Bien que l’échelle soit l’un des attributs universels et fondamentaux des systèmes de développement, les mécanismes sous-jacents n’ont pas été compris dans de nombreux organes et tissus. La technique de réduction de taille du poisson zèbre présentée dans cette vidéo vous permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents aux processus d’échelle dynamique. Les avantages de travailler avec le poisson zèbre sont qu’il est facile d’effectuer l’imagerie vivante, la génétique et l’analyse quantitative.
Notre technique est également très simple et facile à appliquer sans aucun équipement spécialisé ou formation intensive. La santé des embryons est la clé du succès avec cette technique. Utilisez les jeunes poissons comme parents et faites attention à minimiser les dommages en enlevant les chorions.
Et aussi jouer dans la taille de la plaie sur le jaune, et combien de cellules sont enlevées. Comme les embryons que nous utilisons sont très jeunes et fragiles, ils doivent être manipulés très soigneusement lors du transfert et du hachage. Dans le même temps, il doit être rapide afin que la procédure peut être faite dans la bonne fenêtre de temps de développement.
La démonstration visuelle peut donner une bonne idée de la façon de produire des embryons plus petits efficacement. Pour faire une boucle métallique pour hacher les embryons, alimentez un fil d’acier inoxydable rigide et non corrosif de 20 centimètres de long à travers un capillaire en verre, faisant une petite boucle d’un millimètre de long au sommet. Placez une petite gouttelette de vernis à ongles clair sur le bout de la classe capillaire, entre le capillaire et la boucle métallique pour le maintenir en place, en s’assurant de ne pas obtenir de vernis à ongles sur la partie boucle, car il peut endommager les embryons.
Et puis laissez-le sécher. Utilisez du ruban adhésif de laboratoire pour fixer le capillaire en verre avec la boucle sur une baguette en bois, laissant environ deux centimètres et demi du capillaire en verre s’étendant au-delà de la baguette de sorte que la partie baguette de l’outil ne plonge pas dans l’eau plus tard. Dans un plat Petri en verre de 100 millimètres à l’aide d’une spatule en plastique, étendre environ 0,5 millilitres de cellulose méthyle à 2 % près du centre du fond à une épaisseur d’environ 0,5 millimètre.
Verser environ 30 millilitres de solution d’un tiers de Ringer sur le côté du plat, et lui permettre de s’étendre sur le reste du plat et couvrir la cellulose méthylique. Placer les embryons précédemment dé-chorionated à la cellule 256 à un stade de cellule K sur 2% cellulose méthyle, en s’assurant que les embryons sont orientés sur leur côté. Pour hacher blastula, utilisez la boucle métallique pour couper près du pôle animal, perpendiculairement à l’axe végétal animal et couper environ 30 à 40% des cellules blastoderm.
Puis appuyez doucement sur les extrémités ensemble pour aider les cellules restantes à revenir en arrière. Pour le jaune, utiliser le fil monté pour faire une petite plaie près du pôle végétal en entaillant la membrane de l’œuf, ce qui fera suinter le jaune pendant quelques minutes, puis guérir. Lorsque le jaune cesse de suinter, utiliser une pipette pour déplacer l’embryon à l’extérieur de la cellulose méthylique dans le même plat pour la récupération.
Répéter le hachage du blastula et du jaune pour tous les embryons, puis laisser le plat intact pendant 30 minutes pendant que les embryons se rétablissent. Ensuite, utilisez une pipette en verre pour transférer les embryons dans le plat en verre de 35 millimètres précédemment préparé contenant la solution fraîche d’un tiers de Ringer et placez-les dans un incubateur de 28,5 degrés Celsius pour permettre une récupération complète avant de poursuivre l’imagerie. Après avoir effectué deux étapes de hachage avec blastula et jaune, les embryons ont montré une morphologie globale apparemment normale tout au long des stades de développement par rapport aux embryons de contrôle, autre que la différence de taille.
D’autre part, les embryons hachés blastula-seulement ont montré une morphologie particulière, particulièrement aux étapes antérieures. Pendant l’épicorps, les embryons ont eu un aspect serré et indented. Au stade suivant de somite, des structures de midline se sont trouvées aplaties à beaucoup de niveaux axiaux.
À des stades ultérieurs, les structures corporelles adjacentes au jaune, comme le milieu et l’arrière-pays, présentaient encore une forme relativement aplatie, peut-être en raison de la tension accrue du jaune relativement plus gros. La formation image de time lapse de la formation de somite a prouvé que dans les embryons de contrôle et hachés, les tailles des somites qui ont été formées aux étapes ultérieures étaient plus petites comparées à celles des étapes précédentes. En outre, tout au long des stades de formation de somite, les embryons hachés ont eu de plus petits somites que ceux dans les embryons de contrôle.
Quand la technique de hachage en deux étapes a été exécutée sur les embryons injectés de mCherry de membrane, la formation image de leurs moelles épinières à 20 heures après fertilisation a montré la réduction des hauteurs de tube neural due à la réduction de taille. Deux étapes de hachage est très important pour obtenir des embryons plus petits mais autrement normaux avec une efficacité élevée. Il est important de se rappeler de ne pas hacher le jaune tout en coupant les cellules de la blastula.
Pour le jaune, faire une petite plaie sur elle pour le contenu à suinter. Et la membrane jaune guérira naturellement dans le tampon approprié. Puisque les embryons hachés peuvent être récupérés rapidement, toutes les méthodes ou analyses peuvent être appliquées aux embryons normaux peuvent être exécutées suivant la méthode de réduction de taille.
La simplicité et la polyvalence de cette technique est très puissant que n’importe qui pourrait introduire cette technique pour étudier le problème d’échelle dans n’importe quel tissu ou organe dans le poisson zèbre. Nous croyons qu’avec cette technique, les chercheurs peuvent s’attaquer aux problèmes d’échelle dans une variété de systèmes qui n’ont jamais été touchés auparavant. Nous avons déjà fait d’importantes découvertes dans l’échelle des motifs de somite et de tube neural.
