Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé (NIH) accorde R01-DK080752 et P50-DK064540. Nous remercions J. Loughman pour ses efforts dans l&#39;établissement de ce test.

Une. La culture de cellules de la vessie 5637 épithéliales Effectuez les étapes suivantes dans une hotte à flux laminaire de culture tissulaire préparé par irradiation UV et essuyé avec 70% d&#39;éthanol. <ol><li> Préparer un milieu RPMI-1640 contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS) [appelé RPMI +], stériliser par filtration en utilisant un filtre de 0,22 um de taille de pore, et chaude à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Décongeler un cryotube de 5637 cellules (American Type Culture Collection HTB-9; dérivée d&#39;un carcinome de la vessie) dans un bain d&#39;eau à 37 °. Transférer rapidement les cellules décongelées à un tissu flacon de 75 cm 2 de culture contenant 20 ml de RPMI +. </li><li> Incuber la fiole à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO2 jusqu&#39;à ce que les cellules sont confluentes à environ 95% (environ 6 x 10 6 cellules par flacon), environ 4 jours. </li><li> Pour repiquer les cellules 5637: <ol><li> Retirez le milieu du ballon. Laver les cellules avec tampon phosphate Salin de 10 ml Dulbeccoe (DPBS) à la température ambiante. </li><li> Ajouter 6 ml chaude (37 ° C) 0,05% de trypsine, une solution d&#39;EDTA à 0,02% dans le ballon, et incuber à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 15 min. </li><li> Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml, et le culot par centrifugation à 300 xg pendant 5 min. Retirer la solution de trypsine / EDTA. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans 6 ml de RPMI + (10 6 cellules / ml), et transfert de 1 ml (10 6 cellules) à un nouveau flacon de 75 cm 2 contenant 20 ml de RPMI +. </li></ol></li><li> Répétez l&#39;étape 1.4 pour repiquer les cellules tous les 4 jours ou lorsque les cellules atteignent 95% de confluence. </li></ol> 2. Ensemencement et croissance de 5637 cellules sur supports perméables Effectuez les étapes suivantes dans une hotte de culture de tissu en utilisant une technique aseptique. Pour des résultats optimaux, utiliser 5637 cellules qui ont subi moins de 10 sous-cultures. <ol><li> En utilisant des pinces stériles, inverser les supports perméables à un 25 mm boîte de culture des tissus profonds stérile. </li><li&gt; Trypsiniser un flacon de 75 cm2 de cellules 5637 à 95% de confluence selon les étapes 1.4.1-1.4.3. </li><li> En utilisant une pipette de 1000 ul, remettre en suspension les cellules doucement dans ~ 2 ml de RPMI + à une concentration de 3 x 10 6 cellules / ml, déterminé par comptage en utilisant un hémocytomètre cellule. </li><li> Appliquer 50 ul de la suspension de cellules (1,5 x 10 5 cellules) pour chaque support perméable sans toucher la membrane. Placer le couvercle sur le plat, et placer soigneusement le plat à 37 ° C avec 5% de CO 2 pour pas plus de 16 heures. </li><li> En utilisant des pinces stériles, à droite les supports perméables dans une plaque de 24 puits contenant 0,6 ml de RPMI + par puits. Ajouter 0,1 ml de RPMI + vers le réservoir supérieur de chaque support perméable. Incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Remplacez le support tous les 2 jours. Tout d&#39;abord, moyen d&#39;aspiration du réservoir supérieur suivi par le réservoir inférieur, et ensuite appliquer frais RPMI + dans l&#39;ordre inverse, vers le réservoir inférieur (0,6 ml), puis le rése supérieurervoir (0,1 ml). </li><li> Sept jours après le semis, les supports perméables à 5637 cellules, évaluer confluence des cellules. Remplir le réservoir supérieur avec du RPMI + (~ 0,35 ml). Les cellules confluentes sont suffisamment lorsque le milieu n&#39;est pas s&#39;équilibrer entre les réservoirs supérieur et inférieur. </li></ol> 3. Préparation de l&#39;inoculum bactérien <ol><li> En utilisant une technique aseptique, ajouter 20 ml de bouillon de culture approprié d&#39;un ballon de 250 ml avec un bouchon. Utilisez Luria-Bertani (LB) pour E. coli cultures, et ajouter des antibiotiques pour le bouillon, le cas échéant. </li><li> En utilisant une boucle d&#39;inoculation stérile, ensemencer le bouillon avec des bactéries à partir d&#39;un stock de glycérol ou une plaque de série. Pour les souches UPEC, incuber la culture bactérienne à 37 ° C pendant environ 16 heures, sans secousses (pour favoriser la production de pili de type 1). </li><li> Transférer la culture bactérienne dans un tube de centrifugeuse. Sédimenter les bactéries par centrifugation à 8000 xg pendant 10 min. </li><li> Décanter le surnageantEt remettre en suspension les bactéries dans du PBS à DO 600 = 1,000, ce qui correspond à ~ 10 9 UFC / ml. <ol><li> Pour générer un stimulus bactérien