Ce travail a été financé par l&#39;Institut national de la santé Subventions R01HL089462 à SP.

1. Préparation des liposomes cationiques <ol><li> Autoclave un ballon propre à être utilisé pour la préparation lipososmes. </li><li> Préparer des solutions de: <ol class="lalpha"><li> - Dissoudre 200 mg de bromure de diméthyl ammonium dioctadecyl (Doab) dans 10 ml de chloroforme en utilisant une petite bouteille en verre. </li><li> - Dissoudre 200 mg de cholestérol dans 10 ml de chloroforme en utilisant une petite bouteille en verre. </li><li> - Préparer et passer à l&#39;autoclave pour stériliser les 5% de glucose dans 100 ml d&#39;ARN / ADN-ase eau distillée libre. </li></ol></li><li> Rincer le ballon avec du chloroforme. Ajouter 5-10 ml dans le flacon, tourbillon, et laisser reposer pendant quelques minutes. Gardez le flacon recouvert d&#39;une feuille d&#39;aluminium à tout moment. Vider le chloroforme du ballon. </li><li> Préparation de liposomes: <ol class="lalpha"><li> - Ajouter 315 ul de la solution mère Doab au ballon rond. </li><li> - Ajouter 200 pi de solution de cholestérol dans le ballon. </li><li> - Ajouter 9,5 ml de chloroforme à la fiolend mélanger par tourbillonnement. </li></ol></li><li> Réglez le rotovapeur à 37 ° C, 100 rotations par minute (rpm) ou plus (100-120 rpm). L&#39;évaporateur rotatif doit être connectée à une commande de vide de pompe à eau avec un tube d&#39;aspiration fixé correctement. </li><li> Connectez le réservoir de gaz argon et l&#39;évaporateur rotatif. </li><li> Fixer le ballon à l&#39;évaporateur rotatif et ajuster les réglages optimaux avant de descendre dans le bain d&#39;eau. Ouvrez la première vanne pour l&#39;argon complètement en tournant dans le sens antihoraire. Toujours ouvrir et fermer cette vanne premier. La seconde soupape commande la pression d&#39;argon de soufflage dans le ballon. La pression doit être toujours douce. </li><li> Abaisser le rotovapeur dans le bain d&#39;eau, assez pour le flacon toucher l&#39;eau sans être complètement submergé et allumez la vitesse. </li><li> Attendez jusqu&#39;à ce que tous les chloroforme s&#39;évapore, environ 10 min. Ensuite arrêter la machine. </li><li> Éteignez la vitesse de rotovapeur et les robinets du réservoir d&#39;argon. Maintenant, le flacon doit être supprimée. </li><li> Ajouter 2 ml de glucose à 5% pour ee ballon pour dissoudre les lipides. </li><li> Rayer le fond du flacon à fond en utilisant une pointe de pipette ml pour dissoudre tous les lipides. Après grattage, enlever tout reste de lipides à partir de la pointe de 1 ml dans le flacon, le cas échéant, avec une deuxième extrémité. </li><li> Incuber la solution obtenue à 42 ° C au bain d&#39;eau tout en tourbillonnant lentement (15 min) dans le ballon. </li><li> Remplir la cuve d&#39;ultrasons avec de l&#39;eau froide. Soniquer la solution pendant au moins 20-30 minutes avec le ballon tenu et le bas juste à peine toucher l&#39;eau. </li><li> Chauffer le ballon dans un bain d&#39;eau de l&#39;évaporateur rotatif pendant 20 min à 42 ° C, à la vitesse zéro, avec le fond rond immergé dans l&#39;eau, cette fois. </li><li> Filtrer les liposomes à travers un 0,47 micron et par la suite, 0,22 micron filtres seringue. </li><li> Utilisation d&#39;une petite extrudeuse, filtrer les liposomes à travers une membrane de 50 nm pour générer une population homogène de vésicules de liposomes unilamellaires. </li><li> Transférer les liposomes dans un tube Eppendorf et le placer sur la glace. </li></ol><html> 2. Préparer les liposomes: siRNA-ITSN-1 Complexes <ol><li> Reprendre le sur-cible souris siRNA ITSN dans un tampon de siRNA contenant HEPES 20 mM et du chlorure de sodium 150 mM, pH 7,4, à une concentration finale de 2 pg / pl. Gardez-le sur la glace avant de les mélanger. </li><li> Préparer les liposomes: complexes ITSN de siRNA à un ratio de 8 liposomes nmol: 2 ug d&#39;ARN (ou 400 nmol liposomes: 100 ug siRNA ITSN). Dans la présente étude, nous avons ajouté 50 pi de ITSN de siRNA à partir de la solution mère (50 M) à 100 pi de liposomes fraîchement préparés en utilisant un ARN / ADN-ase tube Eppendorf libre. Notez que la concentration de ITSN de siRNA est très important car un maximum de 150 pi de mélange peut être injecté bilatéralement et rétro-orbitaires chez la souris en même temps. </li><li> Gardez le mélange sur la glace en attendant d&#39;injecter des souris. </li></ol> 3. Souris rétro-orbitaire injection dans la veine (angle interne de l&#39;orbite) jove_content &quot;&gt; Toutes les expériences de souris ont été arrêtés et exécutés en conformité avec les directives du Rush University Institutional Animal Care et Use Committee. <ol><li> Anesthésier la souris par injection intra-péritonéale d&#39;un mg / kg de kétamine 50 corps de poids et de 5 mg / kg de poids corporel xylazine (mélange disponible dans le commerce). Selon le poids de l&#39;animal et de l&#39;âge, de régler le volume des anesthésiques et de concentration. Les souris utilisées dans les souris de l&#39;étude sont des souris CD1 mâles, âgées de 6-8 semaines et pèse environ 25 grammes. Les seringues sont tuberculine 1 ml Type avec l&#39;aiguille fixée. </li><li> Tenir des oreilles de souris avec une main et tourner la souris enfoncé sur un côté pour exposer