Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Science et génie du Canada à XAC et l&#39;AFP

1. Préparation du matériel pour l&#39;extraction <ol><li> Préparation de cellules <ol><li> Cellules de culture de tissu de semences traitées à l&#39;acide sur des lamelles pour au moins un jour avant l&#39;expérience. Nous utilisons COS-7 ou U2OS, étant donné que ces deux lignées cellulaires présentent une forte production de protéines sécrétées et avoir un bien défini ER. Notez que pour obtenir un rendement d&#39;extraction élevé, les cellules ne doit pas dépasser 80% de confluence sur la lamelle sur le jour de l&#39;expérience. </li><li> Si un ARNm particulier exogène est à l&#39;étude, les cellules sont transfectées un jour après l&#39;ensemencement avec des plasmides contenant le gène d&#39;intérêt en utilisant des protocoles de transfection standard. Les cellules sont ensuite autorisés à exprimer l&#39;ARNm pendant au moins 18 heures avant l&#39;extraction. </li></ol></li><li> Le traitement des cellules avec des inhibiteurs de la traduction <ol><li> Pour tester l&#39;effet des ribosomes intactes sur le maintien des ARNm association avec l&#39;ER, les cellules peuvent être traitées avec des inhibiteurs de la traduction qui perturbent l&#39;associationdes ribosomes avec l&#39;ARNm 11. </li><li> Les inhibiteurs de la initiation de la traduction, comme homoharringtonin (VRD), pactamycin, ou 2 - (4-méthyl-2 ,6-dinitroanilino) - N-méthyl-propionamide (MDMP), de prévenir de nouveaux ribosomes de s&#39;associer avec la transcription tout en permettant aux ribosomes engagés à compléter la traduction 12-14. Puisque le taux de traduction pour la plupart des protéines dans des cellules de mammifères est de 5 acides aminés par seconde, indépendamment de l&#39;usage des codons 15 ou longueur d&#39;ARNm, un traitement de 30 min doit effacer ribosomes hors de messages avec des cadres de lecture ouverts aussi longtemps que 27.000 nucléotides codant pour des protéines ( aussi longtemps que 9.000 acides aminés). </li><li> Des inhibiteurs tels que la puromycine promouvoir l&#39;éjection prématurée de la chaîne naissante et donc perturber polysomes 12. Cependant, pour perturber complètement l&#39;association des ribosomes puromycine traités avec l&#39;ARNm, des chélateurs de magnésium tels que l&#39;EDTA doit être ajouté au tampon d&#39;extraction digitonine 11. </li> &lt;li&gt; Dans cette expérience, les cellules sont traitées avec 200 uM puromycine, 5 uM VRD, ou moyen de contrôle pendant 30 min avant l&#39;extraction. </li></ol></li><li> Préparation du tampon d&#39;extraction digitonine. Pour visualiser ER-localisées ARNm sans l&#39;obstruction des libres (c.-à-cytoplasmiques, non-ER-associés) transcriptions, nous sélective perméabiliser la cellule avec de la digitonine, un glycoside stéroïdien qui interagit préférentiellement avec 3β-hydroxysterols. À de faibles concentrations, la digitonine perméabilise sélective des portions de la membrane plasmique, ce qui provoque «perméabilité» 16. En revanche, la membrane du RE et de l&#39;enveloppe nucléaire, qui sont pauvres en cholestérol, sont laissés intacts 16,17. <ol><li> Digitonine (Sigma Aldrich) poudre est dissoute dans l&#39;eau distillée à 5% du poids / volume et cette solution mère est répartie dans des petits volumes et stockés à -20 ° C. Dans notre expérience, plusieurs cycles gel-dégel diminue l&#39;efficacité de la digitonine dissous. </li><li> Une solution mère de10x tampon CHO (1x concentration de la solution de travail: 115 mm KAc, HEPES 25 mM pH 7,4, MgCl2 2,5 mM, EGTA 2 mM et 150 mM de saccharose) est préparé avec RNase réactifs et conservés à -20 ° C. Une solution de travail (1x tampon CHO) est préparé par dilution de la solution mère avec l&#39;eau sans RNase et peut être conservé à 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Extraction digitonine <ol><li> Préparation des solutions d&#39;extraction <ol><li> Un bloc de chauffage avec une surface plane est pré-chauffée à 40 ° C et maintenu à cette température pendant l&#39;extraction. </li><li> Pour former une surface de travail plane qui est la RNase libre, le bloc de chauffage est humidifié avec de l&#39;eau et recouvertes avec un nouveau morceau de parafilm M (Bemis Company, Inc). Les bulles d&#39;air entre la feuille de parafilm et le bloc de chauffage sont lissées à l&#39;aide RNase gants et Kimwipes (VWR). </li><li> 1x CHO tampon est chauffé à 37 ° C par incubation dans un bain d&#39;eau. </li><li> Plaques de 6 puits sont utilisés pour laveret fixer les cellules. Chaque rangée de 3 puits est utilisée pour une lamelle. Pour les deux premiers puits de la rangée, 2 ml de tampon CHO chauffé est ajouté. Pour le dernier puits, 2 ml de la solution de fixation (paraformaldéhyde PBS + 4% (Sciences Microscope électronique)) est ajouté. Ce plateau peut être stockée dans l&#39;incubateur 37 ° C jusqu&#39;à ce que les cellules sont prêtes pour l&#39;extraction. </li><li> Solution d&#39;extraction digitonine est préparé par dilution de la solution de digitonine actions à 0,025% avec un tampon CHO chaude juste avant de les utiliser. Encore une fois noter