Ce protocole permet d’observer et de détecter les événements de transcription et donne un aperçu des effets des ruptures double brin d’ADN sur la transcription en cours d’un gène. Le principal avantage de la technique est l’observation de transcriptions d’ARN marquées individuellement dans des cellules individuelles à des intervalles de temps de secondes sur une période totale d’une heure ou plus. Cette méthode fournit un aperçu de la réponse aux dommages à l’ADN pour étudier la diaphonie entre la transcription et les processus cellulaires, tels que la réplication de l’ADN et les lésions de l’ADN.
Notre conseil est d’observer les cellules à l’aide de doxycycline et d’effectuer des mesures d’étalonnage pour entraîner la détection du site de transcription et des molécules d’ARN marquées. Dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre, préparer la solution A contenant 150 microlitres d’ADN plasmatique MEM sérique réduit et 2,5 microgrammes par microlitre d’ADN dans le réactif d’aide à la transfection. En parallèle, préparer la solution B contenant 150 microlitres de MEM sérique réduit et 1,5 microgramme par microlitre d’ADN dans un réactif de transfection à base de lipides.
Incuber les deux solutions à température ambiante pendant cinq minutes, puis ajouter doucement la solution A à la solution B et incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Pour transfecter les cellules, ajoutez 300 microlitres de solution mélangée A et B goutte à goutte à chaque plat et répartissez-les doucement. Conservez le plat à fond de verre dans un plat de culture cellulaire standard de 100 millimètres et incurez-le à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée avec 5% de dioxyde de carbone.
Préparer un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre avec 200 microlitres de DMEM avec HEPES sans rouge phénol et complété par du sérum fœtal bovin dépouillé à 10% de charbon de bois, puis ajouter TA. Environ une heure avant le début de l’observation microscopique, induire la transcription des gènes rapporteurs en ajoutant de la doxycycline au milieu de croissance et mélanger doucement en pipetant de haut en bas avec une micropipette de 200 microlitres. Transportez les cellules au microscope au moins 30 minutes avant de commencer l’observation et placez la parabole de 100 millimètres avec les cellules à l’intérieur de la chambre d’incubation du grand microscope préchauffé. Placez le tube de microcentrifugation avec le TA pré-dilué à l’intérieur de la grande chambre environnementale du microscope pour le réchauffer à 37 degrés Celsius.
Remplacez le couvercle du plat inférieur en verre par un couvercle percé de trois millimètres de diamètre. Sélectionnez l’objectif d’immersion dans l’huile 100X dans le panneau de commande du microscope et appliquez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif. Placez le plat inférieur en verre avec les cellules à l’intérieur de la chambre d’incubation de l’étage du microscope et verrouillez-le en place, puis fermez le couvercle de l’incubateur de la scène et toutes les portes du boîtier du microscope.
Démarrez le logiciel d’utilisation et de contrôle du microscope, ouvrez la fenêtre de contrôle de mise au point et cliquez sur le volet de la portée. Dans le volet de sélection des émissions, cliquez sur la case 100 % œil pour définir la trajectoire du faisceau oculaire pour l’observation directe de l’échantillon à l’œil. Dans le menu Jeu de filtres, passez à Jeu de filtres oculaires et cliquez sur Brightfield, puis appuyez sur le bouton Ouvrir Brightfield.
Déplacez l’objectif du microscope vers le plat inférieur en verre jusqu’à ce que l’huile touche le verre. Regardez à travers les oculaires et concentrez-vous manuellement sur le plan des cellules, puis éteignez le bouton Brightfield ouvert. Laissez les cellules pendant 30 minutes avant de commencer les observations expérimentales pour leur permettre de s’adapter aux conditions environnementales et d’éviter la dérive focale pendant l’imagerie en raison des gradients de température.
Installez une micropipette de 200 microlitres et des pointes de filtre de 200 microlitres à température ambiante. Dans la fenêtre de contrôle de la mise au point du logiciel de contrôle du microscope, réglez l’intensité du laser sur 5% et entrez une valeur de 50 millisecondes pour le temps d’exposition. Ouvrez la fenêtre de capture pour ajuster les paramètres afin d’effectuer une acquisition d’image automatisée de timelapses tridimensionnels.