l&#39;angle interne de l&#39;œil. But médiale à la plica semilunaris; éviter de toucher le globe oculaire. </li><li> Approchez-vous des caruncle lacrymales de l&#39;oeil tenant la seringue contenant le mélange à un angle de 45 degrés dans les trois axes. </li><li> Injecter lentement le mélange et laissez la souris pour récupérer le côté injecté vers le haut. Si une grande liquideformes de gouttelettes sur le lieu d&#39;insertion de l&#39;aiguille, l&#39;aiguille se rétractent, aspiration arrière de la goutte dans la seringue et essayez à nouveau. Des injections répétées sont mieux fait en alternant les yeux, pour permettre la récupération parfaite. En cas de doute, cette technique peut être vérifiée en injectant un colorant bleu (50 pi, 0,5% de cristal violet dans le méthanol) et en exposant les poumons de souris pour observer la vascularisation bleu. </li><li> Les souris dans cette étude ont été injectés chaque 3 ème jour pendant 3 semaines sans décès ou les effets indésirables. </li></ol> 4. Souris perfusion du poumon et collection de tissus pour les études biochimiques <ol start="0"><li> Régler la pompe péristaltique pour fonctionner à 1,5 ml / min. </li><li> Préparer le réglage: ventilateur, table d&#39;opération, les instruments, des cotons-tiges stériles, des cotons tiges, cordes, gobelets, eau distillée, sel équilibrée de Hank, traceur. </li><li> Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale du mélange anesthésique (100 mg / kg de kétamine corps de poids et de 10 mg / kg de poids corporel xylazine de poids). </li&gt; <li> Au niveau de la nuque, enlever les glandes salivaires et d&#39;exposer la trachée. </li><li> Commencez par laparotomie, l&#39;excision de la membrane, et suivre avec thoracotomie, exposant les poumons et le coeur. </li><li> Retirez le thymus. </li><li> Utilisation de la microscopie optique pour une meilleure précision, cathétérisme de l&#39;artère pulmonaire. </li><li> Avez-trachéotomie et intuber la souris en utilisant la trachéotomie. Réglez le ventilateur à une vitesse de 150 coups / min et le volume systolique de 150 pi. </li><li> En sortie, ouvrez l&#39;oreillette gauche. </li><li> Perfuser le système vasculaire pulmonaire de souris sans sang pendant 5 min, à l&#39;aide de la pompe péristaltique et la solution de Hank réchauffé à 37 ° C. </li><li> Perfuser le traceur (8 nm d&#39;or-albumine 16) pour supplémentaire de 10 min à la même vitesse d&#39;écoulement. </li><li> Rincer le traceur non lié par 5 perfusion du poumon min avec une solution de Hank. </li><li> Suivre avec la fixation in situ dans les poumons de 10 min perfusion de 4% (poids / volume) de formaldéhyde, 2,5% de glutaraldéhyde, l&#39;acide tannique et de 1% à 0,1 PIPEStampon, pH 7,2. </li><li> Recueillir les poumons, enlever le tissu excessive, couper des petits blocs (3/3 mm), et les placer dans une fiole à scintillation marqué contenant 2 ml de mélange fixateur. </li></ol> Les souris vont expirer complètement anesthésié pendant la procédure. 5. Souris traitement du tissu pulmonaire pour EM <ol><li> Préparer des solutions de 1% Palade OSO4, acétate veronal, et le tampon Kellenberger. <ol class="lalpha"><li> - Mémoire tampon Palade-OSO4 ​​1% contient: 1 ml d&#39;acétate d&#39;actions veronal, 1,25 ml 4% OSO4, 1 ml d&#39;acide chlorhydrique 0,1 N et de l&#39;eau distillée jusqu&#39;à 5 ml de volume final. </li><li> - Solution stock veronal d&#39;acétate est obtenue par dissolution de 1,15 g de sodium andydrous d&#39;acétate et 2,94 g barbiturique dans 100 ml d&#39;eau distillée. </li><li> Solution Kellenberger contient 2 ml d&#39;acétate d&#39;actions veronal, 2,8 ml d&#39;acide chlorhydrique 0,1 N, 0,05 g d&#39;acétate d&#39;uranyle et de 5,1 mlde l&#39;eau distillée, à pH = 6. </li></ol></li><li> Laver les blocs du poumon chez 0,1 M cacodylate de sodium, pH = 7,4, brièvement 3 fois. </li><li> Fixer les échantillons dans les 4% (poids / volume) de formaldéhyde, 2,5% de glutaraldéhyde dans un tampon 0,1 PIPES, pH 7,2, pendant 1 heure, à température ambiante. </li><li> Post-fixer avec 1% Palade-Osmium pendant 1 h dans la hotte, sur la glace, dans l&#39;obscurité. </li><li> Rincer une fois avec un tampon Kellenberger. </li><li> Incuber les échantillons dans un tampon Kellenberger pendant 2 heures ou toute la nuit, à la température ambiante. </li><li> Rincer une fois dans l&#39;éthanol à 50%. </li><li> Déshydrater avec la série graduée de l&#39;éthanol, 5 min / chacun: 70%, 95%, puis 2 x 15 min de l&#39;éthanol à 100%. </li><li> Mettez à 100% d&#39;oxyde de propylène, 2 x 15 min. </li><li> Éliminer l&#39;oxyde de propylène et d&#39;ajouter un mélange de 50% d&#39;oxyde de propylène et 50% Epon 812, incuber pendant la nuit, tournant sur une roue, à la température ambiante. </li><li> Le lendemain matin, retirez le mélange et ajouter frais Epon 812, au moins pour 4-5 heures sur le volant. </li><li> En utilisant des moules coniques doublé, remplisà mi-chemin avec des produits frais 100% Epon 812, ajouter les échantillons sélectionnés et les placer sur les bords. </li><li> Déplacez les moules à l&#39;ensemble incubateur à 60 ° C et laissez-les durcir pendant 48-72 h. </li><li> Lorsque polymérisé, envoyer les blocs d&#39;être mince (60-70 nm d&#39;épaisseur) sectionnés. </li></ol>

