Les auteurs tiennent à remercier Tom Robinson pour la relecture du manuscrit, C. Bärtschi et H. Benz pour la construction du système de contrôle de pression sur mesure. Nous tenons également à souligner l&#39;utilisation de la salle blanche PREMIER et le Centre de microscopie lumineuse (LMC), à la fois à l&#39;ETH Zürich. Le travail a été financé par Merck Serono et le Conseil européen de la recherche (ERC) dans le cadre du 7ème programme-cadre (ERC Starting Grant, projet no. 203428, nμLIPIDs).

Une. SU-8 de fabrication de Maître Préparer deux moules maîtres pour les canaux (fluidiques et de contrôle, pour les schémas et les dimensions, voir la figure 2) avec le protocole suivant, mais avec des schémas de masquage. Le procédé est représenté sur la figure 3a. <ol><li> Commencer par chauffage d&#39;une tranche de silicium de 4 pouces pendant 10 min à 180 ° C. Chargez la plaquette déshydraté sur un spin-coater et utiliser le protocole suivant pour spin-coating SU-8 2015: <ol><li> Spin plaquette à 100 tours par minute pendant 20 s (couvercle ouvert de spin-coater, distribuer SU-8 au cours de cette étape, fermer le couvercle après la distribution). </li><li> Spin plaquette à 500 rpm pendant 10 secondes (cela se généralise la résine sur toute la plaquette). </li><li> Spin tranche à 1750 tpm pendant 30 sec (définit la hauteur de la résistance à 20 um). </li></ol></li><li> Retirer résister à partir du bord de la plaquette avec de l&#39;acétone (utiliser un coton-tige) comme ce sera contraire s&#39;en tenir à la plaque de cuisson à l&#39;étape suivante. Transférer la tranche de ahotplate à 95 ° C et de la chaleur pendant 4 min. Après la cuisson douce, exposer la résine photosensible à travers un photomasque collé sur le verre sodocalcique dans un aligneur de masque avec une lumière UV (150 mJ / cm 2, mesurée à 365 nm). </li><li> Après l&#39;exposition, la plaquette chauffer à nouveau à 95 ° C pendant 5 minutes sur une plaque chauffante. Refroidir la plaquette à température ambiante et ensuite, plonger dans un bain de SU-8 développeur pendant 4 min. Secouer doucement pour enlever non exposée SU-8. Laver la tranche avec salle blanche classe isopropanol et sécher avec de l&#39;azote. Vérifiez sous un microscope si le développement a été un succès (en particulier les pièges de cellules). Si les cellules piégées sont complètement développés, la réflexion de la tranche de silicium doit être visible. Si nécessaire, de développer de nouveau sur la plaquette pendant quelques minutes. </li><li> Faire cuire la plaquette dans un four pendant 2 heures à 180 ° C pour éliminer tout solvant résiduel. Vérifiez la hauteur des canaux avec un profileur de l&#39;étape. Si la hauteur est différente de la hauteur désirée, répéter ce protocole à partir de l&#39;étape 1.1 avec une nouvelle plaquette etchanger le spin-vitesse (étape 1.1.3). Finaliser la fabrication du moule maître par silanisation avec la plaquette 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorodécyl-dimethylchloro-silane dans un dessiccateur pendant une nuit. </li></ol> 2. Fabrication de maître pour l&#39;impression par microcontact <ol><li> Afin de préparer des moules maîtres pour l&#39;impression par microcontact, déshydrater une plaquette de silicium pendant 10 min à 180 ° C. Spin-manteau 1 ml HDMS sur cette plaquette à 7500 tours par minute pendant 30 secondes (la résine adhère mieux sur une surface silanisée). Spin-manteau 2 ml de AZ1518 résistent positive avec ce protocole: <ol><li> Distribution statique du résist sur la plaquette. </li><li> Spin tranche de 5 secondes à 500 rpm. </li><li> Spin tranche de 60 sec à 4000 rpm. </li></ol></li><li> Après une cuisson douce 50 sec à 100 ° C sur une plaque chauffante, d&#39;exposer la résine photosensible à la lumière UV (21 mJ / cm 2 à 365 nm) à travers un photomasque et sur ​​un aligneur de masque. Développer la résistance dans un bain de AZ 726 pour 75 sec. Rincer la plaquette développé avec de l&#39;eau déminéralisée et coup dry avec de l&#39;azote. Éliminer le solvant résiduel par chauffage de la plaquette à 115 ° C pendant 50 sec. Silaniser la plaquette sous vide pendant une nuit. </li></ol> 3. Fabrication de la puce microfluidique Une conception d&#39;un dispositif à deux couches est utilisé pour ces expériences. Les deux couches sont préparées séparément et sont liés ensemble, avant que la puce est enfin collé sur une lame de verre (Figure 3b). Cette étape décrit la production de couches de PDMS et le timbre de PDMS pour l&#39;impression par microcontact. <ol><li> Préparer un mélange 10:01 de PDMS et d&#39;agent de durcissement. Préparez environ 80 g PDMS au total (en utilisant nos conceptions, cela se traduira par 10 jetons). Mélanger vigoureusement les deux parties et dégazer le PDMS jusqu&#39;à ce que le mélange soit sans bulles (~ 30 minutes). </li><li> Placez la tranche de la couche de contrôle à l&#39;intérieur d&#39;une boîte de Pétri avec du ruban adhésif sur le fond. Ensuite, versez ~ 50 g de PDMS sur le dessus et mettre la plaque pendant au moins 2 heures dans un four à 80 ° C pour assurer complètedurcissement du PDMS. Répétez la même procédure pour la tranche d&#39;impression par microcontact, pour cette ~ 20 g PDMS est nécessaire. </li><li> Spin-manteau PDMS sur la plaquette avec la couche de fluide à une vitesse de rotation de 2000 tours par minute pour former une couche d&#39;environ 40 um à haute PDMS. Guérir les PDMS dans un four pendant au moins 1 heure à 80 ° C. </li><li> Lorsque les deux parties sont guéris, enlever la couche de contrôle de la plaquette et les couper en morceaux avec une lame de rasoir. Percer des trous de connexion de la pression à l&#39;aide d&#39;un perforateur de biopsie de 1 mm. Pour le stockage, il est conseillé de mettre un morceau de ruban adhésif sur les canaux. </li><li> Pour lier