Nous tenons à remercier tous les nombreux passées de premier cycle, les étudiants diplômés et postdoctoraux qui ont contribué de leur temps et d&#39;efforts à l&#39;étude de la fibrogenèse collagène dans notre laboratoire. En sciences naturelles et en génie du Canada a toujours fourni des fonds pour nos études de collagène.

REMARQUE: L&#39;eau utilisée dans tous les protocoles a une résistivité&gt; 18 MΩ.cm. 1. Les fibrilles de collagène natif <ol><li> Combinez 6 pl d&#39;eau, 20 ul de 200 mM Na 2 HPO 4 ajusté à pH 7 avec HCl et 10 pl de 400 mM de KCl dans un tube de centrifugeuse et mélanger. </li><li> Ajouter 4 pl de collagène monomère (~ 3 mg / ml dans du HCl 0,01 N) à la microtube et mélanger. La solution doit être limpide et incolore. </li><li> Placer le tube de centrifugeuse contenant le mélange réactionnel dans un bloc de chauffage qui a été pré-chauffée à 37 ° C et laissé pendant 3 à 4 heures. À ce stade, la solution doit être légèrement trouble et contiennent principalement des fibrilles de collagène natif. </li></ol> 2. Le collagène fibreux Espacement long <ol><li> Dialyser 1 ml de collagène monomère (~ 3 mg / ml dans 0,01 N HCl) en utilisant 12-14 kDa MWCO membrane contre 400 ml d&#39;eau, en changeant l&#39;eau quatre fois sur une période de 24 heures à la température ambiante. Le collag dialysemonomère en qui n&#39;est pas utilisé tout de suite peut être conservé à 4 ° C pour une utilisation ultérieure. </li><li> Mélanger 20 ul d&#39;eau, 20 pi de 3 mg / ml α1-glycoprotéine acide dans l&#39;eau et 20 ul de collagène monomère dialyse dans un tube de centrifugeuse. La solution doit être limpide et incolore. </li><li> Laisser le microtube contenant le mélange réactionnel à température ambiante pendant 30 min. À ce stade, la solution devrait être nuageux et contient des fibrilles de collagène principalement des services en français. </li></ol> 3. Segmentaire collagène Espacement long <ol><li> Mélanger 67 ul d&#39;eau, 60 pl de 100 mM de glycine-HCl à pH 3,3 et 40 ul de 10 mg / ml d&#39;ATP dans l&#39;eau dans un tube de centrifugeuse et mélanger. </li><li> Ajouter 33 ul de collagène monomère (~ 3 mg / ml dans du HCl 0,01 N) à la microtube et mélanger. La solution doit être limpide et incolore. </li><li> Laissez le microtube contenant le mélange réactionnel à la température ambiante pendant 2 heures. À ce stade, la solution apparaîtra toujours clair, mais devraitcontiennent du collagène essentiellement SLS. </li></ol> 4. Caractérisation AFM <ol><li> Cliver la surface d&#39;un morceau de mica lié à un substrat AFM en recouvrant la surface de mica avec un morceau de ruban adhésif, puis enlèvement par pelage. Vérifiez que le ruban après pour confirmer que toute une couche de mica a été coupé afin de réduire les irrégularités de la surface et de veiller à ce que l&#39;ancien échantillon est retiré si le mica est réutilisé. </li><li> Appliquer 20 ul de la solution de fibrilles de collagène au substrat de mica fraîchement clivé. Laissez-le pendant 5 min. </li><li> Doucement rincer solution de fibrilles de collagène avec de l&#39;eau. Il est conseillé de ne pas appliquer l&#39;eau directement sur le centre du substrat de mica, mais au niveau du bord et à lui permettre de s&#39;écouler à travers l&#39;échantillon. </li><li> Sécher la surface sous un léger courant d&#39;azote gazeux. Il est conseillé de diriger le jet sur le bord et non au centre du substrat de mica. </li><li> Sous un microscope optique à un grossissement de 200 ×,les échantillons de collagène natif et FLS devrait montrer des amas de fibrilles. Collagène SLS ne sera pas visible. </li><li> Les caractéristiques uniques des trois structures du collagène différentes sont observables par l&#39;AFM. En règle générale, nous fibrilles de collagène natif d&#39;image avec un AFM en mode contact intermittent avec silicium sondes AFM, tandis que FLS et de collagène SLS fibrilles nous avons généralement l&#39;image d&#39;un AFM en mode contact à l&#39;aide de nitrure de silicium sondes AFM. Nous faisons cela parce que de temps et de coût. Silicon sondes AFM sont en général plus forte que les sondes AFM en nitrure de silicium, qui les rendent particulièrement utile pour l&#39;imagerie la plus étroite structure de tarification de fibrilles de collagène natif. Toutefois, le silicium sondes AFM sont beaucoup plus sujettes à la contamination par des échantillons de collagène que les sondes AFM en nitrure de silicium et le besoin de remplacer fréquemment. Par conséquent, nous nous réservons l&#39;utilisation de sondes AFM en silicium pour la plupart des fibrilles de collagène natif d&#39;imagerie où la résolution est une nécessité plus grande et nous fonctionnons en mode contact intermittent à prolong leur durée de vie utile. </li></ol> Nous recommandons une première tranche de 100 × 100 um 2 Recherche qui devrait montrer au moins quelques constructions de collagène années. A partir de là, le zoom pour numériser des tailles de 10 × 10 um 2, puis 2 × 2 um 2 à observer la périodicité des bandes de collagène natif et FLS, ou les traits plus fins d&#39;un collagène SLS. C&#39;est aussi une bonne idée de vérifier au moins deux autres régions sur l&#39;échantillon de collagène pour vérifier que les analyses initiales sont représentatifs.