<ol>
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Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).</li><li>Uddin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipids+used+in+non-viral+gene+delivery+systems.">Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems.</a> Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).</li><li>Barenholz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+lipid+composition+on+the+thermotropic+behavior+and+size+distribution+of+mixed+cationic+liposomes.">Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes.</a> J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).</li><li>Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+endothelial+cell+uptake+of+cationic+liposome-DNA+complexes+in+mice.">Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice.</a> Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).</li><li>Soutschek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+silencing+of+an+endogenous+gene+by+systemic+administration+of+modified+siRNAs.">Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.</a> Nature. (432), 173-178 (2004).</li><li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+enhance+bioremediation+of+oil-contaminated+soil.">Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil.</a> J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).</li><li>Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal,+nanoparticle,+and+conjugated+formulations+of+anticancer+agents.">Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents.</a> Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).</li><li>Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pharmacokinetics,+tissue+distribution,+and+therapeutic+effectiveness+of+cisplatin+encapsulated+in+long-circulating,+pegylated+liposomes+(SPI-077)+in+tumor-bearing+mice.">Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice.</a> Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).</li><li>Martino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+siRNA+delivery+by+the+cationic+liposome+DOTAP+in+human+hematopoietic+stem+cells+differentiating+into+dendritic+cells.">Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells.</a> J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260 (2009).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+delivery+system+targeting+bone+formation+surfaces+to+facilitate+RNAi-based+anabolic+therapy.">A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy.</a> Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).</li><li>Predescu, D., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmalemmal+vesicles+represent+the+large+pore+system+of+continuous+microvascular+endothelium.">Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium.</a> Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).</li><li>Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dap160/intersectin+acts+as+a+stabilizing+scaffold+required+for+synaptic+development+and+vesicle+endocytosis.">Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis.</a> Neuron. (43), 193-205 (2004).</li><li>Miyawaki-Shimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Basé sur des études précédentes publiées par d&#39;autres 9 et nous 1, 18 nous avons développé cette méthodologie pour le long terme abattre des ITSN-1 in vivo par administration intraveineuse répétée (toutes les 72 h, pendant 24 jours consécutifs) de siRNA spécifique / complexes de liposomes. Cette approche expérimentale est efficace, peut être utilisé en toute sécurité et de façon répétée et il peut être facilement étendu pour étudier l&#39;implication d&#39;un g...