tué par la chaleur, incuber une partie aliquote (par exemple, ~ 1,5 x 10 8 CFU dans 150 ul) des bactéries remises en suspension à 55 ° C pendant 30 min. Plaque d&#39;une aliquote de la suspension tué par la chaleur de confirmer la mort bactérienne. </li></ol></li><li> Immédiatement avant utilisation, diluer les bactéries remises en suspension (vivent ou tués par la chaleur) de 10 fois à 10 8 UFC / ml dans RPMI chaud sans sérum [appelé RPMI-] dans un tube de centrifugeuse. </li></ol> 4. Isolement des neutrophiles humains du sang périphérique La collecte de sang de volontaires adultes nécessite l&#39;examen préalable et l&#39;approbation d&#39;un comité d&#39;examen institutionnel. Porter un équipement de protection individuelle approprié et la mise au rebut des matières dangereuses à éviter l&#39;exposition au sang humain. <ol><li> Environ 25 ml de sang veineux d&#39;un adulte en bonne santé volunteer doit être aspiré dans 3 tubes de collecte de sang contenant de l&#39;héparine de sodium stérile par du personnel formé à la saignée. <ol><li> Envelopper un garrot en caoutchouc autour du bras, au-dessus du coude. </li><li> Désinfecter le site d&#39;entrée, le pli du coude, en utilisant une aiguille stérile de 70% d&#39;alcool essuyer. </li><li> Fixer un support de tube en plastique pour un système d&#39;aiguille à ailes de papillon. </li><li> Insérez l&#39;aiguille dans une veine du pli du coude à un angle de 30 ° ou moins, biseau vers le haut. L&#39;aiguille a percé la veine quand une poussée de sang apparaît dans le tube en plastique. </li><li> Insérer un tube de collecte de sang dans le support de tube en matière plastique. Lorsque le premier tube de collecte est plein, le remplacer par le second tube de collecte. Répéter l&#39;opération avec le troisième tube. </li><li> Lorsque le troisième tube de collecte est d&#39;environ à moitié plein, enlever le garrot. </li><li> Couvrir le site de ponction avec une boule de coton stérile et retirer lentement l&#39;aiguille dans la veine. Faites glisser le bouclier protecteur sur l&#39;aiguille et le lieu ina biohazard contenant pour objets pointus. </li><li> Appliquer une pression sur le site de ponction. Couvrir le site de ponction et une boule de coton avec un pansement adhésif. </li><li> Retourner délicatement les tubes de collecte de sang pour disperser la héparine. </li></ol></li></ol> Effectuez les étapes suivantes dans une hotte de culture de tissu en utilisant une technique aseptique. <ol start="2"><li> L&#39;utilisation d&#39;un pipette de 10 ml, transférer délicatement le sang à un, 50 ml stériles nouveau tube conique. Ajouter un volume équivalent de 3% (p / v) de dextrane à 0,9% de NaCl et mélanger par retournement. Incuber le tube en position verticale à température ambiante pendant 20 min. </li><li> Sans perturber la couche inférieure, aspirer soigneusement la couche supérieure et la transférer à un nouveau tube conique de 50 ml. Sédimenter les cellules par centrifugation à 300 xg pendant 10 min. Jeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans un volume de NaCl à 0,9% équivalent au volume initial de sang. </li><li> Couche 10 ml de solution de centrifugation par densité de moins de la suspension de cellules, préservant l&#39;interface entre les deux phases. Centrifuger à 400 g pendant 30 min sans frein. Jeter le surnageant. </li><li> Pour lyser les restants des globules rouges, remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de NaCl 0,2% froid. Incuber pendant 30 sec, puis ajouter rapidement 10 ml de NaCl 1,6% froid pour rétablir isotonique. </li><li> Pellet les cellules par centrifugation à 300 g pendant 6 min. Jeter le surnageant. </li><li> Répéter les étapes 4.6 à 4.7 jusqu&#39;à ce que le culot cellulaire semble être exempt de globules rouges, typiquement trois cycles de lyse. </li><li> En utilisant une pipette de 1000 ul, remettre en suspension le culot de cellules, principalement des PMN, à chaud (37 ° C) du milieu RPMI-à une concentration de 10 7 cellules / ml, déterminée par comptage de cellules en utilisant un hématimètre. Maintenir les cellules à 37 ° C jusqu&#39;à utilisation. Typiquement, PMN viabilité et la pureté sont&gt; 99% évaluée par exclusion au bleu trypan et la visualisation de la morphologie nucléaire après coloration, respectivement. </li></ol> 5. Transuroepithelial neutrophiles migrations Commedire Effectuez les étapes suivantes dans une hotte de culture de tissu en utilisant une technique aseptique. Utilisez uniquement des supports perméables portant confluentes 5637 couches de cellules, tel que déterminé à l&#39;étape 2.7. Les plaques à 24 puits contenant du milieu RPMI-peuvent être préparés à l&#39;avance et conservées à 37 ° C avec 5% de CO2 jusqu&#39;à utilisation. <ol><li> Aliquote de 1 ml