We thank Mr. Hajime Ichijo for video recording and helpful advice concerning editing the video. We also thank the Osumi lab members for animal care. This work is supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Area, Neural Diversity and Neocortical Organization, from MEXT of Japan (to N. O.). T. K. was supported by a Research Fellowship of JSPS for Young Scientists.

REMARQUE: Les expérimentations animales ont été menées en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. Le Comité pour l&#39;expérimentation animale de l&#39;École de médecine de l&#39;Université du Tohoku a approuvé les procédures expérimentales décrites ici. 1. Anesthésie et laparotomie <ol style="margin-left: 40px;"><li> Pour la collecte de sang, utiliser des rats mâles spécifiques exemptes d&#39;agents pathogènes Sprague-Dawley. Jeûner les rats pendant au moins 18 heures tout en fournissant de l&#39;eau. Utilisez rats mâles reproducteurs retraités à 6-8 mois (550-650 g) pour la collecte de sang. </li><li> Débit de 2,5 à 4,0% d&#39;isoflurane, qui est un anesthésique par inhalation, dans une boîte reliée à un appareil d&#39;anesthésie pour introduire anesthésie à 2,0 à 3,5 L / min pendant 10 min. Transfert des rats dans la boîte à introduire l&#39;anesthésie. <ol><li> Confirmer l&#39;anesthésie par la vérification de la perte de la réponse à la stimulation sur les pattes avec une pince. Couvrir le nez du rat with un masque relié à un appareil d&#39;anesthésie anesthésier profondément les rats lors de la collecte de sang. La concentration et le débit est maintenu à 2,5 à 4,0% et de 2,0 à 3,5 L / min, respectivement. NOTE: L&#39;halothane doit pas être utilisé pour l&#39;anesthésie par inhalation car embryons mis en culture dans le sérum qui est recueillie à partir de rats anesthésiés avec ce réactif présentent un retard dans le développement embryonnaire par rapport aux embryons cultivés dans le sérum obtenu à partir de rats anesthésiés avec de l&#39;isoflurane 22. </li></ol></li><li> Pour éviter la contamination de la fourrure, à désinfecter la peau en versant 70% d&#39;éthanol sur l&#39;abdomen du rat anesthésié. Choisir la peau et la paroi abdominale désinfecté à la partie inférieure avec une paire de forceps et couper ces couches simultanément en direction de la région du thorax d&#39;une paire de grands ciseaux pour exposer les organes internes. Tenir compte de l&#39;intestin à l&#39;extérieur de la cavité abdominale avec une paire de forceps. </li><li> Coupez la peau et la paroi abdominale vers les membres postérieurs avec unpaire de grands ciseaux pour exposer davantage la région abdominale postérieure. Refléter la graisse supplémentaire en dehors de la cavité abdominale avec une paire de pinces. </li><li> Choisir la graisse viscérale sur la ligne médiane à l&#39;aide de deux paires de pinces et de diviser la matière grasse avec soin dans une direction parallèle à exposer l&#39;aorte abdominale. Répéter ce procédé pour diviser la graisse viscérale dans une direction longitudinale pour identifier facilement la bifurcation de l&#39;aorte abdominale. En outre, l&#39;aorte est pulsatile et peut être distinguée de la veine cave adjacente à l&#39;aide de cette caractéristique. </li><li> Choisir la matière grasse autour de l&#39;aorte abdominale et la bifurcation soigneusement avec deux paires de pinces et séparer la graisse de l&#39;aorte abdominale. </li></ol> 2. Collecte de sang <ol style="margin-left: 40px;"><li> Insérer avec précaution la pointe d&#39;une aiguille 21 G raccordée à une seringue de 20 ml immédiatement crânienne à la bifurcation de l&#39;aorte, avec le biseau vers le bas. Tenez la seringue avec unmain, et tirez lentement la seringue pour recueillir 15 ml de sang d&#39;un rat mâle. </li><li> Retirez l&#39;aiguille de la seringue, et verser le sang en deux 10 ml tubes à essai stériles glacées (figure 1A). Conserver les tubes sur de la glace jusqu&#39;à ce que la centrifugation pour retarder la formation du caillot de sang. Réduire le temps de centrifugation par centrifugation de plusieurs tubes à la fois. </li><li> Euthanasier le rat anesthésié par thoracotomie et couper le coeur ou la décapitation. </li></ol> 3. Sérum de rat Préparation <ol style="margin-left: 40px;"><li> Centrifuger le sang recueilli pendant 5 min à 1200 x g et à température ambiante (RT) pour séparer le sang en couches supérieure et inférieure (figure 1C). </li><li> Gardez les tubes à 4 ° C pendant 1,5-2 heures à fixer le caillot de fibrine. </li><li> Relever le caillot de fibrine dans la couche supérieure à l&#39;aide d&#39;une paire de forceps incurvés, et presser le caillot de fibrine pour séparer le sérum. Ensuite, appuyez sur le caillot de fibrine avec les pinces courbes face downwards proches de l&#39;interface entre les deux couches (Figure 1D). </li><li> Répétez l&#39;étape 3.3 de détacher davantage le caillot de fibrine. </li><li> Centrifuger les tubes à essai pendant 5 minutes à 1200 xg et RT (figure 1E). </li><li> Soigneusement transférer le sérum dans un tube stérile de 15 ml à l&#39;aide d&#39;une pipette stérile dans une armoire flux d&#39;air laminaire. </li><li> Centrifuger le sérum de rat recueillies pendant 5 min à 1200 xg et RT pour enlever les globules rouges restants. </li><li> Regrouper le sérum avec précaution dans un nouveau tube de 15 ml stérilisés à l&#39;aide d&#39;une pipette stérile pour éviter la contamination par les globules rouges résiduels dans le fond du tube (Figure 1F). </li><li> Faire incuber le sérum dans un bain d&#39;eau à 56 ° C pendant 30 minutes pour inactiver le système du complément. </li><li> Refroidir les tubes de sérum de rat à la température ambiante dans l&#39;armoire flux d&#39;air laminaire. Le sérum doit être aliquote de 10 ml dans des tubes stériles individuels. Conserver les tubes à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation (figure 1H). </li></ol>