SiARN nu ne peut pas pénétrer la membrane cellulaire, étant chargé négativement, et il est facilement dégradés par les enzymes dans le sang, les tissus et les cellules. Même avec des modifications structurales récemment d&#39;améliorer la stabilité, l&#39;accumulation de siRNA au niveau du site cible après administration est extrêmement faible et nécessite un véhicule intracellulaire efficace 5. Les liposomes cationiques sont apparus comme sûrs acides nucléiques transporteurs ayant le potentiel de transférer de gros morceaux d&#39;ADN / ARN dans les cellules par encapsulation et la protection des acides nucléiques à partir de la dégradation enzymatique 6. En outre, les liposomes cationiques interagissent spontanément avec l&#39;ADN / ARN, favorisant ainsi le transfert de gènes dans les cellules 2. Plus récemment liposomes ont été appliquées à l&#39;administration de vaccins et de médicaments à faible poids moléculaire 7. Livraison liposomale de microRNA-7 plasmide exprimant surmonte facteur de croissance épidermique récepteur tyrosine kinase inhibiteur de la résistance dans les cellules de cancer du poumon 8. Lorsque vous ciblez l&#39;endothélium vasculaire, l&#39;administration par voie intraveineuse est essentielle parce que les complexes sont peu susceptibles de traverser la barrière endothéliale et s&#39;extravaser dans le tissu interstitiel 9. En comparaison à d&#39;autres organes, ECS de la microvascularisation du poumon ont le plus l&#39;absorption et avidement internaliser liposome cationique et complexes ADN / ARN, suivie par les ganglions lymphatiques et les plaques de Peyer 9. Administration intraveineuse dans des modèles rongeurs de siRNA via injections veine rétro-orbitaires ou la queue a été prouvé inoffensif, même à des concentrations élevées, telles que 50 mg / kg 10. Dans la littérature publiée de la composition de liposomes cationiques est différente, sur la base de la formulation de lipides et de leur rapport équimolaire 11, 12. Il existe un large éventail d&#39;applications potentielles en utilisant des liposomes cationiques pour la livraison de gènes in vivo, si le ciblage down-regulation/over-expression des protéines, la livraison des vaccins ou des thérapies anti-tumorales 13-15. Important de se rappelerest que l&#39;efficacité de l&#39;interaction de la membrane l&#39;ADN / ARN cellulaire est régulée par la forme de couplage entre les complexes générés et les lipides membranaires. Ceci suggère que l&#39;adaptation de la composition des lipides aux profils ciblés de la membrane cellulaire peut être bénéfique et entraîner des taux élevés de transfection dans un type cellulaire particulier 6.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2779</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LiposoFast stabilizer (mini-extruder)</td>
 <td>Avestin Inc.</td>
 <td>LF-STB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore</td>
 <td>Avestin Inc.</td>
 <td>LFM-50</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cholesterol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C-8667</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform</td>
 <td>Mallinckrodt Chemicals</td>
 <td>4432-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hank's balanced salts</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H1387</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Round-bottom flask</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>FHB-275-030X</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse siRNAITSN - on target </td>
 <td>Dharmacon/ThermoScientific</td>
 <td>J-046912-11</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic pump</td>
 <td>Ismatec</td>
 <td>REGLO-CDF digital with RHOO pump head</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ventilator</td>
 <td>Hugo Sachs Electronik</td>
 <td>NA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Barbital</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>B-0500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Uranyl acetate</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>22400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epon812</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>Discontinued by the manufacturer</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propylene oxide</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>20400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Embedding molds</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>69923-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tannic acid</td>
 <td>EM Sciences</td>
 <td>21710</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>8 nm gold-albumin tracer</td>
 <td></td>
 <td>Prepared in the laboratory as in16</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Pyrex, 100 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Modified siRNA, in vivo</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Part of IDEX corp.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>D-79232 March, Germany</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Replaced with Embed812, cat. # 14120</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