que pour la puromycine cellules traitées, le tampon d&#39;extraction doit en outre contenir 20 mM d&#39;EDTA pour perturber efficacement ribosomes 11. Gouttes de 100 ul de la solution d&#39;extraction sont placés sur le bloc chauffant recouvert de parafilm immédiatement avant l&#39;extraction. </li></ol></li><li> Extraction digitonine et la fixation cellulaire <ol><li> Éliminer les cellules de l&#39;incubateur 37 ° C. </li><li> Au cours du processus d&#39;extraction, lamelles sont manipulés avec l&#39;aide d&#39;une pince de Jewler. Avecla pince ramasser la lamelle et le plonger dans le premier tampon, puis le deuxième puits contenant CHO pour laver du milieu de croissance. </li><li> Rapidement éponger l&#39;excès de tampon sur le côté arrière de la lamelle avec un Kimwipe et placer immédiatement le côté pile lamelle, vers le bas, sur la solution d&#39;extraction. </li><li> Après 10 secondes, ramasser la lamelle avec la pince et le transférer immédiatement, côté pile vers le haut, pour le bien contenant le tampon de fixation paraformaldéhyde 4%. </li><li> Laissez incuber l&#39;échantillon dans un fixateur pendant au moins 15 min à température ambiante. </li></ol></li><li> Préparation des cellules de contrôle non extrait. Pour déterminer le montant total de l&#39;ARNm dans le cytoplasme c&#39;est une bonne idée de préparer un échantillon de contrôle non extrait. <ol><li> Les cellules cultivées sur des lamelles sont préparés comme ci-dessus (voir section 2.2), sauf que l&#39;étape d&#39;extraction digitonine (2.2.3) est ignorée. </li><li> Après fixation, les cellules non extraites doivent être perméabilisées dans du PBS + Triton 0,1%X-100 pendant 15 min à température ambiante. </li></ol></li></ol> 3. La coloration FISH <ol><li> Conception des sondes pour l&#39;hybridation fluorescente in situ <ol><li> La séquence primaire de l&#39;ARNm de intéressée est pliée à partir d&#39;ARN de logiciels de prédiction de structure secondaire, telle que RNAstructure 5,0 18. Les plis d&#39;ARNm sont visuellement évaluées pour identifier une région d&#39;environ 50 nucléotides qui est exempt de grandes structures secondaires. </li><li> Le complément inverse de cette région est synthétisé avec un fluorophore Alexa546 attaché à l&#39;extrémité 5 &#39;de la sonde (achetée chez Integrated DNA Technologies). </li><li> La sonde est dilué avec de l&#39;eau exempte de RNase à une concentration de 100 uM actions qui peuvent être conservés à -20 ° C. </li></ol></li><li> La coloration avec sondes FISH <ol><li> Notez que bien que les cellules extraites digitonine ne nécessitent pas de perméabilisation plus, le traitement de ces échantillons fixes avec 2 ml de 0,1% de Triton X-100 dilué dansPBS pendant 15 min à température ambiante avant la coloration FISH, contribue à réduire le bruit de fond. </li><li> Les lames sont ensuite lavées deux fois avec du PBS pour éliminer tout résidu de paraformaldéhyde ou le Triton X-100. </li><li> Les cellules sont ensuite lavées deux fois avec 25% à 60% de formamide dans 1X tampon citrate de sodium (150 mM de NaCl et 15 mM de citrate de sodium). En général, pour les sondes FISH spécifiques qui sont de 50-60 nucléotides de long, 60% formamide est utilisé, mais pour la coloration poly ARNm (A) avec sonde oligo FISH (dT), le niveau de formamide est réduite à 25%. </li><li> À préparer la chambre de coloration, le fond d&#39;une boîte de Pétri de 150 mm est recouverte d&#39;eau et un morceau de parafilm est introduite à l&#39;eau. L&#39;eau est éliminée en faisant tourner le plat fini, ce qui permet au parafilm à adhérer au fond de la boîte. Les bulles d&#39;air sont retirés manuellement avec Kimwipes. </li><li> Pour chaque lamelle à colorer, pipeter une baisse de 100 ul de la solution d&#39;hybridation contenant la sonde FISH d&#39;intérêt sur le nominalAFILM dans la chambre de coloration. La sonde FISH est diluée avec 25% à 60% de formamide dans le tampon d&#39;hybridation (SSC 1x, 100 mg / ml de sulfate de dextrane, 1 mg / ml d&#39;ARNt de levure, 5 mM de complexe riboside vanadyle, 25-60% de formamide) à une concentration de travail de 0,2 uM. Notez que la quantité de formamide doit être optimisé pour la sonde particulier qui est utilisé et est présent à la même concentration que dans la mémoire tampon de lavage SSC (voir l&#39;étape 3.3.3). </li><li> La lamelle est placée face latérale cellule vers le bas sur la solution dans la chambre de FISH coloration et incubés pendant 5-24 heures à 37 ° C dans une chambre humidifiée comme l&#39;incubateur de culture tissulaire. </li></ol></li><li> Lavage et le montage des échantillons colorés <ol><li> Pour préparer une zone de lavage RNase libre, fixer une bande de parafilm sur une surface plane, comme une table de laboratoire. Pour s&#39;assurer que le parafilm est plat, humide, la surface plane, placez le parafilm sur le dessus et supprimer manuellement les bulles d&#39;air avec Kimwipes. </li><li> La chambre de coloration estretiré de l&#39;incubateur et placé sur une surface plane. Les lamelles sont ensuite lancée par pipetage environ 500 pi de tampon de lavage FISH près du bord de chaque lamelle. La