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Purifié monomère collagène est stable à un pH faible et la température et la formation de fibrilles de collagène natif consiste essentiellement à élever le pH et la température de la solution de monomère de collagène. Procédures pour la reconstitution des fibrilles de collagène bandes de monomères existent depuis plus de 50 ans. La procédure que notre laboratoire utilisés dans nos premières études avec le collagène il ya 15 ans 7 est basée sur les procédures résumées par Chapman et ses collègues en 1986 10. Les conditions de formation de fibrilles de collagène dans ce travail plus tôt étaient de 0,18 mg / ml de monomère de collagène dans Na 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 (I = 0,2, pH 7,4) à 34 ° C. L&#39;inconvénient de cette et d&#39;autres procédures que nous avons essayé, c&#39;est qu&#39;il ya toujours des fibrilles formées bagués aux côtés des fibrilles souhaitées bandes. Les nouvelles conditions sont ~ 0,3 mg / ml de collagène dans un monomère phosphate 100 mM et 100 mM de KCl à pH 7 à gauche à 37 ° C pendant 3-4 h. La procéduredure décrite ici diffère dans chaque aspect de la procédure antérieure pour faire des fibrilles de collagène natif. Mais le plus notable, nous avons doublé la force ionique en augmentant la concentration du tampon et en ajoutant 100 mM de KCl. L&#39;augmentation de la force ionique résultats en formation plus cohérente des fibrilles de collagène exclusivement baguées. D&#39;après notre expérience, les seules fois que cette procédure n&#39;a pas donné de collagène de type natif, c&#39;est quand la solution de monomère collagène était passé date recommandée par le fabricant d&#39;utilisation. Lorsque cela se produit, ce qui est observé varie de moins de fibrilles qui sont tous bagués à des fibrilles encore beaucoup observés, mais surtout sans bague. Notez que le collagène monomère a expiré ne peuvent encore souvent être utilisé avec succès pour la fabrication du collagène natif, mais quand il tombe en panne, monomère de nouveau collagène doit absolument être acheté. FLS a d&#39;abord été identifié par Highberger et al. 17 dans les préparations de collagène crédité Orekhovich et coll. 18. D&#39;autres études conduit Highberger et Schmitt à conclure qu&#39;il était glycoprotéine α1-acide qui favorise la formation de FLS 12. Nous avons par la suite en mesure de reproduire la procédure de mise collagène FLS en combinant monomère collagène disponible dans le commerce et α1-glycoprotéine acide à pH bas et lentement pour permettre le pH à augmenter de dialyse du mélange à l&#39;eau pendant 24 heures 11. Nous présentons maintenant une modification de cette procédure par la dialyse du monomère collagène contre l&#39;eau d&#39;abord et tout simplement en le combinant avec α1-glycoprotéine acide dans l&#39;eau pour former le collagène FLS. Les conditions de FLS collagène montage décrites ici sont beaucoup moins de temps. Le monomère collagène doit encore être pré-dialyse contre l&#39;eau, mais il peut être fait en vrac, puis conservés à 4 ° C de façon stable jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit utilisé. Cela donne nouvelle procédure FLS principalement fibrilles de collagène bandes. D&#39;après notre expérience, α1-glycoprotéine acideprotéine avec une faible teneur en protéines et de l&#39;eau combinée, ainsi que par la teneur en sucre plus élevée inférence, est essentielle pour réussir à faire fibrilles FLS. En général, nous vérifier auprès du fabricant que le lot glycoprotéine α1-acide que nous utilisons a une teneur en protéines combiné% et de l&#39;eau de 82 ou moins. Et comme la procédure pour la synthèse du collagène natif, monomère collagène qui est trop vieux peut également entraîner l&#39;échec à produire du collagène FLS. En outre, la pureté de l&#39;eau utilisée pour la dialyse est essentiel dans cette procédure. Par exemple, la dialyse de monomère collagène contre, même ~ 8 MΩ.cm plutôt que de l&#39;eau&gt; 18 résultats MΩ.cm dans une solution de collagène qui ne sera pas former le collagène FLS. Parmi les trois types de fibrilles de collagène, la plus facile à faire est le collagène SLS. La première préparation de SLS a été décrit par Schmitt et ses collègues 15. Nous avons publié une adaptation de cette procédure il ya 12 ans pour la fabrication de collagène à l&#39;aide SLS coll disponible dans le commerceagen 14. La procédure entraîne simplement la combinaison de 2 mg / ml ATP et 0,5 mg / ml de collagène monomère à 0,05% (v / v) d&#39;acide acétique à pH 3,5 et en laissant le mélange à température ambiante pendant une nuit. Dans notre expérience, l&#39;aspect critique de l&#39;ensemble SLS qui doit être contrôlé est le pH de la solution réactionnelle. SLS assemblés dans des conditions plus basiques (pH ~ 3.6-3.9) se traduit par des amas de cristallites agrégés. Des conditions plus acides (pH ~ 2.9 à 3.2) se traduit par plus minces, plus cristallites séparés que ceux assemblés dans les conditions idéales de pH 3.3 à 3.5. PH de réaction en dehors de cette plage (&lt;2,8 et&gt; 4) ne rapportent aucun collagène SLS. Dans le passé, on a ajusté le pH du mélange réactionnel par addition d&#39;acide acétique. Pour simplifier la procédure encore plus loin, dans ce manuscrit, nous avons introduit un tampon glycine-HCl pour contrôler le pH. Les trois structures différentes de collagène formés à partir des protocoles décrits ci-dessus ont un caractèrecaractéristiques réalistes qui ne peut être perçue que par des instruments capables d&#39;une résolution nanométrique. Le collagène natif et FLS sont caractérisées par des bandes périodicités de ~ 67 nm et ~ 270 nm. La dimension la plus longue de collagène SLS est juste ~ 360 nm. Nous avons décrit précisément comment nous utilisons un AFM pour caractériser les trois structures du collagène différents. Cependant, toute exploitation AFM en contact ou en mode contact intermittent avec une sonde AFM ayant un rayon &lt;10 nm devrait également être en mesure à l&#39;image de ces structures de collagène. En outre, la microscopie électronique peut être et a été utilisée pour caractériser ces structures de collagène 19. Le principal avantage de ces procédures est qu&#39;elles produisent principalement du collagène souhaité construire. La seule autre forme de collagène qui se trouve dans ces réactions est le monomère de départ, ce qui est souvent visible en arrière-plan des images AFM. Dans le cas de collagène natif et FLS, ils peuvent être facilement séparé de la majeure partie du déraimonomère DECT par centrifugation répétée et le lavage de la maternelle résultant ou FLS collagène granulés avec de l&#39;eau. Nous avons présenté des procédures simples et fiables pour faire des indigènes, FLS et de collagène SLS grâce aux fonctionnalités avancées, disponibles dans le commerce des matières premières. Le monomère collagène utilisé dans l&#39;ensemble de ces procédures est disponible dans le commerce sous une forme purifiée. α1-glycoprotéine acide et l&#39;ATP sont également tous deux disponibles dans le commerce.