long-term silencing of intersectin-1s in mouse lungs by repeated delivery of a specific sirna via cationic liposomes. evaluation of knockdown effects by electron microscopy

Des études antérieures ont montré que knockdown de ITSN-1 (KD ITSN), une protéine endocytose impliqué dans la régulation du poumon perméabilité vasculaire et les cellules endothéliales () la survie, la mort cellulaire par apoptose induite, un obstacle majeur au développement d&#39;un système de culture cellulaire avec prolongée ITSN-1s une inhibition. Utilisant des liposomes cationiques comme porteurs, nous avons exploré le silence des gènes ITSN-1 dans les poumons de souris par l&#39;administration systémique de siRNA ciblant ITSN-1 gène (ITSN de siRNA). Les liposomes cationiques offrent plusieurs avantages pour la livraison de siRNA: coffre-fort avec des doses répétées, non immunogène, non toxique et facile à produire 2. performance des liposomes et l&#39;activité biologique dépend de leur taille, la charge, lipides composition, la stabilité, la dose et la voie d&#39;administration 3 Ici, efficace et ITSN KD spécifique dans les poumons de souris a été obtenu en utilisant une combinaison de bromure d&#39;ammonium dioctadecyl cholestérol et de diméthyle. Administration intraveineusede ITSN de siRNA / complexes liposome cationique transitoire renversé protéines ITSN-1 et l&#39;ARNm dans les poumons de souris au jour 3, qui a récupéré après 3 jours supplémentaires. Profitant des liposomes cationiques comme un transporteur sûr reproductible, l&#39;étude prolongée de 24 jours. Ainsi, le traitement rétro-orbital avec des complexes fraîchement générés a été administrée tous les 3 jours, induisant soutenue ITSN KD tout au long de l&#39;étude 4. tissus de souris recueillies en plusieurs points du temps post-siRNA ITSN ont été soumis à des analyses en microscopie électronique (EM) pour évaluer les effets de la chronique KD ITSN, dans l&#39;endothélium pulmonaire. Imagerie EM à haute résolution nous a permis d&#39;évaluer les changements morphologiques causés par KDITSN dans le lit vasculaire pulmonaire (c. rupture de la barrière endothéliale, le nombre de cavéoles et la régulation positive des voies alternatives de transport a diminué), les caractéristiques non détectables par microscopie optique. Globalement, ces résultats ont établi un importantTANT rôle de ITSN-1 dans la fonction EC et l&#39;homéostasie du poumon, tout en illustrant l&#39;efficacité de la livraison de siRNA-liposomes in vivo.