<ol>
	<li>New, D. A. T., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction.">Introduction.</a> Mammalian Postimplantation Embryos. A Practical Approach. , 1-14 (1990).</li><li>Eto, K., Takakubo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+development+of+rat+embryos+in+culture+during+the+period+of+craniofacial+morphogenesis.">Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis.</a> J Craniofac Genet Dev Biol. 5, 351-355 (1985).</li><li>Takahashi, M., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+method+of+rodent+whole+embryo+culture+using+the+rotator-type+bottle+culture+system.">The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system.</a> J Vis Exp. (42), e2170 (2010).</li><li>New, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+embryo+culture,+teratogenesis,+and+the+estimation+of+teratologic+risk.">Whole embryo culture, teratogenesis, and the estimation of teratologic risk.</a> Teratology. 42, 635-642 (1990).</li><li>Matsuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+in+the+Pax-6+gene+in+rat+small+eye+is+associated+with+impaired+migration+of+midbrain+crest+cells.">A mutation in the Pax-6 gene in rat small eye is associated with impaired migration of midbrain crest cells.</a> Nat Genet. 3, 299-304 (1993).</li><li>Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6-dependent+boundary+defines+alignment+of+migrating+olfactory+cortex+neurons+via+the+repulsive+activity+of+ephrin+A5.">Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5.</a> Development. 133, 1335-1345 (2006).</li><li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+antagonists+regulate+formation+of+the+anteroposterior+axis+of+the+mouse+embryo.">Nodal antagonists regulate formation of the anteroposterior axis of the mouse embryo.</a> Nature. 428, 387-392 (2004).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cadherins+in+maintaining+the+compartment+boundary+between+the+cortex+and+striatum+during+development.">Role of cadherins in maintaining the compartment boundary between the cortex and striatum during development.</a> Development. 128, 561-569 (2001).</li><li>Takahashi, M., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6+regulates+specification+of+ventral+neurone+subtypes+in+the+hindbrain+by+establishing+progenitor+domains.">Pax6 regulates specification of ventral neurone subtypes in the hindbrain by establishing progenitor domains.</a> Development. 129, 1327-1338 (2002).</li><li>Calegari, F., Haubensak, W., Yang, D., Huttner, W. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+backscatter+microscopy+of+mouse+embryos.">Ultrasound backscatter microscopy of mouse embryos.</a> Methods Mol Biol. 135, 235-243 (2000).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5.">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> J Vis Exp. (45), e2047 (2010).</li><li>Quinlan, G. A., Khoo, P. L., Wong, N., Trainor, P. A., Tam, P. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+tube+closure+in+mouse+whole+embryo+culture.">Neural tube closure in mouse whole embryo culture.</a> J Vis Exp. (56), e3132 (2011).</li><li>Machado, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+phrenic+neuron+identity+in+embryonic+stem+cell-derived+motor+neurons.">Reconstruction of phrenic neuron identity in embryonic stem cell-derived motor neurons.</a> Development. 141, 784-794 (2014).</li><li>Glanville-Jones, H. C., Woo, N., Arkell, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+whole+embryo+culture+with+commercially+available+reagents.">Successful whole embryo culture with commercially available reagents.</a> Int J Dev Biol. 57, 61-67 (2013).</li><li>Ornoy, A., Yacobi, S., Yaffee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+culture+of+11.5-day-old+rat+embryos+in+DMEM/F12+and+20%+fetal+bovine+serum.">A simple method of culture of 11.5-day-old rat embryos in DMEM/F12 and 20% fetal bovine serum.</a> J Anat. 203, 419-423 (2003).</li><li>Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+serum-free+in+vitro+culture+technique+for+midgestation+mouse+embryos.">New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos.</a> Genesis. 35, 164-168 (2003).</li><li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Embryonic+Development+in+a+Serum-free+Whole+Embryo+Culture+System.">Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System.</a> J Vis Exp. (85), e50308 (2014).</li></ol>