Le collagène est une classe de protéines structurelles qui ont une structure en triple hélice formée de trois chaînes polypeptidiques. Ces monomères triple hélice encore monter d&#39;une manière hiérarchique pour former des structures plus en plus grands. Il existe au moins 28 types de collagène génétiquement différents qui ont été identifiés 1. Ensemble, collagènes représentent 30% des protéines totales chez les animaux, avec la comptabilité de type I forme prédominante pour un maximum de 90% de tous les 2 protéines de collagène. Collagène de type I se trouve que les structures fibrillous dans la peau, des ligaments, des tendons et des os. Microscope à force atomique (AFM) et microscopie électronique (EM) des images de type I fibres de collagène natif en général montrent des bandes avec une période caractéristique de ~ 67 nm (souvent appelé D-banding) 3-5. Type I monomère collagène est une hétérotrimère triple hélice constituée de deux α1 identiques (I) et une chaîne α2 (I) de la chaîne, chaque plus d&#39;unmille acides aminés de long. Elle est longue et mince avec des dimensions de 300 nm de longueur et 1,4 nm de diamètre. Type I monomère collagène peut être facilement obtenu en décomposant naturellement formées structures d&#39;ordre supérieur 6. Nous 7 et de nombreux autres 8-10 ont montré que ces blocs de construction monomères solubles peuvent alors être utilisées pour reconstituer D-bandes fibrilles in vitro (figure 1). En plus des fibrilles de collagène natif, deux autres structures du collagène ordre supérieur ont été trouvés pour former in vitro en utilisant le bloc de monomère même bâtiment. Les deux structures sont fibreuses espacement long (FLS) et segmentaire espacement long (SLS) collagène (figure 1). FLS collagène est une construction fibrillous comme le collagène natif, mais est caractérisée par une plus grande périodicité des bandes de collagène natif 11. In vitro, le collagène FLS se forme lorsque le monomère collagène est combiné avec α1-acide glycoprotéine <sup&gt; 12. FLS collagène a été observée in vivo, ainsi, bien que rarement 13. SLS collagène est décrit comme cristallites parce que les monomères sont alignés dans le registre comme dans un réseau cristallin 14. SLS collagène se forme lorsque le monomère collagène est combiné avec l&#39;adénosine triphosphate (ATP) 15. Naturelle de collagène SLS a été observée dans le milieu de culture des fibroblastes mais pas dans les échantillons de tissus extraits, probablement en raison de sa petite taille et l&#39;absence de distinguer les caractéristiques topographiques 16. L&#39;objectif de cette revue est de présenter des procédures détaillées pour la fabrication de fibrilles de collagène naturel que FLS et de collagène ainsi SLS que même les chercheurs les plus inexpérimentés peuvent se reproduire. En utilisant des matériaux de pointe disponibles dans le commerce à partir, nous avons essayé de rendre les protocoles aussi simples que possible et toujours les faire travailler de manière fiable. Nous détaillons également comment utiliser un AFM pour caractériser la structure du collagène différentes qui sont faites. Ce travail sera bénéfique pour les chercheurs qui veulent étudier un ou plusieurs de ces structures supérieures de collagène de commande et / ou les utiliser comme précurseurs dans d&#39;autres applications, mais ne disposent pas actuellement de l&#39;expertise ou tout simplement ne veulent pas travailler avec des échantillons de tissus.

