We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.

1. Préparation des cellules et réactifs <ol><li> Le jour avant l&#39;essai, la plaque de cellules hôtes appropriées pour le virus en question (Tableau 1 et 2) à 90 - 100% de confluence. </li><li> Préparer la solution de fixation de 10% de formaldéhyde dans dH 2 O. Dans l&#39;exemple, mélanger 5,56 ml de 36% actions formaldéhyde avec 14,44 ml de H 2 O distillée (dH 2 O). REMARQUE: Utiliser les pratiques de manipulation de sécurité approprié et ventilation lors de l&#39;utilisation du formaldéhyde. </li><li> Préparation du violet cristallisé teinture: 1% de violet cristal (CV) dans 20% d&#39;éthanol et dH 2 O. </li><li> Préparez le support de plaque 2x (type dépendant à une concentration 2x cellulaire; voir le tableau 2). Filtrer sur un filtre de 0,2 um si tous les réactifs ne sont pas stériles. </li><li> Préparation des superpositions d&#39;immobilisation (tableau 3) <ol><li> Pour superpositions liquides, faire une solution stérile de 2,4% d&#39;Avicel en DH 2 O. Pour éviter l&#39;agglutination, ajouter la poudre dans un flacon contenant de l&#39;eau eà se mélanger rapidement avec une barre d&#39;agitation, verser Avicel lentement et mélanger rapidement à la température ambiante (RT). Lorsque la solution se révèle trop visqueux pour une barre d&#39;agitation pour homogénéiser, passer à un agitateur de ballon pour&gt; 30 min avec agitation lourd pour assurer une homogénéisation. REMARQUE: Les solutions mères peuvent être faites à des concentrations plus faibles, mais les solutions peuvent se séparer et devront être remixé pour assurer l&#39;homogénéisation. Les solutions de travail de Avicel peuvent être utilisés allant de 0,6 à 3%. </li><li> Après homogénéisation, l&#39;autoclave la solution et magasin fermé à la température ambiante. </li><li> Pour agarose et la carboxyméthylcellulose (CMC) superpositions, préparer une solution de réserve en DH 2 O de 2% de CMC ou 0,6% agarose. Mélanger avec une barre d&#39;agitation et autoclave ou micro-ondes pour mettre en solution. </li></ol></li></ol> 2. Les dilutions et les infections <ol><li> Le jour après l&#39;étalement, vérifier visuellement la confluence et la viabilité des cellules avant de commencer l&#39;essai. Assurer une norme cellulaire morphologietrouver une monocouche confluente ~ 90% est présent. </li><li> Effectuer une dilution en série par dix des échantillons infectieux. Utilisation du milieu de culture cellulaire pour la propagation virale en tant que diluant (tableau 2). Varier le nombre de dilutions nécessaires sur la base du titre attendu du virus en question, et utilisez toujours un échantillon témoin non infecté pour assurer indépendamment la viabilité cellulaire et aide à l&#39;identification de la plaque. </li><li> A partir des dilutions en série, infecter les cellules pendant 45 min à 1 h (tableau 1). Utiliser une quantité suffisante d&#39;inoculum pour recouvrir les cellules, tout en maintenant le volume le plus faible possible afin de maximiser le contact avec la monocouche virale (tableau 4). Plaques rocheuses délicatement toutes les 20 min pour assurer une couverture uniforme et empêchent la monocouche cellulaire de séchage. </li><li> Après l&#39;infection, superposer un volume approprié de milieu immobiliser directement aux inoculums dans le puits (Tableau 2) en utilisant un mélange 1: 1 de 2 x support de plaque et le immobiliztion superposition de choix (CMC, agarose ou Avicel). Agitez doucement pour mélanger. <ol><li> Pour superpositions liquides, mélanger 1: 1 avec les médias de la plaque chauffée et 2x 1.2 à 2.4% RT actions Avicel pour obtenir une solution de travail de 0,6-1,2% Avicel milieu de recouvrement. </li><li> Pour une couche d&#39;agarose, utilisez un mélange 1: 1 de médias 2x plaque chauffées et une solution stock de chauffe de 0,6% d&#39;agarose, dans un bain d&#39;eau à 56 ° pendant 30 minutes pour équilibrer la température obtention d&#39;une concentration finale agarose / recouvrement de 0,3 %. </li><li> Pour CMC, préparer une solution de réserve de 2% et de traiter comme décrit pour la couche d&#39;agarose. </li><li> Lors de l&#39;application du revêtement à la monocouche, toujours équilibrer agarose chaud ou CMC dans une eau à 56 C ° pour éviter d&#39;endommager la monocouche. Assurez-vous que la solution est chaud, mais pas chaud au toucher pour empêcher la mort des cellules et des titres viraux réduits. La plupart des superpositions agarose vont commencer à se solidifier en dessous de 42 ° C, travailler rapidement et / ou préparer de petites quantités pour éviter la solidification lors de la manipulation. </li></ol></li><li> Après addition de la superposition, les plaques incuber à produire des plaques distinctes qui sont clairement dénombrable. La formation de plaque peut prendre 2-14 jours selon le virus en cours d&#39;analyse, le tableau 1. REMARQUE: Une fois les plaques superposées liquides sont placés dans l&#39;incubateur, ne les déplacez pas. Le déplacement des recouvrements liquides au cours de la période d&#39;incubation se traduira par des plaques tachées. Agarose et CMC superpositions sont semi-solide et peuvent être déplacés ou vérifiés périodiquement sous un microscope optique pour suivre le développement de la plaque. </li></ol> 3. Fixation et coloration des cellules <ol><li> Pour fixer les cellules, verser ou aspirer la superposition Avicel, et fixer les cellules en utilisant la solution de formol à 10% pendant 30 min à la nuit (&lt;1 ml par puits pour une plaque de 6). <ol><li> Pour agarose ou CMC, ajouter directement la solution de formaldéhyde à la superposition pendant 1 h à une nuit. REMARQUE: Les échantillons peuvent être conservés pendant de longues périodes de temps dans le fixateur à condition qu&#39;elle nepas évaporer et sécher car cela peut fausser la monocouche. </li></ol></li><li> Avant la coloration et après fixation, jeter le formaldéhyde et retirer les bouchons semi-solides pour l&#39;agarose et CMC soit avec l&#39;eau courante ou manuellement avec une spatule. Rincer les plaques Avicel avec de l&#39;eau pour enlever les résidus de superposition / fixateur avant la coloration. </li><li> Pour la coloration, couvrir les cellules avec une quantité minimale de solution de cristal violet pendant ~ 15 min. Roche plaques si nécessaire pour assurer une couverture uniforme. </li><li> Lavez délicatement la tache de cristal violet avec de l&#39;eau. Une fois fixées, colorées, et séché, plaques de magasins indéfiniment pour une analyse ultérieure. </li></ol> 4. Déterminer virales Les titres <ol><li> Comptez le nombre de plaques dans chaque puits, en prenant la moyenne pour toutes les répétitions techniques de la même dilution. Pour les grands formats de plaques, puits de réduction de moins de 5 ou plus de 100 plaques. Prenez note de la taille de la plaque et de la morphologie. Le contrôle négatif doit avoir une monocouche uniforme etpeut être utilisé comme un témoin de référence. </li><li> Déterminer le titre viral de l&#39;échantillon de valeurs en prenant le nombre moyen de plaques de dilution et l&#39;inverse du facteur de dilution totale. </li></ol><img alt="Equation 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52065/52065eq1.jpg" width="300" /> NOTE: À titre d&#39;exemple, 30 et 32 plaques en compte pour les répétitions de la 1 x 10 -7 dilution [31 (moyenne) / 10 -7 (dilution) x 0,4 ml (inoculum)] donnerait un titre de 7,75 x 10 8 pfu / ml.