Sélectionnez le type d’acquisition de capture 3D et définissez 12 à 16 tranches optiques séparées par 0,4 micromètre. Cochez les cases plage autour du courant et revenez à la position actuelle après la capture. Dans le volet de capture timelapse, entrez la valeur 120 pour le nombre de points temporels et 30 secondes pour l’intervalle.
Sélectionnez le jeu de filtres confocaux en fonction des étiquettes de protéines fluorescentes transectées mentionnées dans le manuscrit textuel et réglez le temps d’exposition pour chaque canal à 50 millisecondes. Utilisez le courant de réglage de la puissance laser pour utiliser la valeur de 5 % sélectionnée dans la fenêtre de mise au point. Dans la fenêtre de contrôle de la mise au point, accédez au volet de l’appareil photo, sélectionnez le contrôle d’affichage de l’image à l’échelle et choisissez le bouton manuel pour configurer une plage fixe d’intensités d’image à afficher.
Sélectionnez les cellules pour l’imagerie timelapse 3D des sites de transcription lors de l’induction d’une rupture double brin d’ADN. Filtrez les cellules et sélectionnez trois champs de vision en fonction des conditions décrites dans la discussion du texte. Focalisez chaque cellule sélectionnée précédemment située au centre du champ de vision avec le site de transcription dans le plan central de la pile Z.
Marquez chaque position XYZ dans le plan XY de la fenêtre de contrôle du focus en cliquant sur le point de consigne. Ajoutez 200 microlitres de l’AT pré-dilué aux cellules et démarrez l’imagerie de séries chronologiques 3D en cliquant sur Démarrer dans la fenêtre de capture. Enregistrez les données d’imagerie dans le format de données du logiciel de contrôle du microscope sur le disque dur de l’ordinateur de contrôle du microscope.
Ajouter 0,5 microgramme par millilitre de doxycycline au milieu de croissance des cellules une heure avant de commencer l’acquisition d’images microscopiques. Montez la cuve en verre à l’intérieur de la chambre d’incubation de l’étage du microscope et préparez l’acquisition de l’image comme démontré précédemment. Utilisez les mêmes paramètres d’intensité et d’exposition laser qu’auparavant.
Définissez les paramètres de capture pour les séries chronologiques 2D et définissez 120 points temporels à des intervalles de 500 millisecondes dans le panneau de capture timelapse. Acquérir des dizaines de séries chronologiques d’étalonnage à partir de plusieurs positions afin de générer des ensembles de données pour compter plusieurs centaines de mesures TFI à transcription unique. En utilisant ce protocole, un graphique est obtenu affichant le nombre de transcriptions de gènes rapporteurs marquées par fluorescence au fil du temps avec une résolution temporelle de secondes sur des périodes allant jusqu’à quelques heures.
L’évolution temporelle des valeurs TFI d’un site de transcription du gène rapporteur PROM marqué par l’accumulation de protéine de couche MS2 marquée avec les molécules de protéine fluorescente verte sur les transcriptions naissantes est montrée ici. L’induction d’un seul DSB dans les gènes rapporteurs permet d’étudier son impact sur la transcription en cours du gène rapporteur et le suivi des événements de transcription émergeant du site DSB, à savoir la transcription induite par rupture. L’ajout d’AT et l’induction d’un DSB entraînent une suppression de la transcription du gène rapporteur PROM après environ 11 minutes qui n’est restaurée qu’à 60 minutes.
La récupération complète du signal PP7-RFP montre une initiation de transcription induite par la rupture. Le gène rapporteur antisens EXON 2 montre la terminaison des transcriptions pilotée par le promoteur, qui est ensuite remplacée par une transcription induite par la rupture antisens, révélée par l’accumulation de protéine de couche MS2 marquée par une protéine fluorescente rouge se liant à l’ARN généré à partir de séquences de boucles de tige MS2 antisens. Sélection des cellules pour l’imagerie, configurer l’imagerie timelapse traitée en ajustant la position Z du site de transcription marqué sur chaque position XY au centre de la pile Z à acquérir.
Et enfin, l’ajout de l’AT dilué dans le milieu de croissance doit être exécuté avec un soin extrême pour éviter tout déplacement des positions présélectionnées avec des cellules à imager. L’imagerie de transcriptions d’ARN uniques en 3D au fil du temps dans des cellules vivantes peut être appliquée pour étudier la transcription de l’ARN pendant la réplication de l’ADN ou les changements de transcription au cours de la progression du cycle cellulaire.