<table border="1"><tbody><tr><td> Matériel / réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Monomère de type collagène I (~ 3 mg / ml dans du HCl 0,01 N) </td><td> Inamed Avancée Biomatrix </td><td> 5409 5005-B </td><td> Lot 1261443 (2,9 mg / ml, pH 2,1) Lot 1629346 (3,2 mg / ml, pH 2,1) Lot 6006 (3,2 mg / ml, pH 2,1) </td></tr><tr><td> ATP </td><td> Biochimiques de recherche internationaux </td><td> A-141 </td><td> Lot FBJ-1194A </td></tr><tr><td> α1-glycoprotéine acide à partir de plasma bovin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3643 </td><td> Lot 051K7440 (89,8%) Lot 011K7410 (82%) Lot 065K7405 (71,2%) Lot 063K7495 (71,9%) Lot 117K7535 (75,9%) (Teneur en eau des protéines +) </td></tr><tr><td> a1-acide glycoprotein de plasma humain </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9885 </td><td> Lot 128H7606 (70,9%) Lot 049K7565V (68%) (Teneur en eau des protéines +) </td></tr><tr><td> mica </td><td> Ted Pella </td><td> 53 </td><td></td></tr><tr><td> Pointprobe - Silicon SPM-Sensor </td><td> Nanomonde </td><td> NHC </td><td> Silicon AFM sonde que nous utilisons pour le mode contact intermittent </td></tr><tr><td> Conseils Nanoprobe Veeco </td><td> Veeco (Maintenant Bruker sondes AFM) </td><td> NP-S </td><td> Le nitrure de silicium AFM sonde que nous utilisons pour le mode de contact </td></tr></tbody></table>

in vitro synthesis of native, fibrous long spacing and segmental long spacing collagen