No conflicts of interest are declared.

Des résultats reproductibles lors des expérimentations WEC dépendent de l&#39;utilisation de sérum de rat IC de haute qualité et de précision technique embryon de dissection 3. Ne pas raccourcir la période de jeûne avant la collecte de sang, car le jeûne est nécessaire de normaliser les concentrations de glucose dans le sang. Des rats femelles doivent pas être utilisés pour la préparation de sérum parce que les niveaux d&#39;hormones chez les animaux femelles changent en fonction du cycle oestra...

Une variété de modèles animaux sont utilisés en biologie du développement pour étudier les mécanismes de développement aux niveaux moléculaires et cellulaires. Par exemple, les espèces d&#39;amphibiens et d&#39;oiseaux ont été largement utilisés comme animaux modèles classiques qui sont appropriés pour la manipulation directe d&#39;embryons parce que ces embryons se développent en dehors de la mère. Contrairement à ces animaux, les embryons de mammifères se développent dans l&#39;utérus de la mère, et la croissance à des stades ultérieurs dépend essentiellement de la fonction de l&#39;utérus. Par conséquent, il est souvent difficile de manipuler directement les embryons de mammifères, tels que ceux de la souris et le rat à des stades précoces. Dans les années 1960, Denis New établi une culture d&#39;embryons total de mammifère (CME) de la technique utilisant des appareils WEC avec un apport d&#39;oxygène et d&#39;un contrôle de chaleur 1. En WEC, souris et rats embryons peuvent se développer ex vivo, (c&#39;est à dire, en dehors de l&#39;utérus). Bien que la technique du CME a été souvent utilisé en tératologie en ajoutant divers chemiccomposés al dans le milieu de culture, cette technique a également été utilisée dans plusieurs études de biologie du développement à examiner les mécanismes de développement uniques chez les mammifères 2-4. Par exemple, le CME est combiné avec d&#39;autres techniques, telles que le marquage cellulaire, dans le type sauvage et mutantes embryons en utilisant un colorant fluorescent 5, 6 transplantation de cellules, et l&#39;introduction de gène par l&#39;intermédiaire de lipofection et d&#39;électroporation 7 13.8. Récemment, dans la manipulation de l&#39;utérus a été utilisé pour analyser les processus de développement des embryons de rongeurs à des stades ultérieurs et a été combiné avec des techniques d&#39;électroporation 14-16. Cependant, ces techniques ne sont pas appropriées pour la manipulation de post-implantation d&#39;embryons et midgestation raison de la difficulté à atteindre injection locale précise de la solution d&#39;ADN dans des embryons à un stade précoce. Bien que la transplantation de cellules guidée par ultrasons et l&#39;injection de vecteurs viraux dans des embryons précoces (à savoir, E8.5-E-9.5 chez la souris) in utero ont été rapportés précédemment 17,18, d&#39;excellentes compétences sont nécessaires pour effectuer ces expériences avec un taux de réussite élevé. Par conséquent, le WEC avec une grande accessibilité ex vivo présente des avantages par rapport à la manipulation de la souris et du rat des embryons. Immédiatement centrifugé (IC) de sérum de rat préparée à partir de rats mâles est souvent utilisé pour les moyennes du CME. Lorsque les embryons sont mis en culture au stade de la post-implantation (par exemple, plus tôt que E8.0 chez la souris E10.0 ou chez le rat), d&#39;un mélange de milieu synthétique et du sérum de rat IC est souvent utilisé comme un moyen pour WEC 19. Cependant, les embryons de la culture à la mi-gestation (c&#39;est à dire., E8.0-12.5 dans des embryons de souris E10.0 ou E14.5-dans des embryons de rat), 100% de sérum doit être utilisé comme un moyen car aucune médias alternatifs actuellement disponibles permet embryons de