<ol>
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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+the+Filovirus+Plaque+Assay+for+Use+in+Preclinical+Studies.">Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies.</a> Viruses. 4, 3511-3530 (2012).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol. J. 3, 63 (2006).</li><li>Klebe, R. J., Harriss, J. 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D., Garten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+influenza+virus+infection+in+human+airway+cell+cultures+by+an+antisense+peptide-conjugated+morpholino+oligomer+targeting+the+hemagglutinin-activating+protease+TMPRSS2.">Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2.</a> J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).</li><li>Youil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+influenza+virus+replication+in+Vero+and+MDCK+cell+lines.">Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines.</a> J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).</li><li>Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+assay+and+primary+isolation+of+influenza+a+viruses+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells+(MDCK)+in+the+presence+of+trypsin.">Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin.</a> Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).</li></ol>

The authors have nothing to disclose and no competing or financial interests in the protocol or products described.

Le facteur le plus critique pour un essai de plaque succès réside dans l&#39;optimisation du protocole pour la culture virale en question que les conditions peuvent varier considérablement. Les points clés à prendre en compte sont: accueillir compatibilité cellulaire par le virus en question, les conditions de croissance virales appropriées, gammes de dilutions suffisantes afin de différencier clairement les plaques, et la sélection de superposition correcte et coloration pour les cellules et les virus en question. Bien que les deux VFVR VEEV et poussent dans des conditions très similaires en utilisant un grand nombre des mêmes types de cellules hôtes, les différences de morphologie et de croissance varient considérablement plaque cinétique. Lors de l&#39;utilisation des cellules Vero pour les essais de la plaque, qui ont traditionnellement été utilisés comme une lignée cellulaire propagation et l&#39;indicateur pour hémorragiques virus de la fièvre et des alphavirus, VEEV pousse généralement à des titres plus élevés que la FVR et démontre augmenté cinétique de réplication, le développement de grandes plaques uniformes à 48 hpi 4, 10 - 12. Contrairement à VEEV, VFVR nécessite 72 HPI et démontre plaques qui sont généralement beaucoup plus petits et de taille variable. En opposition à VFVR et VEEV, le virus de la grippe est très cellule hôte spécifique et peut être difficile à se propager à travers la culture de tissus. Pour le virus de la grippe, l&#39;entrée et la fusion virale est normalement initiée par la liaison du récepteur de la surface cellulaire avec la glycoprotéine hamagglutinin virale (HA), qui médie l&#39;entrée dans la cellule cible par liaison avec le récepteur de surface de l&#39;acide α-sialique de la cellule hôte. Est une glycoprotéine HA trimère qui est présente dans l&#39;enveloppe de membrane de tous les virus de la grippe et nécessite un clivage dans le sous-unités HA1 et HA2 de par une protéase spécifique de la cellule hôte. Pour compliquer davantage la situation, ces sites de clivage peuvent souvent varier entre 13 souches virales. Comme l&#39;expression de protéases capables de cliver HA est limitée à des tissus spécifiques, les protéases are souvent ajouté à des milieux de culture cellulaire dans le but de faciliter la fusion virale et l&#39;entrée dans la cellule hôte choisie 13. TPCK-trypsine est un exemple d&#39;une protease couramment utilisé qui est utilisé dans la culture de cellules à la fois avec des cellules MDCK et des cellules Vero: faciliter la reproduction multi-cycle (en l&#39;absence de sérum d&#39;inactivation de la trypsine) par l&#39;intermédiaire de l&#39;activation protéolytique de HA virale 14,15. Comme démontré dans cette étude et d&#39;autres, les différences dans les cycles de vie virales peuvent influencer sélections de superposition, les formats de plaque, et les temps de collecte, avec des écarts importants entre les classes et les espèces de virus différents. Dans notre étude, les superpositions d&#39;agarose démontré plaques claires à des titres plus élevés que soit CMC ou superpositions liquides à la fois pour la FVR et virus de la grippe B, renforçant son utilité parmi un large éventail de virus et de types cellulaires. En utilisant une faible concentration finale de agarose grandement aidé à enlever les bouchons solides et coloration simplifiée. CMC a démontré l&#39;ensemble, le poorest efficacité comme une superposition pour les trois virus testés et produits très petites et indistinctes plaques de virus de la grippe B. Bien que, globalement CMC a démontré les caractéristiques les moins souhaitables, son utilisation en croissance rapide et extrêmement virus virulents pourraient se révéler avantageux, car il ne semble pour réduire la taille de la plaque avec seulement une diminution minimale dans le titre. Le revêtement liquide est avéré être le plus souple en ce qu &#39;il est extrêmement simple à préparer, une plus grande facilité d&#39;utilisation, et est comparable à de l&#39;agarose à travers tous les virus sélectionnés. Dans un format de plaque débit supérieur à 96 puits, l&#39;application et l&#39;enlèvement n&#39;a pas été inhibée en raison de solidification avec des superpositions traditionnels, et a fourni des résultats précis et cohérents. Une considération lors de l&#39;utilisation des superpositions liquides réside dans la coloration opaque et l&#39;incapacité à contrôler la formation de plaques comme les plaques ne peuvent être déplacés jusqu&#39;à ce que le point de collecte, de limiter cette adaptation de virus avec la cinétique de réplication précédemment caractérisées. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; modifications mineures dans des conditions de test de la plaque peuvent modifier significativement les résultats et l&#39;évaluation et la performance d&#39;un nouveau système ou technique est toujours justifié. Bien qu&#39;un protocole de dosage de la plaque optimisée et standardisée ne existe pas pour toutes les situations, notre rapport démontrent la polyvalence et la facilité d&#39;utilisation en traditionnel ainsi que de nouveaux revêtements liquides pour les essais de la plaque, tout en offrant suffisamment d&#39;expérience pour des modifications ultérieures de l&#39;utilisateur.