Fibrilles de collagène sont présentes dans la matrice extracellulaire de tissus animaux pour fournir des échafaudages de construction et de résistance mécanique. Ces fibrilles de collagène natif ont une périodicité caractéristique des bandes de ~ 67 nm et sont formés in vivo à travers l&#39;ensemble hiérarchique des monomères de collagène de type I, qui sont 300 nm et une longueur de 1,4 nm de diamètre. In vitro, en faisant varier les conditions dans lesquelles l&#39; blocs de construction monomères sont exposés, allant des structures uniques dans des échelles de longueur allant jusqu&#39;à 50 microns peuvent être construits, y compris non seulement les fibrilles de type indigène, mais aussi l&#39;espacement fibreux longue et segmentaire collagène espacement longtemps. Ici, nous présentons les procédures pour former les trois structures différentes de collagène à partir d&#39;un monomère collagène disponible dans le commerce commun. En utilisant les protocoles que nous et d&#39;autres ont publié dans le passé pour faire de ces trois types conduisent généralement à des mélanges de structures. En particulier, les fibrilles non bagués étaient généralement found lors de collagène natif, et des fibrilles indigènes étaient souvent présents lors de collagène fibreux espacement longtemps. Ces nouvelles procédures ont l&#39;avantage de produire du collagène de type désiré fibrilles presque exclusivement. La formation des structures désirées est vérifiée par imagerie à l&#39;aide d&#39;un microscope à force atomique.

Le collagène natif Le mélange réactionnel de ~ 0,3 collagène monomère mg / ml dans du phosphate 100 mM et 100 mM de KCl à pH 7 à gauche à 37 ° C pendant 3-4 heures permettra d&#39;obtenir une solution contenant des fibrilles de collagène de type natif avec claire ~ 67 nm D-bandes, sans fibrilles non bagués. Sous un microscope optique à un grossissement de 200 ×, des touffes de plusieurs fibrilles peuvent normalement être vu sur le substrat de mica en particulier lorsqu&#39;il est vu par contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) Microscopie (figure 2). Dans un échantillon typique, de 100 × 100 um aléatoire 2 Recherche par AFM se montrent habituellement au moins un peu de fibrilles qui sont microns 5-50 longues (figures 3a-c). Individuelle, séparées par des fibrilles de collagène peut être facilement identifié à ce stade. Avec un 512 × 512 pixels balayage de l&#39;image 2, le zoom dans une taille de 10 × 10 um balayage 2 montre que tous les fibrilles sont bagués (figures 3d-f </strong&gt;). Afin de mesurer avec précision la périodicité des bandes, il est préférable de zoomer sur une 2 × 2 format de numérisation um 2 (figures 3g-i). Cerclage périodicité peut être déterminée simplement en mesurant la moyenne et la distance longitudinale entre plusieurs pics ou vallées. Par ailleurs, si le logiciel AFM permet, une transformation de Fourier unidimensionnelle transformer le long d&#39;une section longitudinale peut également être utilisé. Figure 4 montre une image AFM d&#39;une hauteur de fibrilles et un correspondant en coupe longitudinale. FLS collagène Le mélange réactionnel de 1 mg / ml μ1-glycoprotéine acide et ~ 1 monomère collagène mg / ml dans l&#39;eau laissée à température ambiante pendant 30 min donnera une solution de fibrilles de collagène FLS. Des amas de fibrilles, similaires à ce qui est observé dans le cas du collagène natif, on peut facilement voir sur le substrat de mica sous un microscope optique à 200 m ×agnification. Dans un échantillon typique, un échantillon aléatoire de 100 × 100 um 2 Recherche par AFM se montrent habituellement au moins un peu de fibrilles. Avec un 512 × 512 pixels 2 Taille balayage de l&#39;image, la périodicité des bandes peut être mesurée par un zoom sur un 10 × 10 um 2 Recherche (figure 5a) ou plus précisément avec une 5c 2 × 2 um 2 Recherche (figure 5b). Figure montre une coupe longitudinale d&#39;une fibrille de FLS. SLS collagène Le mélange réactionnel de 2 mg / ml ATP et ~ 0,5 mg / ml de collagène monomère dans 100 mM de glycine-HCl à pH 3,3 tampon laissé à température ambiante pendant 2 h va donner une solution de collagène SLS. En règle générale, les cristallites SLS ne sera pas visible au microscope optique. Un AFM est nécessaire pour confirmer la présence de cristallites SLS. Dans un échantillon typique, un échantillon aléatoire de 100 × 100 um 2 Recherche par AFM se montrent habituellement un grand nombrepoints. Zoomer dans un 10 × 10 um 2 Recherche se montrent habituellement plusieurs cristallites SLS (Figure 6a). Et un 2 × 2 um 2 Recherche (figure 6b) montre la structure fine d&#39;un cristallite SLS. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig1.jpg" /> Figure 1. Les trois formes de structure différente de fibrilles de collagène que l&#39;on peut former in vitro à partir de monomères de collagène. Images AFM montrant monomère collagène et les trois plus élevés structures du collagène ordre tout à l&#39;échelle même taille (2 × 2 um 2). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig2.jpg" /> Figure 2. D&#39;image numérique à ~ 200 grossissement au microscope optique DIC de fibrilles de collagène natif de mica (a) intact et (b) à seuil et aiguisée to mettre en évidence des fibrilles. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig3.jpg" /> Figure 3. Images AFM de fibrilles de collagène natif sur le mica. Intermittents en mode de contact AFM images d&#39;amplitude sont présentés. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig4.jpg" /> Figure 4. (A) 0,5 × 1 um 2 Mode de contact intermittent hauteur AFM image (échelle verticale = 100 nm) et (b) en coupe longitudinale d&#39;une fibrille collagène natif. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig5.jpg" /> Figure 5. Images AFM de fibrilles de collagène FLS sur le mica. (A) 10 × 10 um 2 contact mode image déviation AFM, (b) 2 × 2 um 2 contact mode image déviation AFM et (c) longitudinalecoupe d&#39;une fibrille collagène FLS. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig6.jpg" /> Figure 6. Images AFM de collagène SLS sur le mica. Intermittents en mode de contact AFM images d&#39;amplitude sont présentés.

