La méthode de bicouche à bulles de contact est une technique alternative pour les bicouches lipidiques conventionnelles. et cette méthode permet une vibration plus polyvalente à travers la membrane. La méthode CBB intègre les avantages de Planar Lipid Bilayer et patch clamp méthode.
Comme technique de bicouche lipidique un CBB avec une composition arbitraire de lipide peut être formé. Nous avons développé un CBB pour les enregistrements actuels à canal unique avec un rapport signal/bruit élevé. Cette méthode permet des variétés de vibrations membranaires et offre une vaste plate-forme de type à l’interface de la membrane du canal.
Tout le monde a connu souffler une bulle de savon. Des manœuvres similaires sont prises pour la formation de CBB en peaufinant manuellement la pression appliquée plutôt que de souffler par la bouche. Entraînez-vous et profitez du CBB.
Pour être cette procédure disperser les phospholipides dans le chloroforme à une concentration désirée dans un flacon de fond rond. Placez la solution phospholipide sur un évaporateur rotatif relié à une bouteille de gaz azoté. Faites pivoter le flacon sous l’écoulement d’azote à température ambiante jusqu’à ce qu’un mince film phospholipide apparaisse.
Placez ensuite le flacon ouvert dans un dessiccator qui est relié à une pompe à vide. À l’aide de la pompe à vide aspirer l’intérieur du desiccateur pendant plusieurs heures pour enlever le chloroforme à fond. Ajoutez par la suite un volume approprié de solution d’électrolyte au flacon et suspendez le phospholipide pour obtenir une suspension phospholipide de deux millilitres par millilitre.
Sonciate la suspension pendant 20 à 30 secondes à l’aide d’un sonicateur de bain pour obtenir une suspension vésicule multicououche. Pour la préparation des protéoliposomes qui contiennent des protéines de canal iion, ajoutez une solution protéique à la suspension vésicule multicouche. Et sonicate pendant plusieurs secondes en utilisant le sonicateur de bain.
Pour préparer de grandes pipettes en verre alésage, placez un capillaire en verre dans un puller pipette et fabriquez la micropipette avec une pointe conique fine à travers deux étapes de traction. Ensuite, placez la micropipette sur une micro forge et contactez la pointe de la micropipette à un filament de platine à la partie conique avec un diamètre de 30 à 50 micromètres. Chauffer brièvement le filament et l’éteindre immédiatement.
À l’aide d’eau distillée et d’éthanol, nettoyer la surface de la glissière de verre à l’aide d’un puits peu profond. Appliquez ensuite le réaccente siliconizing sur la glissière de verre et laissez le reagent sécher complètement dans l’air. Placez ensuite la glissière de verre sur la scène d’un microscope inversé.
Ajouter 100 microlitres d’hexadécane dans le puits peu profond de la glissière en verre siliconé. À l’aide d’une seringue à tuberculine, remplir la solution d’électrolyte jusqu’à la moitié de la longueur de la micropipette. Ensuite, placez la micropipette sur le support de micropipette avec le port de pression, permettant à l’électrode de fil de chlorure argent/argent de tremper dans la solution d’électrolyte pipette.
Connectez l’un des supports de micropipette au stade de tête d’un amplificateur de pince de correction et l’autre au sol électrique. Reliez ensuite un microinjecteur au port de pression du support de micropipette. Réglez la micropipette à une position appropriée au-dessus du stade d’un microscope inversé à l’aide du micromanipulateur.
Pour ajuster le potentiel de compensation de l’électrode, placez un microlitre de la même solution d’électrolyte utilisée pour remplir la micropipette sur la surface plane autour du puits peu profond de la glissière de verre pour créer un dôme d’électrolyte. Faire tremper la pointe des deux micropipettes dans le dôme d’électrolyte. Réglez ensuite le potentiel de compensation de l’électrode de l’amplificateur de pince de correction.
Pour tirer la solution liposome de la pointe, ajoutez un microlitre de solution liposome sur la surface plane autour du puits peu profond du verre de glissière. Placez ensuite la pointe de la micropipette dans le liposome contenant du dôme. Aspirer le liposome contenant la solution à l’aide du microinjecteur.
Répétez la procédure pour l’autre mircopipette pour aspirer canal reconstitué liposomes. Placez maintenant la micropipette dans l’hexadécane dans le puits peu profond. Soufflez lentement une bulle d’eau en augmentant la pression jusqu’à ce que la bulle atteigne la taille désirée et maintenez la même pression par la suite.
Jetez la bulle en passant la pointe à travers l’interface huile-air s’il est difficile de garder la taille de la bulle stable. Répétez les procédures jusqu’à formation de deux bulles stables. Établissez un contact entre les deux bulles.
Affiner la pression pour maintenir la taille de la bulle, car la taille peut progressivement changer même à la pression intra-bulle constante. Réglez le potentiel de la membrane à la valeur appropriée à l’aide de l’amplificateur de revendication de patch et attendez que le courant du canal émerge. Pour une formation stable de bicouches lipidiques, il est essentiel de nettoyer les buvards.
La préparation capillaire en verre ou pipette doit être soigneusement lavée et éviter la contamination par les molécules de détergent. Une fois que le CBB avait formé les molécules de canal dans la solution aqueuse ou dans le liposome ont été spontanément insérés dans la bicouche dans l’espace de quelques à douzaines de minutes. L’insertion des canaux a été confirmée par l’augmentation sage d’étape de l’amplitude de courant sous le potentiel appliqué de membrane.
Une bicouche formée par la méthode CBB peut être désintégrée en deux monomères. Le courant du canal pTB est apparu immédiatement après avoir attaché les deux monomères. Et le courant est devenu plus grand à mesure que l’are de contact augmentait l’amplitude du courant synchronisé avec la manipulation d’attache de détachement du CBB.
Si le nombre de éruptions de bulles augmente la concentration lipidique dans la solution aqueuse diminue et le monocouche n’est pas formé. Ensuite, essayez de soulager la pression sur la section liposome. Une fois que la formation cbb et la reconstitution des canaux sont établies, vous pouvez essayer de varier les compositions de la solution aqueuse et de la membrane par profusion ou l’injection d’une substance hydrophile ou hydrophobe.
La méthode CBB a ouvert des façons polyvalentes d’explorer les jeux canal-membrane.