L&#39;isolement et la quantification précise des échantillons viraux viables a toujours été un objectif de recherche en cours en virologie. Il a fallu attendre l&#39;avènement de l&#39;essai de plaque en 1952 un moyen de calculer quantitativement et qualitativement les titres viraux animaux a d&#39;abord été développé 1,2. Cette technique a été adapté et modifié à partir d&#39;essais de phage, qui avait déjà été utilisée pour calculer les titres d&#39;actions bactériophages en biologie végétale 1,2. Bien que d&#39;autres moyens pour la quantification virale ont depuis été développée et adaptée, telle que des analyses immunologiques par fluorescence et par microscopie électronique à transmission, accordable de détection d&#39;impulsion résistive (de TRPS), la cytométrie en flux, les systèmes rapporteurs recombinantes, et inverse quantitative réaction en chaîne par polymérase (qRT-PCR) Ces méthodes ne parviennent pas à identifier et quantifier les virions réplication compétentes 1,3. Bien que les progrès dans les technologies et les techniques continuent à affiner et modifier le paysage; PLAQUe tests continuent de représenter l&#39;étalon-or dans la détermination des concentrations virales de virions infectieux lytiques 1,4. Au cours d&#39;un essai sur plaque, une monocouche confluente de cellules de l&#39;hôte est infecté par un virus lytique d&#39;une concentration inconnue qui a été dilué en série à une gamme dénombrable, typiquement entre de 5 à 100 virions. Les monocouches infectées sont ensuite recouvertes d&#39;un milieu de recouvrement de blocage pour empêcher la propagation de l&#39;infection virale indifféremment soit par le flux de convection ou mécanique du milieu liquide au cours de la propagation virale. Alors que les superpositions solides ou semi-solides tels que l&#39;agarose, cellulose de méthyle ou la carboxyméthylcellulose (CMC) ont traditionnellement été utilisés, les superpositions liquides sont devenus une alternative de plus en plus attrayant avec le développement de nouveaux revêtements de liquides tels que Avicel 5- 7. Plaque essais utilisant liquide contre superpositions traditionnels ont plusieurs avantages comme la superposition peut être applié à la température ambiante, et l&#39;application et le retrait est beaucoup plus facile. Comme superpositions liquides ne nécessitent pas de réchauffement, les virus labiles délicates et de chaleur peuvent aussi se révéler plus facile à la plaque. Après l&#39;infection initiale et l&#39;application du revêtement de blocage, les plaques individuelles, ou des zones de mort cellulaire, commencera à développer l&#39;infection virale et de la réplication que sont limités à la monocouche environnante. Les cellules infectées continueront le cycle de réplication de lyse-infection, la propagation de l&#39;infection en outre, résultant en plaques de plus en plus distincts et discrets. Selon la cinétique de croissance et de la cellule hôte viral utilisé, une plaque visible font normalement dans 2-14 jours. Monocouches cellulaires peuvent alors être comptées avec un microscope en champ clair standard, ou plus généralement fixés par et contre-rouge neutre ou cristal violent afin d&#39;identifier facilement les plaques à l&#39;œil nu. Il existe une grande variété de la plaque contre les taches disponibles, chaque offre eEIR Les avantages et les inconvénients spécifiques. Le cristal violet est généralement ajouté au point de collecte et après la fixation / enlèvement de la couche supérieure, fournir une contre-coloration rapide et distinct qui permet d&#39;identifier de très petites plaques lorsque morphologie mixte est présent. Le rouge neutre a l&#39;avantage d&#39;une application anticipée et contact constant avec la surimpression, permettant le suivi en direct de développer la formation de la plaque, ce qui est particulièrement utile lorsque vous travaillez avec un virus ou de réplication inconnus cinétique. Nous avons cependant constaté que la coloration est généralement pas aussi distinct lors de l&#39;utilisation du rouge neutre. 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényl tétrazolium (MTT) offre plusieurs avantages, comme les taches de colorants de couleur jaune cellules plaques bleues et noires viraux peuvent être comptées sans enlèvement de la couche supérieure en tant que vivent avec du rouge neutre. Le contraste entre cellules vivantes et mortes offertes par MTT permet également la détection de petites plaques lors d&#39;une précédente infection point de temps après, Bien que le stockage serait encore exiger le retrait de la superposition 8. Comme cristal violet peut être simplement fait dans une solution d&#39;eau et d&#39;alcool, et fournit un degré élevé de sensibilité pour la morphologie de la plaque mixte, nous avons choisi comme contre-colorant préféré et simplifié pour le protocole, ont démontré que nous utilisons plusieurs familles de bien virus caractérisés. Après fixation et coloration de la monocouche cellulaire infectée, plaques sont comptées pour titrer les échantillons de stock virale en termes de unités formant des plages (UFP) par millilitre. Une chute de journal est à noter entre les dilutions en série et, en fonction de la taille de la plaque, entre 5-100 plaques comptées, avec un contrôle négatif utilisé comme une référence. Échantillons statistiquement varient de 10% pour chaque tranche de 100 plaques comptés lorsque l&#39;on compare échantillons répétés 3. L&#39;avantage d&#39;utiliser la méthode des plages afin de déterminer les titres viraux réside dans leur capacité à quantifier le nombre réel de particules virales infectieuses wurant l&#39;échantillon. Comme plusieurs virions pourraient infecter une cellule unique, la terminologie de motifs par rapport à virions est utilisé pendant les titrages de la plaque 1,2. Plaque morphologie peut varier considérablement dans des conditions de croissance différentes et entre espèces virales. Plaque taille, la clarté, la définition de la frontière, et la distribution devraient tous être noté, car ils peuvent fournir des informations précieuses sur les facteurs de la croissance virus en question et de virulence. Principes de dosage de la plaque de base peuvent également être adaptés et modifiés dans un certain nombre de façons différentes, par exemple dans l&#39;utilisation de la mise au point des dosages de formage (AGL). FFA ne reposent pas sur la lyse cellulaire et contre-coloration pour détecter la formation de plaques, mais plutôt emploient immunomarquage techniques permettant de détecter directement des protéines virales intracellulaires par des anticorps marqués. Sensibilité accrue, une diminution des temps d&#39;incubation après l&#39;infection, et surtout la capacité à quantifier les virus non lytiques sont toutes distinctesavantages lors de l&#39;utilisation FFA. Bien que largement utilisée, les facteurs limitants critiques dans les FFA par rapport à un essai sur plaque classique réside dans la nécessité d&#39;anticorps appropriés et que la capacité de la sonde pour les sous-unités de protéines virales par rapport aux virions infectieux réels 4. Aux fins de cette étude, nous limiterons notre discussion à la méthode des plages classiques et décrire l&#39;utilisation des recouvrements solides et semi-solides traditionnels (agarose et CMC), avec de nouveaux revêtements de cellulose microcristalline liquide.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:129px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">6-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">658 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">12-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">665 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">96-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">655 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">96-2ml deep well plate</td>
			<td style="width:127px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:129px;">C15046314</td>
			<td>For serial dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">112 013 101</td>
			<td>Cell Media/Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">2X EMEM for plaques</td>
			<td style="width:127px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">115 073 101</td>
			<td>Warm to 37 oC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">MEM 100X&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Cellgro</td>
			<td style="width:129px;">25 025 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sodium Pyruvate&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Cellgro</td>
			<td style="width:129px;">25 000 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">15140 122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">25030 081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:269px;">HyClone FBS&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:129px;">SH30910.03</td>
			<td>Heat inactivate before use at 62 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">A7030-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin TPCK</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">T1426-50mg</td>
			<td>Make aliquots/Avoid freeze thawing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DEAE-Dextran</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">D9885-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">C3886-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">F8775-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Ethanol denatured Reagent Grade</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td>362808-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Avicel RC-591 NF</td>
			<td style="width:127px;">FMC BioPolymer USA</td>
			<td style="width:129px;">RC-591 NF</td>
			<td>Shake vigorously when reconsitiuting&#160; for &#62;30 min to homogenize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">UltraPure Agarose&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">C4888</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems