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In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Des procédures simples et reproductibles sont décrits pour la fabrication de collagène trois ensembles structurellement distinctes à partir d&#39;un type commun disponible dans le commerce monomère collagène I. Type natif, fibreux espacement long ou segmentaire collagène espacement de temps peut être construit en faisant varier les conditions dans lesquelles les 300 nm de long et 1,4 nm de diamètre bâtiment monomère bloc est exposé.

En synthèse in vitro de la maternelle, de l&#39;espacement de longue fibreux et segmentaire collagène Espacement long

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

13.6K vues.  University of Toronto. Des procédures simples et reproductibles sont décrits pour la fabrication de collagène trois ensembles structurellement distinctes à partir d'un type commun disponible dans le commerce monomère collagène I. Type natif, fibreux espacement long ou segmentaire collagène espacement de temps peut être construit en faisant varier les conditions dans lesquelles les 300 nm de long et 1,4 nm de diamètre bâtiment monomère bloc est exposé.

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Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery under pulsatile deformations. The goal of this study was to mimic the structure of native artery by fabricating a multi-layered electrospun conduit composed of poly(caprolactone) (PCL) with the addition of elastin and collagen with blends of 45-45-10, 55-35-10, and 65-25-10 PCL-ELAS-COL to demonstrate mechanical properties indicative of native arterial tissue, while remaining conducive to tissue regeneration. Whole grafts and individual layers were analyzed using uniaxial tensile testing, dynamic compliance, suture retention, and burst strength. Compliance results revealed that changes to the middle/medial layer changed overall graft behavior with whole graft compliance values ranging from 0.8 - 2.8 % / 100 mmHg, while uniaxial results demonstrated an average modulus range of 2.0 - 11.8 MPa. Both modulus and compliance data displayed values within the range of native artery. Mathematical modeling was implemented to show how changes in layer stiffness affect the overall circumferential wall stress, and as a design aid to achieve the best mechanical combination of materials. Overall, the results indicated that a graft can be designed to mimic a tri-layered structure by altering layer properties.