les deux couches, prendre la tranche de spin-enduit et la partie supérieure et les placer dans un nettoyeur de plasma 23. Après un traitement au plasma, aligner rapidement les deux parties sous un microscope avec une grande distance de travail. Ajouter des PDMS de rechange autour des parties supérieures placées. Cette étape n&#39;est pas obligatoire, mais il facilite l&#39;élimination des PDMS à partir de la plaquette. Placer la plaquette dans une étuve à 80 ° C pendant au moins 1 h. </li><li> Utiliser un scalpel pour enlever soigneusement les PDMS de la plaquette et de couper les puces. Poinçonner des trous d&#39;accès pour les connexions fluidiques avec une biopsie poinçon de 1,5 mm. </li><li> La puce PDMS est maintenant terminée et peut être stocké pendant des mois. Facultatif: Si la puce est utilisée avec un réservoir, couper la partie supérieure d&#39;un embout de pipette 200 pi et d&#39;utiliser certaines de rechange, PDMS semi-durci à coller sur le dessus. Mettre la puce à nouveau dans le four à 80 ° C pendant au moins 1 heure. </li></ol> 4. Collage de verre diaporama Pour utiliser le dispositif pour les essais enzymatiques directs, la seule étape nécessaire après le collage est le blocage de surfaces. Pour ce protocole, procédez à A. Toutefois, pour utiliser la puce microfluidique pour des dosages immunologiques ou ELISA, s&#39;il vous plaît se référer à protocole B à restreindre les sites de liaison seulement à la lame de verre (pour la microscopie TIRF ou SPR). Si cette restriction n&#39;est pas important, reportez-vous à A, mais utiliser conjugués biotinylés à l&#39;étape 4.3 et passez à l&#39;étape 4.8dans le protocole B pour créer une surface entièrement fonctionnel. Avant d&#39;effectuer le protocole A et B: Il est conseillé de filtrer toutes les solutions de protéines utilisés avant de les introduire dans la puce. Débris et de protéines agrégats peuvent sinon bloquer pièges cellulaires, réduisant ainsi le nombre de chambres qui peuvent être utilisés pour l&#39;analyse. Pour ce faire, utiliser un appareil de filtre d&#39;adsorption non protéique pour filtrer toutes les solutions avant de les introduire dans les canaux. Protocole A (tests enzymatiques) <ol><li> Pour finaliser le dispositif microfluidique, lier les parties PDMS sur une lame de verre. Pour ce faire, d&#39;abord nettoyer une lame de verre avec du savon, de l&#39;eau distillée et d&#39;éthanol. Sécher la lame à l&#39;aide d&#39;un courant d&#39;azote. Nettoyer la partie PDMS avec du scotch. </li><li> Mettez la partie PDMS et la lame de verre nettoyé dans le filtre à plasma pendant 45 secondes à 18 W. Pour assurer une liaison étanche, mettre la puce sur une plaque chaude (100 ° C) pendant 5 min. </li><li> Après collage, remplissez la puce avec fLUID. Un moyen facile d&#39;y parvenir est d&#39;utiliser la force centrifuge. Couper la partie inférieure de 200 pi pointe de la pipette. Pour les canaux fluidiques, les remplir avec la solution de blocage (albumine de sérum bovin (4% p / v) ou la poly-L-lysine) de polyéthylène glycol greffé (0,05% p / v) et de placer les pointes dans les entrées. Remplissez les entrées de la couche de contrôle avec de l&#39;eau ou avec une solution iso-osmotique, par exemple PBS. Placer la puce dans la centrifugeuse (800 x g) pendant 5 min. Les chaînes doivent être maintenant remplis de liquide complètement. Si pas, répétez cette étape. </li><li> Incuber la solution de blocage pendant au moins 30 min à température ambiante. Laver la solution hors de la couche de fluide avec du PBS à un débit de 10 ul / min en utilisant une pompe à seringue. Le dispositif est maintenant prêt pour des expériences cellulaires. </li></ol> Protocole B (immunoessais) Pour un aperçu complet de la modification de surface de l&#39;étape 4.7 partir, s&#39;il vous plaît se référer au tableau 1. <ol start="5"><li> DansPDMS cubate timbres pour l&#39;impression par microcontact avec une solution BBSA / BSA (par exemple 1-100). Après 30 minutes, nettoyer les timbres avec de l&#39;eau distillée et sécher le timbre sous un courant d&#39;azote. Placez rapidement les timbres sur une lame de verre nettoyée (figure 4). </li><li> Exposer la lame de verre avec le tampon en même temps que la partie supérieure de la puce microfluidique à un plasma d&#39;oxygène pendant 45 secondes à la puissance maximale (18 W) dans un filtre à plasma. Après le traitement de plasma, retirez le timbre et aligner la surface imprimée sous les microchambres de l&#39;appareil. Placez la puce pendant 30 min sur une plaque chaude à 50 ° C. </li><li> Pour bloquer la surface restante, introduire une solution stérilisée par filtration de BSA (4% (p / v) dans du PBS) dans la puce avec une centrifugeuse (voir étape 4.2). Incuber pendant 1 heure et laver la solution de la couche de fluide avec du PBS (voir l&#39;étape 4.3). La puce peut alors être utilisé directement ou stocké pendant jusqu&#39;à 2 semaines à 4 ° C dans une boîte humide. </li><li> Pour un surfactant liaison entièrement fonctionnele, introduire l&#39;avidine (0,025% (p / v) dans du PBS) dans le réservoir. Utiliser un débit de 5 ul / min pendant 30 minutes pour retirer la solution de l&#39;avidine par l&#39;intermédiaire des canaux de fluide. Ensuite, rincez PBS pendant 10 min. Rincer soigneusement le réservoir. </li><li> Ensuite, ajouter la protéine G (0,0025% (p / v) dans du PBS) et rincer pendant 30 minutes supplémentaires. Laver avec du PBS pendant 10 minutes supplémentaires après. Ensuite, ajouter l&#39;anticorps d&#39;intérêt (0,0001% (p / v) dans du PBS) pendant 10 min. Après 10 min, arrêter l&#39;écoulement pendant 15 min pour permettre la liaison. Ensuite, laver avec du PBS pendant 10 min. </li></ol> 5. expériences sur les cellules Le protocole est écrit d&#39;une manière générale en raison de la variété de dosages