Plaque essais restent l&#39;une des méthodes les plus précises pour la quantification directe de virions infectieux et des substances antivirales par le comptage des plaques discrètes (unités infectieuses et les zones mortes cellulaires) en culture cellulaire. Ici, nous démontrons comment effectuer un test de la plaque de base, et comment les superpositions et les techniques différentes peuvent affecter la formation de plaque et de la production. Typiquement, les substrats de recouvrement solides ou semi-solides, tels que l&#39;agarose ou de la carboxyméthylcellulose, ont été utilisées pour limiter la propagation virale, la prévention de l&#39;infection aveugle à travers le milieu de croissance liquide. Superpositions immobilisées limitent infection cellulaire à la monocouche immédiatement environnante, ce qui permet la formation de foyers dénombrable discret et la formation de plaque postérieure. Pour surmonter les difficultés inhérentes à l&#39;utilisation de revêtements traditionnels, un nouveau revêtement liquide en utilisant de la cellulose microcristalline et la carboxyméthylcellulose de sodium a été de plus en plus utilisés en remplacement dans la normedosage de plaque. Liquides dosages de plaques de recouvrement peuvent être facilement réalisées en SD formats de plaques et 6 ou 12 selon les techniques traditionnelles et ne nécessitent aucun équipement spécial. En raison de son état liquide et la facilité d&#39;application ultérieure et l&#39;enlèvement, formats de plaques de microculture peuvent également être utilisés comme une alternative de débit rapide, précise et haute de titrages viraux à plus grande échelle. Utilisation d&#39;un polymère liquide non visqueux chauffé offre la possibilité de rationaliser le travail, conserve réactifs, l&#39;espace de l&#39;incubateur et augmente la sécurité de fonctionnement lorsqu&#39;il est utilisé dans les laboratoires de confinement traditionnels ou élevés que pas de chauffage du réactif ou la verrerie sont nécessaires. Superpositions liquides peuvent aussi se révéler plus sensibles que les superpositions traditionnels pour certains virus labiles.