solution sera établi entre-deux de la lamelle et le parafilm par action capillaire. </li><li> Pour chaque lamelle, 1 ml de tampon de lavage (1x CSC avec le formamide 25-60%, voir l&#39;étape 3.3.3) est à la pipette sur la zone de lavage parafilm (voir l&#39;étape 3.4.1). </li><li> En utilisant une pince, les lamelles sont retirés de la chambre de coloration et chacun est placé sur la goutte de tampon de lavage et on fait incuber à température ambiante pendant 5 min. Le processus de lavage est répétée 3 fois. </li><li> Lames de verre sont lavées avec de l&#39;éthanol à 70% et séché avec Kimwipes. </li><li> Pour chaque lamelle, 25 ul de solution de montage (DAPI Fluoromount G, Southern Biotech) est à la pipette sur la diapositive. Notez que cette solution contient 4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), dont l&#39;ADN des taches et permet la visualisation des noyaux. </li><li> Usipince ng et Kimwipes, l&#39;arrière de la lamelle est séché et l&#39;excès de tampon de lavage FISH est effacé congé sans séchage de l&#39;échantillon. Chaque lamelle est ensuite placé côté pile vers le bas, sur la goutte de solution de montage. </li><li> Échantillons montés sont ensuite étiquetés et peut-être conserver à 4 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Imagerie et quantification <ol><li> Imagerie <ol><li> Un microscope à épifluorescence est utilisé pour imager les cellules après coloration FISH. La cellule transfectée peuvent être différenciées à partir de cellules non transfectées par le signal de fluorescence brillante dans le canal approprié. Idéalement, chaque champ contient également acquis une cellule non transfectée à être utilisée pour déterminer la fluorescence de fond pour la quantification. </li><li> Pour chacune des images sur le terrain de la FISH et le canal DAPI sont acquises. En outre, si les cellules sont co-colorées avec des marqueurs protéiques, une image de la chaîne d&#39;immunofluorescence est également acquis. Noter que l&#39;extraction de la digitonine peut également être utiliséde visualiser ER ribosomes liés aux protéines et 11. </li><li> Faire en sorte que les intensités de fluorescence entre les champs peuvent être comparés, le temps d&#39;exposition pour chaque canal doit rester constante pour chaque ensemble de l&#39;expérience. </li><li> Encore une fois afin de s&#39;assurer que les intensités de fluorescence entre les cellules sur des lamelles différents peuvent être comparés, les changements au jour le jour dans l&#39;intensité épiluminescence ou de pourriture dans le signal FISH doit être minimisée par l&#39;imagerie par tous les lamelles en une seule séance. </li></ol></li><li> Quantification. Pour quantifier la quantité d&#39;ARNm qui est localisée sur l&#39;urgence, nous utilisons un logiciel Nikon élément NIS. Cependant d&#39;autres logiciels d&#39;analyse d&#39;image, comme ImageJ peut être utilisé. <ol><li> Utilisation de l&#39;outil de Nikon NIS ELEMENT analyse d&#39;image, la périphérie de la cellule et le noyau sont décrits ci-région distincte des intérêts (ROI). </li><li> Pour chaque ROI, l&#39;intensité de fluorescence (I T pour l&#39;intensité totale des cellules et je n pour lesl&#39;intensité nucléaire) et la zone (A et T A N) sont enregistrés et exportés vers un tableur Excel. </li><li> Pour chaque image, l&#39;intensité de fluorescence de fond (I B) est déterminée par l&#39;enregistrement de l&#39;intensité d&#39;une cellule non transfectée. Si les niveaux d&#39;ARNm poly (A) sont en cours d&#39;analyse, une zone exempte de cellules est sélectionnée. </li><li> La quantité totale de ER (dans les cellules extraites) ou cytoplasmique (dans les cellules non extraits) de fluorescence est calculé par la formule: [A T] [T I - I B] - [A N] [N I - I B] </li><li> L&#39;intensité de la coloration nucléaire peut également être calculé et utilisé comme contrôle interne entre les différents traitements. Depuis les noyaux ne sont pas affectés par le traitement digitonine 17 ou la perturbation des ribosomes 11, la quantité d&#39;ARNm nucléaire doit rester constante entre chacun de ces traitements. Pour calculer une fluorescence nucléaire de la formule suivante est utilisée: [A N] [N I - IB] </li><li> Le pour cent de l&#39;ARNm cytoplasmique qui est ER ciblée peut être calculé en prenant la moyenne de fluorescence ER de 30-40 cellules extraites (voir 4.2.4) divisée par la fluorescence cytoplasmique moyenne de 30 à 40 cellules (non extraits à nouveau voir 4.2.4) . Il est essentiel que les cellules extraites et non extrait sont préparés, colorées et imagées en parallèle. </li></ol></li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La localisation des ARNm vers divers sites subcellulaires, grâce à l&#39;interaction avec les protéines de la transcription d&#39;ARNm de localisation, est un phénomène répandu important pour le tri correct des protéines vers leur destination finale, et pour le réglage fin de l&#39;expression génique aux exigences locales d&#39;un subcellulaire 19,20 région. En utilisant le test décrit ici, nous avons réexaminé la question de savoir si les ARNm qui codent pour des pro...