possibles. A titre d&#39;exemple les réactifs nécessaires pour le test de toxicité sont donnés G6PDH. Le rendement initial de piégeage de cellule de l&#39;appareil est d&#39;environ 2,5%, soit 5 sur 200 cellules seront pris au piège. L&#39;occupation définitive des cellules piégées dépend fortement de la lignée cellulaire utilisée, le protocole de suspendrela lignée cellulaire et le moment où les cellules sont vidées par l&#39;intermédiaire du canal. Pour les cellules qui poussent naturellement en suspension (telles que U937), des cellules individuelles peuvent être trouvés dans environ 75% des chambres au bout de quelques minutes. Les autres chambres sont soit pas remplies, ou occupés par deux ou plusieurs cellules. En général, le taux d&#39;occupation à cellule unique est plus petite pour les lignées cellulaires adhérentes. Lors de l&#39;utilisation du protocole de mise en suspension plutôt légère présentée ici, le pourcentage diminue à environ 30% (HEK, les cellules MLT). Le maximum de l&#39;unité de cellules peut être amélioré par traitement à la trypsine des cellules, mais ce peut également modifier les résultats des expériences. En fonction de la molécule cible, l&#39;adsorption ou l&#39;absorption de PDMS peuvent influencer les résultats. L&#39;adsorption peut être réduite par les surfaces de blocage avec BSA ou PLL-g-PEG. L&#39;absorption est peu probable pour la plupart des biomolécules hydrophiles, mais il doit être vérifié pour les (petits) composants cellulaires lipophiles. <ol><li> Préparer les cellules selon le protocole spécifique (par exemple, </em&gt; de la toxicomanie). Pour les cellules en suspension, ajouter les cellules directement à la puce. Pour les lignées de cellules adhésives, en utilisant un tampon de dissociation sans enzyme pour produire une suspension de cellules. Filtrer les cellules avant de les introduire à la puce afin de réduire la quantité d&#39;agrégats de cellules. </li><li> Charger les cellules sur la puce en utilisant une pompe à seringue et l&#39;écoulement vers l&#39;avant, plutôt que de retirer la suspension de cellules. Utiliser un débit de 5 pl / min pour des lignées de cellules en suspension et des débits plus élevés de 10 à 20 pl / min pour les cellules adhérentes car écoulement pour réduire la fixation non spécifique des cellules sur les parois du canal. </li><li> Lorsque les pièges sont remplis, fermez les chambres. Si de nombreuses cellules adhèrent non spécifique à la surface, essayez de les laver avec un tampon de dissociation cellulaire à un débit de 10-30 l / min. </li></ol> Protocole A (tests enzymatiques) <ol start="4"><li> Retirer le tampon de lyse par la puce. Pour cet exemple, ce tampon est un tampon hypo-osmolaire ajoutée avec du Tween 20 (10 mM Tris-HCl, 10mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, 1% (v / v) de Tween 20). Pour la lyse, les chambres s&#39;ouvrent et se ferment rapidement (soit 500 ms pour les débits de 10-50 l / min 7,21). Pour le dosage de la G6PDH, ajouter 2 mM de glucose-6-phosphate, NADP mM 0,5, 0,5 U / ml de diaphorase et de 0,3 mM de la résazurine dans le tampon de lyse. Commencer à surveiller la réaction cinétique immédiatement après la lyse. </li></ol> Remarque: Choisir tout tampon qui est adapté pour le dosage, cependant nu à l&#39;esprit que des détergents forts (tels que Triton, SDS) lyser les cellules seront immédiatement et conduire à une perte de l&#39;analyte lors de l&#39;ouverture de la chambre. Protocole B (immunoessais) Pour une brève description des expériences ELISA cellulaires (débits, l&#39;état de la chambre, etc), s&#39;il vous plaît se référer au tableau 1. <ol start="5"><li> Pour ELISA, ajouter le réactif de détection requis (par exemple l&#39;anticorps secondaire, un antigène marqué) directement vers le tampon de lyse. Le présent document a ajouté Tween 20 réduit l&#39;adsorption non spécifique. Lyse des cellules selon l&#39;étape 5.4. Incuber le mélange pendant 10-15 minutes pour permettre la liaison (temps d&#39;incubation en fonction de l&#39;antigène et de l&#39;anticorps utilisé). </li><li> Conjugués enzymatiques d&#39;anticorps qui adsorbées de façon non spécifique pour les parois des canaux peuvent conduire à une conversion du réactif de détection déjà à l&#39;intérieur du réservoir et les canaux. Pour réduire les problèmes de cette adsorption, rincer un inhibiteur de l&#39;enzyme permanent de détection utilisée par la puce pendant la période d&#39;incubation (chambres fermées, avant d&#39;ajouter le réactif de détection). Pour HRP, utiliser HCl 20 mM dans l&#39;eau pour inactiver les enzymes en permanence non spécifiquement adsorbées. </li><li> Après le temps d&#39;incubation, à introduire le réactif de détection (par exemple Amplex Red et du peroxyde d&#39;hydrogène pour HRP) à la puce. Ouvrez les chambres peu nouveau pour laver l&#39;anticorps secondaire nonbound loin et d&#39;ajouter le réactif de détection. Commencer à surveiller la réaction cinétique immédiatement. </li><li> Calibration: Immobiliserl&#39;anticorps dirigé contre la cible d&#39;intérêt. Fermer chambres. Préparer différentes concentrations de l&#39;analyte dans un tampon ou dans un lysat de cellules hors de la puce. Appliquer une concentration de la puce et échanger rapidement le volume à l&#39;intérieur des chambres (500 ms de temps d&#39;ouverture). Ce temps d&#39;ouverture est suffisamment courte pour assurer que se produit pas d&#39;accumulation supplémentaire de rinçage analyte, et seulement un nombre spécifique de molécules à partir du volume de la microchambre est détectée. De la concentration connue de l&#39;antigène à l&#39;intérieur de la solution et le volume de la chambre (625 pl), de calculer le montant à l&#39;intérieur de la chambre. Ensuite, passez à l&#39;étape 5.5 et introduire le fragment de détection. </li></ol>