La capacité de la méthode des plages d&#39;évaluer avec précision les titres viraux repose sur de nombreux facteurs: la sélection de la cellule hôte approprié, les médias appropriés et des conditions de croissance pour la viabilité cellulaire et virale, la propagation virale immobilisé, et une détermination précise de la période d&#39;incubation du virus de suffisamment de temps pour distinct et la formation de plaques dénombrable. Pour cette étude, les virus provenant de trois familles représentatives ont été choisies pour démontrer les différences dans: sélection superposition, des périodes d&#39;incubation, et morphologie de la plaque à travers différents types d&#39;échantillons. L&#39;encéphalite équine du Venezuela (VEEV) a été choisi comme modèle viral (+) ARN simple brin, ce qui peut provoquer une maladie importante chez les espèces et les êtres humains et des équidés représente la famille des Togaviridae. Influenza B souche Taiwan, un segmentée (-) virus à ARN simple brin infectant principalement les humains, représente la famille des Orthomyxoviridae. La vallée du Rift virus de la fièvre (FVR), un - virus à ARN simple brin de arthropode né infectant principalement les arthropodes, ()ruminants et les humains, a été sélectionné en tant que représentant de la famille des Bunyaviridae. Pour la FVR (Figure 1), les titres ont été déterminées à partir d&#39;une solution mère d&#39;une souche vivante atténuée de MP12 recombinant de la FVR dans un format de 12 plaque bien en utilisant CMC, l&#39;agarose, ou superpositions Avicel qui ont été incubés côté-à-côte pour après l&#39;infection de 72 h (HPI). Une plaque représentant montrant des dilutions allant de 10 -4 à 10 -7 peut être vu dans le panneau A. Plaques utilisant CMC et superpositions agarose a montré petits, clairs, et distinctes des plaques avec une bordure circulaire bien défini. Plaques avec un revêtement liquide étaient légèrement plus abondante et plus par rapport à l&#39;agarose et plaques CMC, et fourni une frontière moins distincte. Les titres viraux ont été comparées dans le panneau B de la totalité des superpositions exécution comparable. Afin d&#39;obtenir une comparaison visuelle claire entre les superpositions pour MP12 long avec un échantillon plus large à déterminer reprobilité, une plaque de 6 puits a été également fait l&#39;essai en trois exemplaires (Figure 2). Dans le format de plaque à 6 puits, l&#39;utilisation d&#39;une superposition de CMC a montré que les petites plaques d&#39;agarose soit des recouvrements ou liquides, qui sont de taille comparable à l&#39;autre. Bien que les titres viraux étaient similaires entre les trois superpositions (Groupe D), plaques formées dans les recouvrements agarose et liquides se sont révélés plus facile de compter en raison de leur plus grande taille. En contraste avec VFVR titres Veev morphologie de la plaque et entre les différentes superpositions variait considérablement (figure 3A). Plaques formées dans les recouvrements CMC ont montré une morphologie claire et distincte lors de l&#39;utilisation d&#39;un format de plaque à 12 puits, au détriment de la taille et de la sensibilité plaque (Groupe B). Contrairement à la CMC, l&#39;utilisation de liquides d&#39;agarose et a donné lieu à des superpositions de manière significative plus grandes plaques, ce qui indique une inhibition virale plus faible et une sensibilité accrue à la réplication VEEV. Cela a été confirmé précédemment lorsque l&#39;on compare uniquement agarose contre CMC en apaper publié par Juarez et al. 4. Bien agarose et des superpositions produits liquides plus grandes plaques de CMC, les plaques étaient mal définis et les frontières sont difficiles à compter dans un format à 12 puits, avec des superpositions de liquide fournissant la plus grande diffusion de la frontière. Lorsque les plaques ont été mises à l&#39;essai dans des plaques de 6 puits (figure 4), le plus grand format 6 puits nié la question de ouvertement grandes plaques qui étaient difficiles à différencier au format 12 puits, avec agarose et superpositions liquides prouvant supérieur aux superpositions CMC en termes de définition plaque et sensible (figure 4D). En comparaison à la FVR ou VEEV, la grippe fournit plusieurs défis uniques lorsque plaquing, telles que l&#39;exigence d&#39;une protéase externe. La sensibilité du virus de la grippe à différentes sélections de recouvrement a également été bien documentée dans le passé que des changements importants ont été constatés lors de modifications mineures comme marques de