Chez les eucaryotes, l&#39;ARNm codant pour les protéines membranaires et sécrétées peuvent être ciblés pour l&#39;ER co-traductionnelle par le 1,2 particules signal de reconnaissance et peut être maintenue sur l&#39;urgence par le biais des interactions directes entre les ribosomes et translocons lors de la traduction 3,4. Toutefois, si les ARNm peuvent être ciblés et maintenu sur l&#39;examen indépendant ER soit de ribosomes ou la traduction n&#39;était pas clair jusqu&#39;à très récemment. Des études antérieures ont tenté de répondre s&#39;il ya association ARNm traduction indépendante de l&#39;ER en utilisant des techniques de fractionnement cellulaire. Parce que les conditions chimiques agressifs étaient tenus de dissocier les ribosomes de ER vésicules dérivées, ce qui pourrait potentiellement perturber le délicat ARNm-ER association, ces études n&#39;ont pas été concluants, fournissant des preuves pour 5-8 et contre 9,10 ribosomique indépendante d&#39;ancrage de l&#39;ARNm de l&#39;ER . Pour contourner ces problèmes, nous avons développé un prototypecol d&#39;isoler et d&#39;image liés ER-ARNm. Cette procédure implique un traitement d&#39;extraction doux, ce qui supprime efficacement tout le contenu cytoplasmique de la cellule (y compris non liés ARNm ER) tout en conservant la morphologie ER et l&#39;ensemble de ses molécules associées. En utilisant ce protocole, nous avons démontré qu&#39;un sous-ensemble des ARNm sont ciblées et ensuite maintenue sur l&#39;urgence indépendamment des ribosomes ou de traduction 11.