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	<li>Walling, M. A., Shepard, J. R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+heterogeneity+and+live+cell+arrays.">Cellular heterogeneity and live cell arrays.</a> Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).</li><li>Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+biological+single+cell+analysis.">Chemical and biological single cell analysis.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).</li><li>Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+single+cell+analysis:+from+promise+to+practice.">Microfluidic single cell analysis: from promise to practice.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).</li><li>Faley, S., Seale, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+platform+for+real-time+signaling+analysis+of+multiple+single+T+cells+in+parallel.">Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel.</a> Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).</li><li>Huang, B., Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell.">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li><li>Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+enzyme+concentrations,+kinetics,+and+inhibition+analysis+using+high-density+hydrodynamic+cell+isolation+arrays.">Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays.</a> Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).</li><li>Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyphenated+optical+trap+capillary+electrophoresis+laser+induced+native+fluorescence+system+for+single-cell+chemical+analysis.">A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis.</a> Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).</li><li>Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microchamber+array+for+single+cell+isolation+and+analysis+of+intracellular+biomolecules.">A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules.</a> Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).</li><li>Agresti, J. J., Antipov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-throughput+screening+in+drop-based+microfluidics+for+directed+evolution.">Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).</li><li>Ma, C., Fan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinical+microchip+for+evaluation+of+single+immune+cells+reveals+high+functional+heterogeneity+in+phenotypically+similar+T+cells.">A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells.</a> Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).</li><li>Shi, Q., Qin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells.">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).</li><li>Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+profiling+of+circulating+tumor+cells:+transcriptional+heterogeneity+and+diversity+from+breast+cancer+cell+lines.">Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines.</a> PLoS ONE. 7 (5), e33788 (2012).</li><li>Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+polarity,+stem+cells+and+cancer.">Epithelial cell polarity, stem cells and cancer.</a> Nature. 12 (1), 23-38 (2012).</li><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography.">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li><li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration.">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298 (5593), 580-584 (2002).</li><li>Gao, Y., Majumdar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+valve-enabled+microfluidic+cell+co-culture+platform+and+demonstration+of+its+applications+to+neurobiology+and+cancer+biology.">A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology.</a> Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).</li><li>White, A. K., VanInsberghe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+microfluidic+single-cell+RT-qPCR.">High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).</li><li>Schwanh&#228;usser, B., Busse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).</li><li>Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+real+time+analysis+of+protein+secretion+from+single+cells.">Towards real time analysis of protein secretion from single cells.</a> Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).</li><li>Huang, Y., Cai, D., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-+and+Nanotechnologies+for+Study+of+Cell+Secretion.">Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion.</a> Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).</li><li>Huang, N. T., Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+microfluidic+platform+for+in+situ+cellular+cytokine+secretion+immunophenotyping.">An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping.</a> Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).</li><li>Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., K&#252;ster, S. K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+enzyme-linked+immunosorbent+assays+on+a+microfluidic+chip+to+quantify+intracellular+molecules+in+single+cells.">Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells.</a> Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 .</li><li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic.">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).</li><li>Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+housekeeping+gene+encoding+glucose+6-phosphate+dehydrogenase+(G6PD):+G6PD+is+dispensable+for+pentose+synthesis+but+essential+for+defense+against+oxidative+stress.">Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress.</a> EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