The aim of this study was to mimic the native three layered architecture of the arterial wall. To accomplish this, electrospinning was employed with the use of a 3-1 (input-output) nozzle and blends of polycaprolactone, elastin, and collagen.

Tri-couches électrofilage pour imiter l&#39;architecture native artérielle à l&#39;aide polycaprolactone, l&#39;élastine et du collagène: une étude préliminaire

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Recherche

Bio-ingénierie

A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12. Although tobacco tars and related products in the particle phase of cigarette smoke are major causes of carcinogenic and mutagenic related diseases, cigarette smoke contains significant amounts of free radicals that are also considered as an important group of carcinogens9,10. Free radicals attack cell constituents by damaging protein structure, lipids and DNA sequences and increase the risks of developing various types of cancers. Inhaled radicals produce adducts that contribute to many of the negative health effects of tobacco smoke in the lung3. Studies have been conducted to reduce free radicals in cigarette smoke to decrease risks of the smoking-induced damage. It has been reported that haemoglobin and heme-containing compounds could partially scavenge nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke4. A 'bio-filter' consisted of haemoglobin and activated carbon was used to scavenge the free radicals and to remove up to 90% of the free radicals from cigarette smoke14. However, due to the cost-ineffectiveness, it has not been successfully commercialized. Another study showed good scavenging efficiency of shikonin, a component of Chinese herbal medicine8. In the present study, we report a protocol for introducing common natural antioxidant extracts into the cigarette filter for scavenging gas phase free radicals in cigarette smoke and measurement of the scavenge effect on gas phase free radicals in mainstream cigarette smoke (MCS) using spin-trapping Electron Spin Resonance (ESR) Spectroscopy1,2,14. We showed high scavenging capacity of lycopene and grape seed extract which could point to their future application in cigarette filters. An important advantage of these prospective scavengers is that they can be obtained in large quantities from byproducts of tomato or wine industry respectively11,13

Spin-trapping ESR spectroscopy was used to study the effect of plant antioxidants lycopene, pycnogenol and grape seed extract on scavenging gas-phase free radicals in cigarette smoke.

Un protocole pour la détection et de nettoyage en phase gazeuse des radicaux libres dans la fumée de cigarette Mainstream

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12.  ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a high resolution X-ray microscope, thus enabling visualization of internal structural elements under simulated physiological loads and wet conditions. Experimental specimens will include intact bone-periodontal ligament (PDL)-tooth fibrous joints. Results will illustrate three important features of the protocol as they can be applied to organ level biomechanics: 1) reactionary force vs. displacement: tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics: geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. from concentric to eccentric loads. Efficacy of the proposed protocol will be evaluated by coupling mechanical testing readouts to 3D morphometrics and overall biomechanics of the joint. In addition, this technique will emphasize on the need to equilibrate experimental conditions, specifically reactionary loads prior to acquiring tomograms of fibrous joints. It should be noted that the proposed protocol is limited to testing specimens under ex vivo conditions, and that use of contrast agents to visualize soft tissue mechanical response could lead to erroneous conclusions about tissue and organ-level biomechanics.

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In this study, the use of an in situ loading device coupled with micro-X-ray computed tomography for fibrous joint biomechanics will be discussed. Experimental readouts identifiable with an overall change in joint biomechanics will include: 1) reactionary force vs. displacement, i.e. tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics, i.e.&#160;geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. concentric or eccentric loads.

In situ à la compression de chargement et d&#39;imagerie non invasive corrélative de l&#39;os-ligament parodontal-dent Fort commune

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue function during development and organ homeostasis. It does so by acting via biochemical, biomechanical, and biophysical signaling pathways, such as through the release of bioactive ECM protein fragments, regulating tissue tension, and providing pathways for cell migration. The extracellular matrix of the tumor microenvironment undergoes substantial remodeling, characterized by the degradation, deposition and organization of fibrillar and non-fibrillar matrix proteins. Stromal stiffening of the tumor microenvironment can promote tumor growth and invasion, and cause remodeling of blood and lymphatic vessels. Live imaging of matrix proteins, however, to this point is limited to fibrillar collagens that can be detected by second harmonic generation using multi-photon microscopy, leaving the majority of matrix components largely invisible. Here we describe procedures for tumor inoculation in the thin dorsal ear skin, immunolabeling of extracellular matrix proteins and intravital imaging of the exposed tissue in live mice using epifluorescence and two-photon microscopy. Our intravital imaging method allows for the direct detection of both fibrillar and non-fibrillar matrix proteins in the context of a growing dermal tumor. We show examples of vessel remodeling caused by local matrix contraction. We also found that fibrillar matrix of the tumor detected with the second harmonic generation is spatially distinct from newly deposited matrix components such as tenascin C. We also showed long-term (12 hours) imaging of T-cell interaction with tumor cells and tumor cells migration along the collagen IV of basement membrane. Taken together, this method uniquely allows for the simultaneous detection of tumor cells, their physical microenvironment and the endogenous tissue immune response over time, which may provide important insights into the mechanisms underlying tumor progression and ultimate success or resistance to therapy.