se développer normalement in vitro depuis plus de 2 jours. La préparation de sérum de rat de haute qualité estune étape cruciale pour atteindre la reproductibilité des expériences WEC. Par rapport à une centrifugation retardée, IC a l&#39;avantage de réduire l&#39;hémolyse lorsque le sérum est recueilli en serrant le caillot de fibrine parce que la plupart des cellules rouges du sang ont déjà été séparé du caillot de fibrine. Comme le sérum de rat hémolytique ne parvient pas à soutenir la croissance normale des embryons de rats et de souris, la préparation du sérum par centrifugation immédiate est préférable de préparation en utilisant la centrifugation retardée. Notre protocole comprend deux étapes supplémentaires par rapport à d&#39;autres protocoles de 18 à 20 (c.-à-., Stocker le sang recueilli sur de la glace avant la première centrifugation et de maintenir les échantillons de sang prélevés pendant 2 heures à 4 ° C après la première centrifugation). L&#39;ex-étape peut retarder la formation du caillot de sang, et la dernière étape favorise la solidification du caillot de fibrine pour la compression simple. Par conséquent, notre protocole peut être utilisé par les débutants. Toutefois, la reproduction et la collecte de sérum sanguinextraction avec précision par simple référence aux livres de protocole est extrêmement difficile 19-21. Dans cet article, vidéo, nous démontrons notre protocole standard pour la préparation de sérum de rat IC optimal, qui comprend la collecte de sang à partir de l&#39;aorte abdominale de rats mâles et extraction du sérum par centrifugation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="892">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:156px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:401px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>For anesthesia of rats.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Large scissors</td>
			<td>Napox</td>
			<td>B-7H</td>
			<td>Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Curved forceps</td>
			<td>Napox</td>
			<td>A-3-2</td>
			<td>Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sprague-Dawley (SD) rat</td>
			<td>Charles Rivers Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (20 ml)</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS-29ESZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Needle (21G x 5/8&#34;)</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-2116R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile test (spitz) tube (10 ml)</td>
			<td>ASIAKIZAI</td>
			<td style="width:119px;">1101C000B-10</td>
			<td>For collection of boold</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile disposable pipette</td>
			<td>Eiken Chemical</td>
			<td>CD2000 No.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterilie disposable tube (15 ml)&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>2196</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

La figure 1 montre les résultats représentatifs des modes opératoires décrits pour la séparation des cellules du sang et le sérum. On obtient typiquement 15 ml de sang d&#39;un rat mâle retiré (Figure 1A). Par centrifugation, le sang collecté peut être séparé en une couche supérieure contenant du sérum et du caillot de fibrine, ce qui est indiqué par une flèche, et une couche inférieure contenant les cellules sanguines (figure 1C). Fait important, les ?...

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Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Préparation du Rat Serum Convient pour la culture d&#39;embryons de mammifères entier

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

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13.7K vues.  Jichi Medical University. Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.