technologie microfluidique a ouvert des possibilités nouvelles et fascinantes pour l&#39;analyse unicellulaire. En particulier, la possibilité de piéger et d&#39;immobiliser les cellules individuellement par des outils microfluidiques a permis des études systématiques à court et à long terme sur les propriétés unicellulaires et réponse. De plus, l&#39;encapsulation des cellules dans des micro-gouttelettes de fréquences élevées, générées sur une puce, a permis des études de sécrétion des cellules simpl...

De nombreuses études dans le passé ont révélé des différences de cellule à cellule dans une grande population de cellules 1-3, en particulier les processus de signalisation 4, ou les quantités de biomolécules telles que les protéines intracellulaires 5,6, des métabolites et des cofacteurs 7,8. Ces hétérogénéités sont considérés comme d&#39;une importance fondamentale pour l&#39;adaptation de la cellule et de l&#39;évolution 9, mais aussi jouer un rôle clé dans l&#39;émergence et le traitement de maladies telles que le cancer 10-13. Par conséquent, les études sur le niveau de la cellule sont d&#39;un grand intérêt dans la recherche biologique et pharmacologique, en particulier si ces études révèlent les différentes réponses cellulaires après traitement avec des substances chimiques bioactives. Au cours des dernières années, plusieurs plates-formes d&#39;analyse ont été mises au point qui facilite l&#39;analyse des cellules vivantes simples ou la composition chimique du contenu des cellules. Bien cellulaire activé par fluorescence (FACS) est l&#39;or standard pour analyse à très haut débit de cellules vivantes individuelles, le procédé ne peut pas être utilisé pour la quantification des composés intracellulaires ou sécrétées. L&#39;émergence de plates-formes microfluidiques a promis stratégies d&#39;analyse nouveaux pour le positionnement, le traitement et l&#39;observation des cellules individuelles. Une étape importante dans la microfluidique a été conclu avec l&#39;intégration des vannes flexibles PDMS réalisés par Quake et collègues 14,15. Ces vannes sont utiles car ils peuvent isoler des régions sur la puce, par exemple séparer deux cultures 16. En outre, ils sont particulièrement applicable pour l&#39;analyse d&#39;une seule cellule et d&#39;aider à réduire les problèmes de dilution analyte donc. La puissance de cette approche pour l&#39;analyse unicellulaire a été démontré récemment par Hansen et ses collègues, qui ont analysé l&#39;expression des gènes de centaines de cellules uniques en parallèle 17. Lorsque le ciblage des protéines et des métabolites, l&#39;analyse est très difficile en raison de l&#39;absence d&#39;un convenableModes de mplification, le grand nombre de différents composés présents, et de leurs variations de nature chimique. En outre, la plupart des biomolécules intracellulaires sont tenus d&#39;être présents à faible nombre de copies de l&#39;ordre de quelques dizaines de milliers 18, où la méthode d&#39;analyse utilisée doit avoir une haute sensibilité. Des dosages plus puissants, tels que des dosages immunologiques et des dosages immunoenzymatiques (ELISA) sont difficiles à intégrer dans des dispositifs microfluidiques, car ils nécessitent plusieurs étapes de lavage et d&#39;incubation ainsi que l&#39;immobilisation de surface. En raison de ces défis, il n&#39;est pas surprenant que seuls quelques exemples ont été signalés où des protéines ou des métabolites ont été quantifiés sur le niveau de la cellule. Par exemple, des études sur la sécrétion de composés fluorescents ont été rapportés 19,20. Récemment, la mise en œuvre par ELISA a été présenté pour l&#39;analyse des sécrétées (non fluorescentes) des protéines à partir d&#39;une culture cellulaire (cellules THP-1) 21 et seul (immune) cellules 10. Le ciblage des protéines intracellulaires, Shi et al. Mis au point un dispositif microfluidique qui a facilité l&#39;identification des protéines intracellulaires pour l&#39;analyse des voies de signalisation des cellules tumorales au moyen d&#39;un immuno-essai 11. Cependant, seules des quantités relatives de protéines ont été déterminées et aucune amplification enzymatique a été utilisée pour augmenter le signal pour les protéines de faible abondance. Récemment, nous avons été en mesure de combiner un micro-dispositif de piégeage seule cellule avec des essais de fluorescence 8 et immunoessais 22 (Figure 1). Les cellules sont passivement piégés dans des structures de haies micronisée, qui permettent l&#39;approvisionnement et l&#39;échange de milieu et d&#39;autres agents chimiques, sans aucun mouvement des cellules (rapide). Une soupape en forme d&#39;anneau autour de chaque piège permet l&#39;isolement de la cellule dans un très petit volume (&quot;la microchambre&quot;). Cette vanne est actionné immédiatement après l&#39;introduction d&#39;un tampon de lyse cellulaire (hypoosmolaire), ilnce prévenir molécules intracellulaires ou molécules sécrétées à diffuser à distance. Plus important, en raison de la petite taille du volume (625 pl) à grande dilution des molécules est évitée. En outre, étant donné que la lyse et l&#39;analyse sont effectuées dans la même position dans la puce, il n&#39;y a pas de perte d&#39;analytes dues au transport. La conception de la puce décrite ici comprend 8 rangées alternées de soit 7 ou 8 microchambres, totalisant 60 microchambres. Les chambres sont actionnés en rangées, de sorte que la contamination croisée le long d&#39;une ligne est exclue. La plate-forme peut être utilisée en combinaison avec des essais de fluorescence, ainsi que des dosages immunologiques (figure 1d). Dans ce dernier cas, nous avons établi des protocoles pour l&#39;immobilisation des anticorps, qui sont compatibles avec la production de puces et le processus d&#39;assemblage. D&#39;où la plate-forme ouvre la voie à des méthodes sensibles, fiables et quantifiables au niveau de la cellule unique. Jusqu&#39;à maintenant, nous avons utilisé le dispositif pour l&#39;analyse des ienzymes sécrétées (ntracellular et quantification relative par dosages enzymatiques), des cofacteurs intracellulaires, des protéines et des petites molécules (de quantification absolue par des analyses de point de terminaison ou ELISA). Dans ce qui suit, nous décrirons le processus de fabrication de puces au moyen de la lithographie molle multicouche et les protocoles pour la structuration des anticorps au moyen de l&#39;impression par microcontact et la chimie de surface. De plus, quelques exemples d&#39;utilisation de la puce et les opérations sont donnés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="884">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">REAGENTS:</td>