The extracellular matrix undergoes substantial remodeling during wound healing, inflammation and tumorigenesis. We present a novel intravital immunofluorescence microscopy approach to visualize the dynamics of fibrillar as well as mesh-like matrix components with high spatial and temporal resolution using epifluorescence or two-photon microscopy.

À long terme intravitale immunofluorescence imagerie de tissus composants matriciels avec épifluorescence et deux microscopie biphotonique

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which facilitate the functional assessment of the seeded cells. To that end, microscale cantilever technology offers a platform with which to measure the contractile functionality of a range of cell types, including skeletal, cardiac, and smooth muscle cells, through assessment of contraction induced substrate bending. Application of multiplexed cantilever arrays provides the means to develop moderate to high-throughput protocols for assessing drug efficacy and toxicity, disease phenotype and progression, as well as neuromuscular and other cell-cell interactions. This manuscript provides the details for fabricating reliable cantilever arrays for this purpose, and the methods required to successfully culture cells on these surfaces. Further description is provided on the steps necessary to perform functional analysis of contractile cell types maintained on such arrays using a novel laser and photo-detector system. The representative data provided highlights the precision and reproducible nature of the analysis of contractile function possible using this system, as well as the wide range of studies to which such technology can be applied. Successful widespread adoption of this system could provide investigators with the means to perform rapid, low cost functional studies in vitro, leading to more accurate predictions of tissue performance, disease development and response to novel therapeutic treatment.

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

This protocol describes the use of microscale silicon cantilevers as pliable culture surfaces for measuring the contractility of muscle cells in vitro. Cellular contraction causes cantilever bending, which can be measured, recorded, and converted into readouts of force, providing a non-invasive and scalable system for measuring contractile function in vitro.

L&#39;utilisation de Microscale Silicon Cantilevers pour évaluer cellulaire contractile Fonction<em&gt; In Vitro</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Gradient système de diffusion d&#39;enquêter Chimiotactisme dans une matrice de collagène 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritation des yeux Test (IET) pour l&#39;identification des dangers des produits chimiques irritants oculaires utilisant épithélial (RHCE) Tissue modèle reconstruit humain Cornea-like

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

À long terme direct Imaging Device pour meilleure Manipulation expérimentale des larves de poisson zèbre

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular reactions. However, it is difficult to determine the relation between the size of a nanostructure and the responses of cells owing to the lack of proper screening tools. Here, we show the development of reproducible and cost-effective gradient nanopattern plates for the manipulation of cellular responses. Using anodic aluminum oxide (AAO) as a master mold, gradient nanopattern plates with nanopillars of increasing diameter ranges [120-200&#8239;nm (GP 120/200), 200-280&#8239;nm (GP 200/280), and 280-360&#8239;nm (GP 280/360)] were fabricated by a thermal imprinting technique. These gradient nanopattern plates were designed to mimic the various sizes of nanotopography in the ECM and were used to screen the responses of human endothelial colony-forming cells (hECFCs). In this protocol, we describe the step-by-step procedure of fabricating gradient nanopattern plates for cell engineering, techniques of cultivating hECFCs from human peripheral blood, and culturing hECFCs on nanopattern plates.

Here, we present a protocol for the fabrication of gradient nanopattern plates via thermal nanoimprinting and the method of screening responses of human endothelial progenitor cells to the nanostructures. By using the described technology, it is possible to produce a scaffold that can manipulate cell behavior by physical stimuli.

Fabrication de nanostructures Gradient thermique dispositifs Technique et dépistage de la réponse des cellules formatrices endothéliales humaines

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

Séquençage de l’ultra longue lecture pour l’analyse de l’ADN génomique ensemble

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...