visualization of endoplasmic reticulum localized mrnas in mammalian cells

Chez les eucaryotes, la plupart des ARN messagers (ARNm) codant pour des protéines membranaires et sécrétées sont localisés à la surface du réticulum endoplasmique (RE). Cependant, la visualisation de ces ARNm peut être difficile. Cela est particulièrement vrai lorsque seule une fraction de l&#39;ARNm est ER-associé et leur distribution à cet organite est obstrué par des non-ciblées (par exemple «libre») les transcriptions. Afin de surveiller ER-ARNm associés, nous avons développé une méthode dans laquelle les cellules sont traitées avec une courte exposition à une solution d&#39;extraction digitonine que perméabilise sélective de la membrane plasmique, et supprime ainsi le contenu cytoplasmique, tout en maintenant l&#39;intégrité de l&#39;ER . Lorsque cette méthode est couplée avec hybridation fluorescente in situ (FISH), on peut visualiser clairement ER-ARNm liés par microscopie à fluorescence. En utilisant ce protocole le degré d&#39;association pour ER-soit en vrac poly (A) relevés de notes ou ARNm spécifiques peuvent être évaluéset même quantifiés. Dans le processus, on peut utiliser ce test pour étudier la nature de l&#39;ARNm-ER interactions.

Pour déterminer le pourcentage d&#39;ARNm qui est associé ER-, COS-7 cellules qui ont été transfectées avec des plasmides qui contiennent de la phosphatase alcaline placentaire (zone à faible prévalence) ou le cytochrome P450 8B1 (CYP8B1) ont été soit extrait avec de la digitonine, puis fixé ou fixé directement (voir la figure 1, comparer &quot;non extrait Ctrl&quot; pour &quot;Extrait Ctrl&quot;). La fluorescence non nucléaire a été quantifiée dans les deux échantillon...

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Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Nous décrivons ici une méthode pour visualiser réticulum endoplasmique associés ARNm dans les cellules de culture de tissus de mammifères. Cette technique implique l&#39;perméabilisation sélective de la membrane plasmique avec de la digitonine à supprimer les contenus cytoplasmiques suivie par fluorescence<em&gt; In situ</emHybridation&gt; pour détecter soit en vrac poly (A) ARNm ou transcrits spécifiques.

Visualisation des ARNm localisés dans le réticulum endoplasmique des cellules de mammifères

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

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Research

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Biology

14.2K vues.  University of Toronto. Nous décrivons ici une méthode pour visualiser réticulum endoplasmique associés ARNm dans les cellules de culture de tissus de mammifères. Cette technique implique l'perméabilisation sélective de la membrane plasmique avec de la digitonine à supprimer les contenus cytoplasmiques suivie par fluorescence In situ pour détecter soit en vrac poly (A) ARNm ou transcrits spécifiques.

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Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinisation et Repiquage des cellules de mammifères

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

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Biologie

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

En fractionnement subcellulaire situ des adhérentes et non-adhérents des cellules de mammifères

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

EsiRNA MISSION pour le dépistage de l&#39;ARNi dans les cellules de mammifères

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Analyse de la cinétique ARNm exportation nucléaire dans les cellules de mammifères par micro-injection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse de la situation du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualisation de réticulum endoplasmique sous-domaines dans les cellules cultivées

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized near the mitochondria. Support for this possibility is derived from recent studies, in which many mRNAs encoding mitochondrial proteins were shown to be localized to the mitochondria vicinity. Together with earlier demonstrations of ribosomes&#8217; association with the outer membrane, these results suggest a localized translation process. Such localized translation may improve import efficiency, provide unique regulation sites and minimize cases of ectopic expression. Diverse methods have been used to characterize the factors and elements that mediate localized translation. Standard among these is subcellular fractionation by differential centrifugation. This protocol has the advantage of isolation of mRNAs, ribosomes and proteins in a single procedure. These can then be characterized by various molecular and biochemical methods. Furthermore, transcriptomics and proteomics methods can be applied to the resulting material, thereby allow genome-wide insights. The utilization of yeast as a model organism for such studies has the advantages of speed, costs and simplicity. Furthermore, the advanced genetic tools and available deletion strains facilitate verification of candidate factors.

Many mRNAs encoding mitochondrial proteins are associated with the mitochondria outer membrane. We describe a subcellular fractionation procedure aimed at isolation of yeast mitochondria with its associated mRNAs and ribosomes. This protocol can be applied to cells grown under diverse conditions&#160;in order to reveal mechanisms of mRNA localization and localized translation near the mitochondria.

Isolement des ARNm associés aux mitochondries de levure pour étudier les mécanismes de traduction localisée

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Mesure des niveaux Heme synthèse dans des cellules de mammifères

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Essais Reporter massivement parallèles dans des cellules de mammifères en culture

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imagerie Ca locale<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaux de cellules de mammifères cultivées

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...