agarose différentes ont êtreen 9 utilisé. Il est intéressant pour la souche de grippe B Taiwan, l&#39;utilisation de CMC comme une superposition entraîné nettement plus petites plaques qui étaient difficiles à compter et se sont avérées difficiles à marquer de façon fiable (figure 5A). L&#39;utilisation d&#39;une couche d&#39;agarose a fourni les meilleurs plaques (groupe C), et a donné lieu à une coloration de fond plus foncé (probablement due à une augmentation de la viabilité de la monocouche), et présente des plaques claires et nettes dans la comparaison directe de l&#39;utilisation du revêtement liquide (partie B ). Un avantage particulier des polymères liquides plus de overlays solides et semi-solides, tels que l&#39;agarose et le CMC, réside dans la facilité d&#39;élimination et d&#39;application. Superpositions semi-solides nécessitent un chauffage, et la solidification peuvent se révéler problématique lors de la manipulation et l&#39;élimination. Afin de capitaliser sur ces avantages et à déterminer la faisabilité de l&#39;utilisation de Avicel d&#39;une manière à haut débit pour la FVR, un format de plaque de 96 puits a été mis à l&#39;essai à différentes concentrations d de recouvrementons (Figure 6). Pour VFVR MP-12, les dilutions ont été réalisées en quatre exemplaires à la fois 0,6 et 1,2% des concentrations finales de Avicel. Demande de recouvrement et l&#39;enlèvement est avérée simple, avec aucune différence apparente entre les répétitions ou entre les concentrations relevées, ce qui démontre un haut degré de reproductibilité. Lors de l&#39;évaluation, les plaques étaient distincts et dénombrable à l&#39;œil nu, ce qui démontre la possibilité d&#39;utiliser des superpositions liquides de manière à haut débit pour la FVR. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig1highres.jpg" /> Figure 1:. VFVR plaque de recouvrement en utilisant des comparaisons de plaques de 12 puits ont été ensemencées Veros à 2,5 x 10 5 cellules dans les plaques de 12 puits et infectées avec 200 ul en utilisant le même échantillon dilué en série à partir de la MP12. Après l&#39;infection de 1,5 ml superpositions de 0,3% d&#39;agarose 0,6%, Avicel, ou 1% de CMC (c finaleoncentrations), ont été appliquées afin de comparer directement les superpositions comme l&#39;a démontré dans le Panneau de A. plaques ont été comptées et titrés dans le Panneau B. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig2highres.jpg" /> Figure 2:. VFVR plaque de recouvrement en utilisant des comparaisons de plaques à 6 puits ont été ensemencées Veros à 5 x 10 5 cellules dans les plaques à 6 puits et infectées avec 400 ul en utilisant le même échantillon dilué en série à partir de la MP12. Trois ml superpositions de 0,3% d&#39;agarose 0,6%, Avicel, ou 1% de CMC, ont été appliquées afin de comparer directement les superpositions comme démontré dans la partie A, B, et C. Des expériences séparées ont été effectuées de façon identique à celle décrite pour panneaux AC, avec plaques comptés et titrés dans le Panneau de D (N = 3). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig3highres.jpg" /> Figure 3: &lt;strong&gt; plaque de VEEV comparaisons de superposition en utilisant des plaques de 12 puits. Veros ont été étalées à 2,5 x 10 5 cellules dans des plaques de 12 puits et infectées avec 200 ul en utilisant le même échantillon dilué en série à partir de la souche de vaccin TC-83 VEEV. Après l&#39;infection de 1,5 ml superpositions de 0,3% d&#39;agarose 0,6%, Avicel, ou 1% de CMC, ont été appliquées afin de comparer directement les superpositions comme l&#39;a démontré dans le Panneau de A. plaques ont été comptées et titré dans la partie B. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig4highres.jpg" /> Figure 4:. V EEV comparaisons plaque de recouvrement en utilisant des plaques à 6 puits ont été ensemencées Veros à 5 x 10 5 cellules dans les plaques à 6 puits et infectées avec 400 ul en utilisant le même échantillon dilué en série à partir de VEEV TC-83. Après l&#39;infection, 3 ml superpositions de 0,3% d&#39;agarose 0,6%, Avicel, ou un 1% de CMC, ont été appliquées afin de comparer directement les superpositions comme le montredans les panneaux A, B et C. Des expériences séparées ont été réalisées de manière identique, comme décrit pour les panneaux A - C, avec des plaques comptées et titrés dans le panneau D (N = 3). <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig5highres.jpg" /> Figure 5: comparaison de la grippe plaque de recouvrement des cellules MDCK ont été étalées à 