Ce protocole permet d’imager les embryons de souris au fur et à mesure de leur développement. Cela permet d’étudier en détail la cardiogenèse précoce. Comme la prise d’images fixes de faux embryons, l’imagerie en direct donne un accès complet au processus dynamique d’étude dans le développement de l’embryon.
Les compétences requises pour l’imagerie de la vie sont difficiles à saisir à partir de la publication de texte seulement. Regarder une autre personne le faire est essentiel pour apprendre. Pour commencer, coupez des morceaux de fil de tungstène d’un centimètre de long et aiguisez-les à 0,02 à 0,05 millimètre de diamètre en immergeant la pointe du fil dans une solution saturée de nitrate de sodium.
Pour préparer les capillaires en verre coudé, placez le point médian d’un capillaire en verre standard d’un millimètre sur un briquet Bunsen pendant trois à six secondes, en tirant lentement des deux extrémités jusqu’à ce que le capillaire devienne mince et flexible. Ensuite, cassez le capillaire en deux et chauffez-le brièvement pour produire une courbure de 90 degrés à deux centimètres de la pointe. J’ai vu un morceau de polyméthacrylate de méthyle mesurant environ sept millimètres de long, quatre millimètres de large et deux millimètres d’épaisseur.
Tenez la pièce de méthacrylate à l’aide d’un étau de banc, puis percez des trous personnalisés transversalement à travers toute la pièce. Faites pivoter la perceuse lentement tout en appliquant une pression faible mais constante. Utilisez une lime fine pour lisser le bord du support et ajuster sa taille.
De plus, créez une pente douce sur les bords du support pour faciliter le positionnement de l’embryon. Placez le support fini dans un plat avec de l’eau distillée pour le rincer. Sous le stéréomicroscope, vérifiez le support pour voir si les trous contiennent de la poussière de forage.
Si de la poussière est présente, utilisez des aiguilles en tungstène pour l’enlever. Pour stériliser le support, placez-le dans un tube conique rempli d’eau distillée et sonicate pendant 20 minutes avec une puissance de sortie minimale de 20 watts. Extraire l’utérus d’une souris enceinte euthanasiée jour 6,75 à 7,5 et le placer sur une lingette en papier sec et propre.
Ensuite, coupez l’utérus, en insérant la pointe de ciseaux fins du côté mésométrial, en faisant glisser la lame pour exposer la décidue et transférez-les dans le milieu de dissection. Disséquer les embryons, en gardant le cône ectoplacentaire intact. Ensuite, décollez la membrane de Reichter, en laissant une partie sur la région embryonnaire supplémentaire.
Pour garder le milieu de dissection chaud, remplacez-le toutes les 10 minutes. De plus, disséquez les décidui par groupes de trois à quatre tout en conservant le reste dans un milieu de dissection placé dans un bain de 37 degrés Celsius. Placer immédiatement les embryons disséqués dans un milieu de culture.
Sélectionnez les embryons présentant les caractéristiques de fluorescence souhaitées à l’aide d’un stéréomicroscope à fluorescence et placez-les dans le tube contenant le milieu de culture dans l’incubateur de culture cellulaire pour récupérer pendant deux heures avant l’imagerie. Après avoir allumé tous les composants du microscope, y compris l’ordinateur, les logiciels et les lasers, allumez le contrôleur de dioxyde de carbone et réglez-le à 7%Placez une goutte de graisse de silicium sous vide poussé sur une antenne parabolique de 35 millimètres avec un fond couvercle en verre. Placez le support sur le dessus de la goutte et appuyez doucement pour l’immobiliser.
Pour le montage de l’embryon, transférez deux à trois embryons de l’incubateur au plat avec un support. À l’aide d’une paire de pinces et d’une aiguille en tungstène effilée, placez les embryons dans les trous. Utilisez l’aiguille pour accrocher l’embryon par le cône ectoplacentaire et insérez-le dans un trou de taille correspondante.
Déplacez délicatement la capsule contenant les embryons et le support sur la plaque de microscope. Abaisser l’objectif jusqu’à ce qu’un ménisque liquide se forme à l’interface de l’objectif moyen. Après avoir placé l’embryon au point, montez la chambre d’incubation et scellez-la autour de l’objectif à l’aide de ruban adhésif.
À l’aide d’une capture en direct au logiciel de contrôle du microscope, ajustez la sortie laser et les niveaux de gain. Ensuite, couvrez le milieu avec de l’huile de paraffine en l’égoutter lentement sur l’objectif. Configurez un enregistrement accéléré.
Définissez un intervalle de cinq à 10 minutes avec un espace Z de trois à cinq microns entre les piles. Laissez un espace vide au-dessus de la Z-Stack pour anticiper la croissance des embryons. Un minimum de 50 microns, ajoutant 30 microns pour chaque heure où l’acquisition ne sera pas supervisée.
Activez l’option d’enregistrement automatique pour permettre la supervision de l’acquisition à partir d’un ordinateur afin de permettre l’ajustement de la taille de Z-Stack si nécessaire, pour s’adapter à la zone d’intérêt au point. Le développement du cœur embryonnaire vivant du corps entier par imagerie multiphotonique est montré. Au jour embryonnaire 7,5, la fluorescence veineuse est présente dans tout l’ectoderme neural, avec quelques noyaux positifs au niveau du mésoderme splanchnique et extra-embryonnaire.
Après quatre heures, les progéniteurs endothéliaux activent veineux et s’assemblent pour former le tube endocardique et les aortes sous-jacentes, qui deviennent des structures fermées après sept heures. Soyez prudent lorsque vous retirez la membrane de Reichter. Il peut être vraiment collé à l’embryon, en particulier aux stades de prévacillation.
Pendant le retrait, essayez de pincer la membrane par la région embryonnaire supplémentaire.