			<td style="width:284px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:344px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:284px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:153px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">SU-8 2015</td>
			<td style="width:284px;">MicroChem Corp. (Netwon, MA)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane</td>
			<td style="width:284px;">ABCR (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">AB103608</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">4-Methylumbelliferyl &#946;-D-N,N&#8242;-diacetylchitobioside hydrate</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">M9763</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Acetone</td>
			<td style="width:284px;">Merck VWR (Darmstadt, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">100014</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Avidin</td>
			<td style="width:284px;">AppliChem (Axon Lab AG)</td>
			<td style="width:103px;">A-2568</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">AZ 1518</td>
			<td style="width:284px;">AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">AZ 726 developer</td>
			<td style="width:284px;">AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">A-4503</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Bovine serum albumin, biotin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">A-8549</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Cell dissociation buffer</td>
			<td style="width:284px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">13151-014</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Hexamethyldisilazane (HDMS)</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">40215</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:284px;">Fluka</td>
			<td style="width:103px;">84422</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:284px;">Merck VWR (Darmstadt, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">109634</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:284px;">Fluka</td>
			<td style="width:103px;">63068</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">MR developer 600</td>
			<td style="width:284px;">Microresist technology GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">PBS</td>
			<td style="width:284px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">10010-031</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">PLL-g-PEG grafted</td>
			<td style="width:284px;">SuSoS, (D&#252;bendorf, Switzerland)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">PLL-g-PEG grafted biotin</td>
			<td style="width:284px;">SuSoS, (D&#252;bendorf, Switzerland)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:284px;">Fluka</td>
			<td style="width:103px;">60132</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Protein G, biotin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Fine Chemicals</td>
			<td style="width:103px;">41624</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Silicon wafer</td>
			<td style="width:284px;">Si-Mat (Kaufering, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td style="width:284px;">Dow Corning</td>
			<td>39100000</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td style="width:284px;">Biorad</td>
			<td style="width:103px;">1610716</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Tween 20</td>
			<td style="width:284px;">Biorad</td>
			<td style="width:103px;">1706531</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:344px;">Material Name</td>
			<td style="width:284px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:153px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">0.22 &#181;m PES syringe filter</td>
			<td style="width:284px;">TRP</td>
			<td style="width:103px;">99722</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">1/1.5 mm biopsy puncher</td>
			<td style="width:284px;">Miltex, York PA</td>
			<td style="width:103px;">33-31AA/33-31A</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Cell Trics filter 20 &#181;m</td>
			<td style="width:284px;">Partec</td>
			<td style="width:103px;">04-004-2325</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Centrifuge Sigma 3-18K</td>
			<td style="width:284px;">Kuehner</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Hotplate HP 160 III BM</td>
			<td style="width:284px;">Sawatec, Sax, Switzerland</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">MA-6 mask aligner</td>
			<td style="width:284px;">Karl Suess</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Multizoom AZ100M microscope</td>
			<td style="width:284px;">Nikon Corporation</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Photomask</td>
			<td style="width:284px;">Microlitho, Essex, U.K.</td>
			<td style="width:103px;">n.a</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Plasma Cleaner PDC-32G</td>
			<td style="width:284px;">Harrick</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE</td>
			<td style="width:284px;">Laurell</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Spin Modules SM 180 BM</td>
			<td style="width:284px;">Sawatec, Sax, Switzerland</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Step profiler Dektak XT Advanced</td>
			<td style="width:284px;">Bruker</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Syringe pump neMESYS</td>
			<td style="width:284px;">Cetoni</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells

On présente un dispositif microfluidique qui permet la détermination quantitative de plusieurs biomolécules intracellulaires dans des cellules individuelles en parallèle. A cette fin, les cellules sont piégées dans passivement au milieu d&#39;une microchambre. Lors de l&#39;activation de la couche de contrôle, la cellule est isolée du volume entourant dans une petite chambre. Le volume entourant peut alors être échangé sans affecter la cellule isolée. Toutefois, à la courte ouverture et la fermeture de la chambre, la solution dans la chambre peut être remplacé à quelques centaines de millisecondes. En raison de la réversibilité des chambres, les cellules peuvent être exposées à des solutions différentes de manière séquentielle dans un mode hautement contrôlable, par exemple pour l&#39;incubation, le lavage, et finalement, la lyse des cellules. Les microchambres hermétiques permettent le maintien du lysat, réduire et contrôler la dilution après lyse cellulaire. Depuis la lyse et l&#39;analyse se produisent au même endroit, haute sensibilité est conservée, car aucune autre dilution ou de la perte des analytes se produit pendant le transport. La conception de la microchambre permet donc l&#39;analyse fiable et reproductible de très petits nombres de copies de molécules intracellulaires (attomoles, zeptomoles) libérés à partir de cellules individuelles. En outre, de nombreuses chambres miniatures peuvent être disposés dans un format de réseau, ce qui permet l&#39;analyse de plusieurs cellules à la fois, étant donné que les instruments optiques appropriés sont utilisés pour la surveillance. Nous avons déjà utilisé la plate-forme pour les études de preuve de concept pour analyser les protéines intracellulaires, des enzymes, des cofacteurs et des seconds messagers manière quantifiable soit relative ou absolue.