Taux de protéines ITSN-1 et l&#39;ARNm ont été contrôlés à plusieurs points de temps après la livraison de siRNA ITSN par Western blot et PCR classique et quantitative en 4. Taux de protéines ITSN-1 et l&#39;ARNm dans les poumons siRNA ITSN traités souris étaient environ 75% plus faible par rapport aux contrôles pendant knockdown continue de ITSN-1 pendant 21 jours. Sans ITSN-1s, dynamin-2, un premier partenaire d&#39;interaction du lecteur ITSN-1 et essentiel dans ...

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Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Des injections répétées rétro-orbitaires de complexes cationiques liposomes/siRNA/ITSN-1s chez la souris, toutes les 72 heures pendant 24 jours, fournir efficacement le duplex de siRNA à la microvascularisation pulmonaire de la souris réduire ARNm ITSN-1 et l&#39;expression des protéines de 75%. Cette technique est hautement reproductible dans un modèle animal, n&#39;a pas d&#39;effets indésirables et évite les accidents mortels.

Taire à long terme de intersectine-1 dans les poumons de souris par livraison répétée d&#39;un siRNA spécifique via des liposomes cationiques. Évaluation des effets de sacrifiés par microscopie électronique

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.6K vues.  Rush University. Des injections répétées rétro-orbitaires de complexes cationiques liposomes/siRNA/ITSN-1s chez la souris, toutes les 72 heures pendant 24 jours, fournir efficacement le duplex de siRNA à la microvascularisation pulmonaire de la souris réduire ARNm ITSN-1 et l'expression des protéines de 75%. Cette technique est hautement reproductible dans un modèle animal, n'a pas d'effets indésirables et évite les accidents mortels.

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Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Cellules d&#39;imagerie à long terme des mammifères en utilisant la microscopie à champ large

Recherche

Biologie

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

Multicouche de montage pour à long terme Fiche microscopie optique de poisson zèbre

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualisation de l&#39;ATP synthase dimères dans les mitochondries par cryo-tomographie

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

In Vivo transfection de siRNA et Gene Knockdown dans la moelle épinière via rapide non invasive lombaire intrathécale injections chez des souris

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

Cryo-microscopie électronique à la préparation des échantillons au moyen d&#39;un faisceau d&#39;ions focalisés

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused throughout tissues made of diverse cell types, such as enteroendocrine cells of the intestinal epithelium. These gastrointestinal sensors of food and bacteria have been difficult to study because they are dispersed among other epithelial cells at a ratio of 1:1,000. Recently, transgenic reporter mice have been generated to identify enteroendocrine cells by means of fluorescence. One of those is the peptide YY-GFP mouse. Using this mouse, we developed a method to correlate confocal and serial block-face scanning electron microscopy. We named the method cocem3D and applied it to identify a specific enteroendocrine cell in tissue and unveil the cell&#8217;s ultrastructure in 3D. The resolution of cocem3D is sufficient to identify organelles as small as secretory vesicles and to distinguish cell membranes for volume rendering. Cocem3D can be easily adapted to study the 3D ultrastructure of other specific cell types in their native tissue.

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

Corrélative confocale et microscopie électronique 3D d&#39;une cellule sensorielle spécifique

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal glucocorticoïdes Analyse: Surveillance surrénale non invasive en Equidés

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Meiotic évaluation de la broche dans la souris ovocytes par silençage siRNA médiation

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Préparation des échantillons et l’imagerie des Exosomes par microscopie électronique à Transmission

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...