5 x 10 5 cellules dans les plaques à 6 puits et infectées avec 400 ul d&#39;inoculum en utilisant le même échantillon dilué en série à partir de l&#39;influenza B Taiwan.. Aucun sérum bovin fœtal (FBS) a été utilisé dans le milieu de croissance ou des superpositions, comme FBS peut inhiber la propagation de la grippe par l&#39;inhibition de certaines protéases qui sont nécessaires pour la fusion virale. TPCK-trypsine a été ajouté à tous les recouvrements avant l&#39;application, afin de faciliter la fusion et l&#39;entrée virale par les cellules hôtes. Après l&#39;infection, 3 ml superpositions de 0,3% d&#39;agarose 0,6%, Avicel, ou 1% de CMC ont été appliquées afin de comparer directementles recouvrements comme démontré dans le Panneau A, B et C. Des expériences séparées ont été réalisées de manière identique, comme décrit dans les panneaux A - C, avec des plaques comptées et titrés dans le panneau D (N = 3). Alors que la moyenne a été prise pour plaques CMC ils se sont avérés difficiles à dénombrer de façon fiable comme ils ont démontré frontières diffuses et très petites tailles de plages. <img alt="Figure 6" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig6highres.jpg" /> Figure 6:. Haut débit superpositions de plaque à plaque de 96 puits de Veros plaqué à 3 x 10 4 cellules par puits, ont été infectées avec 50 ul d&#39;inoculum utilisant le même échantillon de départ dilué en série de la FVR MP12 pendant 1 heure, en quatre exemplaires. Pour les superpositions, 0,6 et 1,2% des concentrations finales de Avicel ont été mis à l&#39;essai afin de déterminer la faisabilité et la reproductibilité de l&#39;utilisation de revêtements liquides de manière à haut débit, Panneaux A et B. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> VFVR </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Type de cellule </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> période de l&#39;infection </td><td> 1 heure </td><td> 1 heure </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> Le temps d&#39;incubation </td><td> 3 jours </td><td> 2 jours </td><td> 3 jours </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Plaque conditions d&#39;essai d&#39;inoculation et types de cellules <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> VFVR </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Type de cellule </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Type de croissance</td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 2 </td></tr><tr><td> Plaque médias </td><td> Un 2xEMEM </td><td> Un 2xEMEM </td><td> 2xEMEM B </td></tr></tbody></table> Milieu Eagle modifié de Dulbecco complété avec 1% 10 de sérum bovin fœtal, 1% de L-glutamine, 1% Penicllin / streptomycine. Milieu Eagle modifié de Dulbecco complété avec 2. 1% de L-glutamine, 1% Penicllin / streptomycine, 0,2% de sérum-albumine bovine, 0,025% de HEPES, DEAE-Dextran 50 ug / ml. A. 2x milieu minimal essentiel (500 ml) additionné de 5% de FBS (25 ml), 1% acides aminés essentiels minimaux (5 ml), 1% de pyruvate de sodium (5 ml), 1% de L-Glutamine (5 ml), 2% Pen / Strep (10 ml). B. 2x médias essentiel minimal (500 ml) supplémenté avec 0,2% de sérum-albumine bovine, 1% acides aminés essentiels minimum (5 ml), 50 ug / ml, 0,025% de HEPES, le DEAE-dextrane, la trypsine-TPCK * * Juste avant la préparation, ajouter 1 pi par 25ml de 2 pg / ml de bouillon de TPCK-trypsine à l&#39;aliquote vous sera utilise pour mélanger avec de l&#39;agarose pour les plaques. Tableau 2: Plaque et virale / Cellulaire croissance Médias <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> VFVR </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Type de cellule </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> période de l&#39;infection </td><td> 1 heure </td><td> 1 heure </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> Le temps d&#39;incubation </td><td> 3 jours </td><td> 2 jours </td><td> 3 jours </td></tr></tbody></table> Solutions de superposition ne prendront pas fin lorsque fait si longtemps que la stérilité soit maintenue. Tableau 3: superpositions Stock <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 6 bien </td><td> 12 bien </td><td> 96 puits </td></tr><tr><td> Nombre de cellules / puits </td><td> 5 x 10 5 </td><td> 2,5 x 10 5 </td><td> 3 x 10 4 </td></tr><tr><td> Le volume de l&#39;inoculum (ul) </td><td> 400 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> le volume de recouvrement (ml) </td><td> 3 </td><td> 1,5 </td><td> 0,100 </td></tr></tbody></table> Tableau 4: formats de plaques

