Research Foundation: JDRF Award # 5-2006-134 (VKY).

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	<li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+helper-dependent+adenovirus+vector+system:+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal.">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li><li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector.">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li><li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li><li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor.">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li><li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia.">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li><li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-efficiency+Cre/loxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors.">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li><li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production.">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li><li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors.">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes.">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li><li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice.">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

HDAds wurden entwickelt, um die Schwächen der ersten Generation Ads zu überwinden und für gentherapeutische Anwendung nutzbar zu machen. Allerdings bleiben technische Herausforderungen. Zum Beispiel erfordert HDAd HV für HDAd Verpackungs-und Vektor-Verstärkung ist nicht so effizient wie frühe Generation Ads. HV ist eine der ersten Generation Ad und jede Verunreinigung der HV Kompromiss die Wirksamkeit der HDAd. Daher sind hocheffiziente Transfektion und optimale Bedingungen für jede serielle Passage kritisch. Ein anderer kritischer Parameter für Vektorproduktion ist, welche Passage (P1-P4) sollte für nachfolgende Passage 5, die direkt als Inokulum für Suspensionskulturen verwendet werden. Unserer Erfahrung, werden die besten Ergebnisse durch den Durchgang durch die HDAd vector Anteil drastisch in der folgenden Passage (P3 in Abbildung 2) erhöht erhalten. Die Ausbeute an HDAd Vektoren hängt Transgen-Kassetten. Während vector Produktion, werden beide Transgene geäußert, da beide Gene unter sichubiquitäre Promotor. Ngn3 ist ein Transkriptionsfaktor und Btc ist ein Wachstumsfaktor, wonach die HDAd exprimierenden Vektor Transkriptionsfaktor, beeinflussen Zellstammbaums hemmt Vektor Amplifikation während diejenige exprimieren Wachstumshormon hilft in Vektor-Replikation und Verpackung können suggeriert. Mit Diabetes vorausgesetzt epidemische Ausmaße, sind neue Ansätze zur b-Zellmasse Wiederherstellung benötigt. In diesem Bericht wir Methoden, die Vorteile der HDAd Vektoren nutzen, um Gentransfer von Insel-definierenden Linie Transkriptionsfaktor, zusammen mit der für Ngn3 islet Wachstumsfaktor bewirken beschreiben, Betacellulin Inselneogenese in periportalen Regionen der Leber zu induzieren. Um die Wirksamkeit der dies zu bewerten, ist es wichtig zu Mäusen, die mit stabilen Hyperglykämie wählen und sicherzustellen, dass geeignete Kontrollen immer enthalten sind. Aus diesem Gentransfer Experimenten behandelt Leervektor diabetischen Mäusen sollte immer genutzt werden. Darüber hinaus verwenden HDAd-Ngn3 und HDAd-Btc individuell behandelten diabetischen mice dient dazu, den individuellen Beitrag dieser beiden Gene in Inselneogenese testen. Da unsere Daten zeigen, dass Ngn3 alleine ausreicht, um Inselneogenese induzieren, aber die Zugabe des Wachstumsfaktors, BTC, dient dazu, die Reaktion, die zu robusten Induktion Inselneogenese vermehren. Es ist auch wichtig, um zu testen, daß der Vektor Expression tatsächlich in das Zielgewebe, die Leber und auch erreicht, um zu demonstrieren, dass das Insulin im Plasma behandelten Mäusen getestet wird, die nicht aus Rest-Inseln in der Bauchspeicheldrüse, durch den Nachweis der Abwesenheit von pankreatischen Inseln in den diabetischen Mäusen. Zusammengefasst liegt der Vorteil des HDAd-Vektor-System für den Gentransfer in seiner hohen Klonierungskapazität, effiziente Transduktion und langanhaltende Genexpression in der Leber mit minimalen chronische Toxizität sowie seine Art nicht Integration von Vektor-Genom in den Wirt Chromosom. Die primären Einschränkungen sind die komplexen Schritte in seiner Generation und beteiligt ihrein vivo-Anwendung ist in erster Linie auf die Leber mit den beliebtesten Ad Serotyp 5 begrenzt. Inselneogenese können induziert vollständig wiederherzustellen Plasmainsulinspiegel und Glukosetoleranz bei diabetischen Mäusen durch Induzieren Inselneogenese in der Leber durch Gentransfer von Insel-definierenden Linie Transkriptionsfaktor, zusammen mit der für Ngn3 islet Wachstumsfaktor, Betacellulin werden. In diesem Bericht zeigen wir die optimale Protokoll zu hochwertigen HDAd-Ngn3 und HDAd-Btc erzeugen, und zeigen Techniken zu induzieren und zu beurteilen Inselneogenese in der Leber der diabetischen Mäuse Hyperglykämie umzukehren. Fußnote: Die virale Vektoren und die Zelllinien hier beschriebenen sind von der Vector Produktion Core Laboratory, Diabetes Research Center, Baylor College of Medicine ( <a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a> ). Einige kommerzielle Kits sind auch zur Erzeugung HDAd Viren (zB Microbix biosyst verfügbarems Inc.).

