Détermination des classes totales de lipides et de lipides dans les échantillons marins

Les méthodes décrites ici concernent des composés qui peuvent être définis opérationnellement comme des lipides marins. La base de cette définition est leur aptitude à l’extraction liquide-liquide dans des solvants organiques non polaires, ce qui fournit un moyen pratique de les séparer des autres composés dans une matrice aqueuse. Leur nature hydrophobe facilite leur isolement de l’eau de mer ou des spécimens biologiques, ainsi que leur enrichissement et l’élimination des sels et des protéines.

Pour les échantillons d’eau de mer, la première étape implique normalement la séparation en fractions dissoutes et particulaires définies opérationnellement, généralement par filtration. La fraction particulaire est celle retenue par les filtres, et la taille des pores est importante pour définir la coupure. À l’aide de pinces sans lipides, placez un filtre en fibre de verre de 47 millimètres qui a été éclampé sur un système de filtration propre aux lipides.

Prenez l’échantillon et faites-le tourbillonner doucement pour remettre en suspension les particules qui se sont déposées. Mesurez un volume connu. Le volume dépendra de la quantité de particules dans l’échantillon.

Lorsque le volume est mesuré, ajoutez de l’aspiration au système de filtration et mouillez doucement le filtre avec de l’eau de mer filtrée. Ajouter l’échantillon entier lentement à l’entonnoir de filtration et rincer le cylindre gradué avec de l’eau de mer pour s’assurer que toutes les particules sont ajoutées au filtre. Rincez l’entonnoir de l’appareil pour vous assurer que toutes les particules sont rincées sur le filtre.

Tirez tout le liquide à travers le filtre, mais ne laissez pas le filtre sécher, car il peut briser les cellules qui se trouvent sur le filtre. Prenez la pince à lèvres propre, pliez le filtre en deux, puis pliez-le en tiers une fois de plus, puis en deux dans le sens de la longueur. Le filtre est ensuite placé dans un flacon propre aux lipides.

Couvrir le filtre avec deux ml de chloroforme, coipre sous azote et sceller avec du ruban de téflon. À ce stade, l’échantillon sera stable en stockage à moins 20 degrés Celsius pendant un an. Préparation de l’échantillon.

Mesurer un volume connu du filtrat dans un cylindre gradué en verre propre aux lipides. Placez l’échantillon dans un entonnoir séparateur propre aux lipides et ajoutez environ 20 ml de chloroforme. Agiter ce mélange pendant au moins deux minutes en évasant fréquemment.

Après la première séparation, élimination du premier extrait et ajout d’acide. Après avoir secoué la solution pendant deux minutes, enveloppez l’entonnoir dans du papier d’aluminium et attendez que la séparation se produise, environ cinq minutes. Après avoir attendu la séparation, pelez le fond de la feuille d’aluminium pour voir les deux couches.

Recueillez la couche inférieure dans une fiole à fond rond propre aux lipides, en prenant soin de ne pas inclure la couche supérieure. Coimbez la fiole à fond rond sous l’azote et placez-la au congélateur. Récupérez l’entonnoir séparateur et ajoutez de l’acide sulfurique au liquide.

Ajouter 0,25 ml pour chaque litre d’eau de mer présent. Une fois l’acide sulfurique ajouté, agitez doucement l’eau de mer, puis ajoutez encore 10 ml de chloroforme et agitez vigoureusement tout en évasant pendant deux minutes supplémentaires. Ensuite, permettez la séparation.

Deuxième et troisième séparations. Ajouter à nouveau la couche inférieure à la fiole inférieure ronde sans inclure d’eau. Ajouter une troisième quantité de 10 ml de chloroforme et agiter pendant encore deux minutes avec la ventilation.

Après séparation, placer la dernière portion de chloroforme dans la même fiole et les extraits combinés peuvent être évaporés par évaporateur rotatif et transférés dans un flacon de deux ml. Coup monté. Pour la configuration de l’extraction, vous aurez besoin d’un récipient isotherme rempli de glace. Les solvants comprennent le chloroforme, l’eau extraite du chloroforme et le chloroforme-méthanol 2:1.

De cette solution, vous avez besoin d’environ un ml par échantillon, alors composez-le en conséquence. Tous ces solvants doivent être placés sur de la glace afin qu’ils soient froids au moment où les extractions sont commencées. Les échantillons vont également sur la glace afin que tout reste froid.