Notre plate-forme est capable d&#39;analyser une série de intracellulaire ainsi que des molécules sécrétées présentes dans ou produit par des cellules individuelles. Ici, nous aimerions vous présenter les différentes études d&#39;exemple pour souligner la variété des tests possibles. Nous donnerons un exemple pour une enzyme sécrétée (figure 5a) ainsi que d&#39;une enzyme intracellulaire (Figure 5b) et de la protéine (Figures 5c et d). Po...

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A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Dans cet article, nous présentons une puce microfluidique pour l&#39;analyse d&#39;une seule cellule. Il permet la quantification des protéines intracellulaires, des enzymes, des cofacteurs, et des seconds messagers à l&#39;aide de dosages ou des dosages immunologiques par fluorescence.

Une puce microfluidique pour l&#39;analyse chimique polyvalente de cellules isolées

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

a-microfluidic-chip-for-versatile-chemical-analysis-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K vues.  ETH Zurich, Switzerland.  Dans cet article, nous présentons une puce microfluidique pour l'analyse d'une seule cellule. Il permet la quantification des protéines intracellulaires, des enzymes, des cofacteurs, et des seconds messagers à l'aide de dosages ou des dosages immunologiques par fluorescence. 

Vidéo: A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

Dispositif microfluidique pour Recréer un microenvironnement des tumeurs<em&gt; In vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Recherche

Bio-ingénierie

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science. Methods for particle trapping based on optical, magnetic, electrokinetic, and acoustic techniques have led to major advancements in physics and biology ranging from the molecular to cellular level. In this article, we introduce a new microfluidic-based technique for particle trapping and manipulation based solely on hydrodynamic fluid flow. Using this method, we demonstrate trapping of micro- and nano-scale particles in aqueous solutions for long time scales. The hydrodynamic trap consists of an integrated microfluidic device with a cross-slot channel geometry where two opposing laminar streams converge, thereby generating a planar extensional flow with a fluid stagnation point (zero-velocity point). In this device, particles are confined at the trap center by active control of the flow field to maintain particle position at the fluid stagnation point. In this manner, particles are effectively trapped in free solution using a feedback control algorithm implemented with a custom-built LabVIEW code. The control algorithm consists of image acquisition for a particle in the microfluidic device, followed by particle tracking, determination of particle centroid position, and active adjustment of fluid flow by regulating the pressure applied to an on-chip pneumatic valve using a pressure regulator. In this way, the on-chip dynamic metering valve functions to regulate the relative flow rates in the outlet channels, thereby enabling fine-scale control of stagnation point position and particle trapping. The microfluidic-based hydrodynamic trap exhibits several advantages as a method for particle trapping. Hydrodynamic trapping is possible for any arbitrary particle without specific requirements on the physical or chemical properties of the trapped object. In addition, hydrodynamic trapping enables confinement of a "single" target object in concentrated or crowded particle suspensions, which is difficult using alternative force field-based trapping methods. The hydrodynamic trap is user-friendly, straightforward to implement and may be added to existing microfluidic devices to facilitate trapping and long-time analysis of particles. Overall, the hydrodynamic trap is a new platform for confinement, micromanipulation, and observation of particles without surface immobilization and eliminates the need for potentially perturbative optical, magnetic, and electric fields in the free-solution trapping of small particles.

In this article, we present a microfluidic-based method for particle confinement based on hydrodynamic flow. We demonstrate stable particle trapping at a fluid stagnation point using a feedback control mechanism, thereby enabling confinement and micromanipulation of arbitrary particles in an integrated microdevice.

Un piège hydrodynamique microfluidique à base de particules uniques

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Méthodes de détection par fluorescence pour les plateformes microfluidiques gouttelettes

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

Une puce microfluidique pour ICPMS Présentation échantillon

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Le Multi-Chip organes - Une plate-forme microfluidique à long terme Coculture multi-tissus

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Électrotaxie l&#39;étude des cellules du cancer du poumon à l&#39;aide d&#39;un double-Multichannel champ électrique microfluidique Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

Co-culture de la vie microbiome avec Microengineered Human Intestinal Villi dans un Gut-on-a-Chip microfluidique périphérique

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other physical or chemical stimuli. They have been commonly used for in vitro cell studies by providing in vivo like surroundings. Especially, how cells response to chemical gradients, electrical fields, and shear stresses has drawn many interests since these phenomena are important in understanding cellular properties and functions. These microfluidic chips can be made of glass substrates, silicon wafers, polydimethylsiloxane (PDMS) polymers, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, or polyethyleneterephthalate (PET) substrates. Out of these materials, PMMA substrates are cheap and can be easily processed using laser ablation and writing. Although a few microfluidic devices have been designed and fabricated for generating multiple, coexisting chemical and electrical stimuli, none of them was considered efficient enough in reducing experimental repeats, particular for screening purposes. In this report, we describe our design and fabrication of two PMMA-based microfluidic chips for investigating cellular responses, in the production of reactive oxygen species and the migration, under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli. The first chip generates five relative concentrations of 0, 1/8, 1/2, 7/8, and 1 in the culture regions, together with a shear stress gradient produced inside each of these areas. The second chip generates the same relative concentrations, but with five different electric field strengths created within each culture area. These devices not only provide cells with a precise, controllable micro-environment but also greatly increase the experimental throughput.

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

Conception de dispositifs microfluidiques pour étudier les réponses cellulaires Sous simple ou Coexistence chimique / électrique / Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Une méthode polyvalente de patterning Les protéines et les cellules

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Établir des co-cultures à base de cellules uniques dans une manière déterministe avec une puce microfluidique

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...