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Mammalian Transfection Kit ProFectionR </td><td> Promega </td><td> E1200 </td></tr><tr><td> DNeasy Blood &amp; Tissue Kit (50) </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> Perfecta SYBR Green SuperMix, ROX </td><td> Quanta Biosciences </td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td> Natriumdesoxycholat </td><td> Sigma </td><td> D6750-25G </td></tr><tr><td> MEM Pulver </td><td> Invitrogen </td><td> 61100087 </td></tr><tr><td> Penicillin Streptomycin </td><td> Sigma </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Sigma </td><td> H0654-1G </td></tr><tr&gt; <td> MEM EAGLE Joklik </td><td> Sigma </td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> Rnase </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNase I, Klasse II </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Streptozocin </td><td> Sigma </td><td> s0130 </td></tr><tr><td> Glass Spinnerflaschen </td><td> Corning </td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td> Glass Spinnerflaschen </td><td> Corning </td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> Schieben A-analysator casset </td><td> PIERCE CH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td> Rohr OptiSeal Poly allomer, 11,2 ml </td><td> Beckman Coulter </td><td> 362181 </td></tr><tr><td> Cäsiumchlorid 1 kg </td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman LE-80K </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optimale LE-80K Ultrazentrifuge </td></tr><tr><td> Filtern </td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td> Zentrifugenröhrchen 500 ml </td><td> Corning </td><td> 431123 </td></tr><tr><td> tailveiner restrainer </td><td> Braintree Scientific, Inc </td><td> tv-150 </td></tr><tr><td> Insulin, Maus ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> Microvette CB300 </td><td> Sarstedt </td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td></tr><tr><td> Maus-C-Peptid-ELISA-Kit </td><td> Wako Pure Chemical Industries, Ltd </td><td> # 631-07231 </td></tr><tr><td> Meerschweinchen Anti-Insulin-Antikörper </td><td> Abcam </td><td> ab7842 </td></tr><tr><td> Ziege-Anti-Pdx1 Antikörper </td><td> Geschenk von Dr. Christopher Wright </td><td></td></tr><tr><td> Maus anti Ngn3 Antikörper </td><td> Beta Cell Biology Consortium, Univ. of Pennsylvania </td><td> AB2013 </td></tr><tr><td> Maus anti Nkx6.1 Antikörper </td><td> Beta Cell Biology Consortium, Univ. der Pennsylvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td> Anti-Betacellulin Antikörper </td><td> Cell Sciences </td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT (SGPT) Color Reagent SET. </td><td> Teco Diagnostics </td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> AST / (SGOT), Farbe Endpoint Reagent Set </td><td> Teco Diagnostics </td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Spezifische Reagenzien und Ausrüstung.

neo-islet formation in liver of diabetic mice by helper-dependent adenoviral vector-mediated gene transfer

Typ 1-Diabetes wird durch T-Zellen vermittelten autoimmune Zerstörung von Insulin-produzierenden Zellen in der Bauchspeicheldrüse. Bisher Insulinersatzbehandlung ist immer noch die große Therapie, da Inseltransplantation wurde von Donor Verfügbarkeit und durch die Notwendigkeit für Langzeitimmunsuppression beschränkt. Induced Inselneogenese durch Gentransfer von Neuogenin3 (Ngn3), der Insel Linienhalter Definition spezifischer Transkriptionsfaktor und Betacellulin (BTC) hat eine kleine Insel Wachstumsfaktor das Potenzial, Typ 1 Diabetes zu heilen. Adenovirusvektoren (Anzeigen) sind hocheffiziente Gentransfervektor, allerdings muss frühen Generation Anzeigen mehrere Nachteile zur Verwendung in vivo. Helper-abhängige Anzeigen (HDAds) sind die am weitesten fortgeschrittenen Anzeigen, die entwickelt, um das Sicherheitsprofil von frühen Generation von Anzeigen zu verbessern und Transgenexpression 1 verlängert wurden. Es fehlt ihnen an chronischen Toxizität, weil sie viralen kodierenden Sequenzen 2-5 fehlt und behalten nur Ad cis elements notwendig Vektor Replikation und Verpackung. Dies ermöglicht Klonieren von bis zu 36 kb Gene. In diesem Protokoll beschreiben wir die Methode HDAd-Ngn3 und HDAd-Btc erzeugen und diese Vektoren in STZ-induzierte diabetische Mäuse liefern. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Co-Injektion von HDAd-Ngn3 und HDAd-Btc induziert &#39;neo Inseln&#39; in der Leber und kehrt Hyperglykämie bei diabetischen Mäusen.

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Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Wir beschreiben hepatische neo-Inselzellen Formation in STZ (Streptozotocin)-induzierte diabetische Mäuse durch Gentransfer von Neurogenin3 (Ngn3) und Betacellulin (BTC) Verwendung von Helfer-abhängigen Adenovirus-Vektor (HDAd) und der Umkehrung von Hyperglykämie. Unsere Methode nutzt die Vorteile von Helfer-abhängigen Adenovirus-Vektoren mit ihren hocheffizienten in vivo Transduktion und der lang anhaltende Genexpression.

Neo-Islet Formation in Leber der diabetischen Mäuse von Helper-abhängigen Adenovirus-Vektor-vermittelten Gentransfer

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

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