Broyage et extraction. Les échantillons ont été conservés congelés dans deux ml de chloroforme, alors ajoutez un ml de méthanol glacé ou une demi-pipe. Veillez lorsque vous ajoutez du méthanol à ne pas toucher le flacon avec la pipette.

Nettoyer et homogénéiser trois fois avec du méthanol et trois fois avec du chloroforme. Lors du broyage, veillez à ne pas couper le flacon d’extraction dans votre main au cas où vous cassez le flacon et à éviter de réchauffer l’échantillon. Broyer rapidement.

Une fois que l’échantillon a été complètement broyé, tenons-le dans de la glace et lavez toutes les particules restantes du broyeur dans le flacon à l’aide d’un ml de chloroforme-méthanol 2:1. Si nécessaire, utilisez un ensemble de pinces propres aux lipides pour forcer les particules à retourner dans le flacon avant le lavage. Veillez à ne pas toucher la pipette au broyeur ou le broyeur au flacon.

Ajoutez ensuite 0,5 ml ou un quart de pipette d’eau extraite du chloroforme sans toucher le broyeur ou le broyeur au flacon. Lorsque le broyeur a été lavé, touchez la goutte suspendue du broyeur au flacon. Coiuchez-le et conservez-le dans la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à soniquer.

Double pipetage. Après centrifugation, il y aura deux couches dans le flacon: les couches organiques et aqueuses. Pour obtenir la couche organique, la technique de double pipetage est utilisée.

Pour ce faire, une courte pipette de cinq centimètres avec l’ampoule mise lâchement est saisie entre l’index et le majeur. Poussez doucement la pipette à travers les deux couches tout en pressant l’ampoule, ce qui fait sortir des bulles jusqu’à la fin. Lorsque le bas de la deuxième couche est atteint, utilisez votre pouce pour retirer l’ampoule sans dessiner la couche organique dans la pipette.

Avec une pipette de neuf centimètres, pressez complètement l’ampoule. Placez l’extrémité longue du pipet dans le pipet de cinq centimètres et retirez la couche inférieure à travers le pipet de cinq centimètres. Cet extrait est ensuite placé dans un flacon propre aux lipides.

Continuez à enlever la couche inférieure jusqu’à ce qu’elle soit entièrement enlevée. Toutes les couches de pool dans le flacon lipid-clean. Lavage des pipettes.

Retirez l’ampoule de la pipette de neuf centimètres. Placez-le dans le flacon avec l’extrait dedans. Prenez une pipette de chloroforme propre, et sans toucher la pipette à celle qui est lavée, gicler le chloroforme autour de l’intérieur de la pipette.

Tournez doucement cette pipette pendant le lavage. Prenez une deuxième pipette de chloroforme et faites la même chose à l’extérieur de la pipette. Assurez-vous que tout le chloroforme coule le long de la pipette et dans le flacon d’extraction.

Lorsque vous avez terminé avec la pipette longue, prenez la pipe courte et répétez, mais lavez-la dans le flacon avec l’échantillon. Repérage d’un échantillon. Nettoyez une seringue avec du chloroforme.

Prendre un échantillon de volume connu et rincer la seringue dans l’échantillon. Tirez l’échantillon au-delà de la quantité que vous souhaitez repérer. Ensuite, ramenez le piston à la quantité que vous voulez en assurant l’absence de bulles d’air.

Utilisez le bouton pour distribuer 0,5 microlitre et touchez la goutte sur la tige. Laisser sécher avant de placer la goutte suivante au même endroit. Repérez tous les échantillons dans une ligne sur des tiges maintenues au-dessus de l’extrémité d’une plaque chauffante chaude.

Mise au point en acétone. La focalisation de l’échantillon se fait en 100% acétone. Ajouter environ 70 ml d’acétone au fond du réservoir de développement.

Prenez les deux racks et abaissez-les doucement dans le réservoir de développement. Observez le front du solvant pendant qu’il grimpe sur la tige jusqu’à ce que le bas de la tache fusionne avec le haut de la tache. Retirez les tiges.

Séchez-les pendant environ cinq secondes, puis répétez la procédure. Si les échantillons sont très concentrés, cette mise au point peut être effectuée une troisième fois. Premier système de développement.

Le premier système de développement se compose d’hexane, d’éther éthylique et d’acide formique à 98,5 à un à 0,5. Commencez par rincer trois fois un cylindre gradué avec de l’hexane et jetez-le. Remplissez le cylindre gradué un peu plus de 85 mls avec de l’hexane.