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Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Détermination de la concentration virale par Plaque Essais: Systèmes calque à l&#39;aide traditionnels et nouveaux

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

viral-concentration-determination-through-plaque-assays-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

110.1K vues.  George Mason University. Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

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Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

En utilisant un dosage Microarray pan-virale (Virochip) pour cribler des échantillons cliniques pour les pathogènes viraux

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Recherche

Immunologie et infection

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Analyses quantitatives de tous influenza de type A hémagglutinines virales et les neuraminidases utilisant des anticorps Universal en simples essais slot blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant limitations, viruses are more resistant to many inactivation processes and standard fecal indicators do not inform on the source of contamination. The development of cost-effective methods for the concentration of viruses from water and molecular assays facilitates the applicability of viruses as indicators of fecal contamination and as microbial source tracking (MST) tools. Adenoviruses and polyomaviruses are DNA viruses infecting specific vertebrate species including humans and are persistently excreted in feces and/or urine in all geographical areas studied. In previous studies, we suggested the quantification of human adenoviruses (HAdV) and JC polyomaviruses (JCPyV) by quantitative PCR (qPCR) as an index of human fecal contamination. Recently, we have developed qPCR assays for the specific quantification of porcine adenoviruses (PAdV) and bovine polyomaviruses (BPyV) as animal fecal markers of contamination with sensitivities of 1-10 genome copies per test tube. In this study, we present the procedure to be followed to identify the source of contamination in water samples using these tools. As example of representative results, analysis of viruses in ground water presenting high levels of nitrates is shown.
Detection of viruses in low or moderately polluted waters requires the concentration of the viruses from at least several liters of water into a much smaller volume, a procedure that usually includes two concentration steps in series. This somewhat cumbersome procedure and the variability observed in viral recoveries significantly hamper the simultaneous processing of a large number of water samples.
In order to eliminate the bottleneck caused by the two-step procedures we have applied a one-step protocol developed in previous studies and applicable to a diversity of water matrices. The procedure includes: acidification of ten-liter water samples, flocculation by skimmed milk, gravity sedimentation of the flocculated materials, collection of the precipitate and centrifugation, resuspension of the precipitate in 10 ml phosphate buffer. The viral concentrate is used for the extraction of viral nucleic acids and the specific adenoviruses and polyomaviruses of interest are quantified by qPCR. High number of samples may be simultaneously analyzed using this low-cost concentration method.
The procedure has been applied to the analysis of bathing waters, seawater and river water and in this study, we present results analyzing groundwater samples. This high-throughput quantitative method is reliable, straightforward, and cost-effective.

The study describes a cost-effective method for the identification of the source of fecal/urine contamination or contamination by nitrates in water using qPCR for the specific quantification of human/porcine/bovine DNA viruses, adenoviruses and polyomaviruses, proposed as MST tools.

Rentable méthode de suivi des sources microbiennes spécifiques utilisant des virus humains et animaux

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

Essai de plaque pour le norovirus murin

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

Les tests pour l&#39;identification de nouveaux antiviraux contre la fièvre catarrhale Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Utilisation de l&#39;Essai de superposition pour mesurer qualitativement la production bactérienne et la sensibilité à pneumocoque bactériocines

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phenomics de phages: approches physiologiques à caractériser de nouvelles protéines virales

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Early Viral entrée dosages pour l&#39;identification et l&#39;évaluation des composés antiviraux

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Mesure de la grippe neuraminidase Inhibition Titres d&#39;anticorps par-enzymatique lectine Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

Utilisation de cristallographie aux rayons X, biophysique, et des tests fonctionnels pour déterminer les mécanismes d&#39;administration des lymphocytes T Reconnaissance des récepteurs du cancer Antigènes