Utilisez ensuite une pipette et la bouteille d’hexane pour remplir le cylindre gradué à 90 mls. Ensuite, amenez le fond du ménisque à la ligne de 91 ml à l’aide d’éther éthylique, ce qui donnera un ml d’éther éthylique. Ajouter 0,5 ml d’acide formique à l’aide de la seringue Hamilton.

Mais rincez d’abord la seringue Hamilton trois fois avec l’acide formique pour vous assurer qu’il ne reste pas de chloroforme utilisé pour rincer l’échantillon de la seringue. Ajouter deux seringues complètes ou 25 microlitres à la fois pour un total de 50 microlitres. Il est important que l’acide formique soit immédiatement rincé de la seringue avec du chloroforme pour éviter de corroder le métal dans la seringue.

Une fois la seringue Hamilton propre, préparez la solution jusqu’à exactement 100 ml à l’aide d’hexane et d’une pipette. Puis coiuchez et inversez trois ou quatre fois. Versez environ 30 ml dans le réservoir de développement.

Utilisez ces 30 ml pour mouiller le papier et rincer le réservoir. Jetez la solution de rinçage. Ajouter les 70 ml restants dans le réservoir de développement.

Ajout de racks au système de développement. L’ajout de tiges au système de développement est le même pour chaque développement. Assurez-vous que la minuterie est réglée pour le moment où les tiges doivent être développées.

Et puis prenez les racks et abaissez-les doucement dans le réservoir. Observez jusqu’à ce que le front du solvant atteigne les points d’échantillonnage, puis démarrez la minuterie. Deuxième système de développement.

Le deuxième système de développement est l’hexane, l’éthylène et l’acide formique, de 79 à 20 à un. Donc, comme auparavant, rincez le cylindre gradué trois fois avec de l’hexane. Ajouter exactement 20 ml d’éther puis un ml d’acide formique, ce qui porte le volume à 21 mls.

Porter ensuite le volume à 100 mls avec de l’hexane. Ajouter environ 75 ml d’hexane à l’aide des pompes à bouteille. Et pour la portion, utilisez une pipette.

Coiuchez et inversez plusieurs fois. Ajouter environ 30 ml dans le réservoir de développement pour mouiller le papier et rincer le réservoir. Jeter les 30 mls.

Ajoutez les 70 restants et il est prêt pour l’ensemble des tiges. Troisième système de développement. Le troisième système de développement est un mélange de chloroforme, de méthanol et d’eau extraite du chloroforme, 50, 40 à 10.

Rincez le cylindre gradué trois fois avec du chloroforme. Ajouter environ 45 ml de chloroforme. À l’aide d’une pipette, porter le bas du ménisque à la marque de 50 ml.

Ajouter environ 38 ml de méthanol. Amenez le bas du ménisque à la ligne de 90 ml. Remplissez ensuite les 10 derniers ml d’eau extraite du chloroforme.

Comme pour les autres systèmes de développement, inversez-le trois ou quatre fois, puis versez 30 ml dans le réservoir pour mouiller le papier. Jeter ces 30 ml et ajouter les 70 derniers ml dans le réservoir. Préparation du méthanol.

Pour constituer la solution Hilditch utilisée pour la dérivatisation, remplissez une fiole volumétrique propre aux lipides qui a également été séchée ou rincée trois fois de plus avec du méthanol pour éliminer tout chloroforme. Ajouter le méthanol jusqu’à ce que le bas du ménisque soit à la ligne de confinement. Après avoir mesuré le méthanol, ajouter le sulfate de sodium qui a été séché pendant au moins 24 heures à 60 degrés Celsius.

Ajouter suffisamment de sulfate de sodium pour qu’il recouvre le fond de la fiole métrique de volume. Une fois recouvert, inverser deux fois de sorte que toute l’eau qui se trouve dans le méthanol soit absorbée par le sulfate de sodium. Après l’inversion et le tremblement, laissez-le reposer pendant au moins cinq minutes.

Ajout de l’acide. Une fois que le méthanol s’est déposé cinq minutes, décantez-le lentement dans la bouteille en verre finale en veillant à ce que tout le sulfate de sodium reste au fond de la fiole jaugée. Le sulfate de sodium reste généralement au fond, de sorte que tout le méthanol doit se déverser.

Laissez sécher le volumemétrique avec le sulfate de sodium à l’arrière de la hotte. Ajouter lentement de l’acide sulfurique au méthanol à l’aide d’un PIPETMAN. Ajoutez quelques gouttes à la fois pour que le méthanol ne crache pas.

Une fois que tout l’acide a été ajouté, coiuer et remuer doucement pour mélanger. La solution est maintenant prête à être utilisée pour les produits dérivés, mais elle doit être préparée sur une base hebdomadaire. Faire les dérivés.

À partir d’un flacon d’extrait dont le volume a été porté à une quantité connue, tourbillonner, puis retirer une partie de l’extrait dans un flacon de 15 ml propre aux lipides et marqué. La quantité que vous retirez sera déterminée par la concentration de l’échantillon de l’Iatroscan. Utilisez une pipette Drummond propre aux lipides pour retirer l’échantillon.

Une fois l’échantillon retiré, placer le flacon de 15 ml sous azote pour évaporer complètement le chloroforme. L’échantillon original peut être conservé et retourné au congélateur. Lorsque l’échantillon est séché, ajouter 1,5 ml de dichlorométhane ou une pipette et trois ml de la solution de Hilditch qui a été faite plus tôt ce jour-là ou deux pipettes.

Cette solution est ensuite conservée sous azote, vortexée et placée dans le sonicator pendant quatre minutes avant d’être placée dans un four à 100 degrés Celsius pendant une heure. Arrêter la réaction. Après avoir réchauffé à 100 degrés Celsius pendant une heure et refroidi, ajouter lentement 0,5 ml de solution saturée de bicarbonate de sodium.

Des bulles seront produites au fur et à mesure que l’acide sera neutralisé. Ajoutez ensuite 1,5 ml d’hexane. Récapitulez et secouez vigoureusement.

Laissez-le reposer pour qu’il se sépare en deux couches. Traiter tous les échantillons. Au moment où ils sont tous terminés, le premier sera prêt pour la prochaine étape.

Retrait du calque supérieur. Une fois que la dérivatisation a été arrêtée et qu’il y a une séparation claire dans le flacon de 15 ml, retirez la couche supérieure et placez-la dans un flacon de deux ml propre aux lipides. Il est préférable de laisser une partie de la couche supérieure que d’obtenir l’une des couches inférieures dans le flacon de deux ml.

Une fois que la majorité de la couche supérieure a été enlevée, le reste de la solution peut être jeté. L’extrait qui se trouve dans les deux ml doit être complètement évaporé sous un doux jet d’azote. Une fois que le flacon est complètement sec, l’hexane peut être rajouté, puis l’échantillon doit être soniqué, conservé sous azote, puis il est prêt à aller au GC. Résultats représentatifs.

Cette figure montre les chromatogrammes TLC-FIC bruts de notre standard, un régime à base d’huile de colza et de tissu hépatique provenant d’un saumon nourri avec ce régime. L’aquaculture, le secteur de la production alimentaire qui connaît la croissance la plus rapide, doit réduire sa dépendance à l’égard de la farine et de l’huile de poisson d’origine sauvage. Les huiles végétales sont à l’étude en remplacement de l’huile de poisson dans les aliments aquatiques.

Et le foie, le principal site du métabolisme des lipides, est ciblé pour analyse. Nous pouvons voir la prévalence des triacylglycérols dans l’alimentation dans le foie, et aussi l’importance des phospholipides membranaires dans le foie. Cette figure montre les chromatogrammes d’un standard.

Les lipides et les particules décantées se sont accumulés au large de la côte ici et les lipides dans le mysid se sont accumulés près de la même profondeur. Ici, les chromatogrammes ont été traités par un logiciel de traçage. Étant riches en carbone avec une valeur énergétique très élevée, les lipides sont une composante importante de la productivité des zones de stockage, qui sont particulièrement importantes pour le cycle du carbone.

Une plus grande production primaire de surface atteint les fonds marins dans des eaux moins profondes. Nous avons constaté que le petit mysid avait la concentration de lipides la plus élevée dans nos échantillons. La cire et les esters stériles sont combinés ici.

Et il y a un pic de fractionnement en raison de la présence de niveaux élevés d’acides gras polyinsaturés. La rapidité avec laquelle le système Chromarod Iatroscan TLC-FID fournit des données synoptiques sur la classe lipidique à partir de petits échantillons en fait un outil puissant pour le criblage des échantillons marins avant d’effectuer des analyses chromatographiques plus détaillées. De telles analyses nécessitent généralement la libération de composés constitutifs à partir d’extraits lipidiques et la dérivatisation pour augmenter la volatilité.