réchauffer RPMI-par puits dans une plaque de 24 puits; préparer 3 puits par support perméable. </li><li> Aspirer le milieu des réservoirs supérieur et inférieur des supports perméables. </li><li> En utilisant des pinces stériles, transférer les supports perméables à la plaque de 24 puits préparé à l&#39;étape 5.1. Laver les supports perméables à trois reprises par le transfert des supports de puits en puits. </li><li> Si un inoculum bactérien est utilisé, inverser les supports perméables à un 25 mm boîte de culture de tissus profonds stérile. Si un chemoattractant (par exemple, la N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) ou IL-8) doit être utilisé, passez à l&#39;étape 5.6. </li><li> Pour les expériences avec bact vivant ou tuéstimuli erial, inoculer le côté apical de chaque support perméable avec 60 ul de RPMI-(pseudo-infection) ou avec l&#39;inoculum bactérien (6 x 10 6 CFU) préparé à l&#39;étape 3.5. Placer le couvercle sur la boîte et incuber à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 1 heure. </li><li> Ajouter 0,6 ml de RPMI-par puits dans une plaque de 24 puits à faible attachement; préparer 1 puits par support perméable. Préparer trois puits contenant 0,5 ml du milieu RPMI-énumérer entrée de PMN. <ol><li> Si un agent chimio-attractif est utilisé à la place de bactéries, la chimio-attractif pour ajouter 0,6 ml de RPMI-dans la plaque à 24 puits préparée à l&#39;étape 5.6. </li></ol></li><li> Droite supports perméables dans la plaque de 24 puits à faible attachement. </li><li> Ajouter 0,1 ml PMN (10 6 PMN), préparé à l&#39;étape 4.9, le réservoir supérieur (côté basolatéral) de chaque support perméable. Ajouter 100 ul PMN directement aux puits contenant 500 pi RPMI. Incuber à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 1 heure. </li><li> En utilisant des pinces stériles, gratter délicatement l&#39;Membrane perméable à l&#39;appui de la contre le bord du puits pour éliminer les PMN supplémentaire à partir du côté apical et ensuite éliminer le support. </li><li> Recueillir PMN en grattant doucement le fond de chaque puits à la pointe de la pipette de 1000 pi, et transférer les suspensions de PMN à Microfuge tubes. </li><li> Énumérer PMN en utilisant un hématimètre. </li><li> Pour calculer le nombre total de PMN dans le réservoir inférieur, il faut multiplier le nombre de PMN dans de 1 mm 2 (100 nl) par 6000. Les données peuvent être exprimées en pourcentage de l&#39;entrée PMN, ou que le nombre de PMN normalisées à 10 6 entrée PMN. </li></ol>

<ol>
	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+chamber+in+chemotaxis.">Orientation chamber in chemotaxis.</a> Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).</li><li>Chin, A. C., Parkos, C. 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Biol. 341, 205-215 (2006).</li><li>S&#228;ve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+adenosine+A2A+receptors+inhibits+neutrophil+transuroepithelial+migration.">Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration.</a> Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).</li><li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism.">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

En utilisant une lignée de cellules épithéliales de la vessie de culture et fraîchement isolé PMN humain, nous avons établi un modèle in vitro de migration des neutrophiles transuroepithelial. Ce modèle a contribué à commencer à disséquer la complexité de la réponse immunitaire innée lors de l&#39;infection des voies urinaires (UTI), une infection bactérienne très commune généralement causée par UPEC 9. Au cours de l&#39;infection de la vessie, ou la cystite, le recrutement de PMN...

Le mouvement des cellules dans tout le corps, souvent sur de longues distances, est nécessaire pour la croissance et le développement, la cicatrisation des plaies, et la réponse immunitaire. La migration cellulaire est complexe et nécessite la coordination de nombreux processus différents, y compris les cascades de signalisation et le réarrangement des composants du cytosquelette. Les cellules peuvent se déplacer de façon aléatoire (chimiokinèse) ainsi que vers des gradients chimiques définies (chimiotaxie). De nombreuses techniques ont été développées pour étudier la migration cellulaire in vitro. La technique la plus ancienne et la plus commune, la chambre de Boyden, se compose d&#39;un système vertical à deux compartiments où une substance chimiotactique est placé dans la chambre et les cellules d&#39;intérêt bas sont placés dans la chambre supérieure 1. La circulation des cellules à travers le filtre perméable, avec des pores d&#39;une taille définie, séparant les deux chambres est surveillée. D&#39;autres techniques ont été développées pour étudier la migration cellulaire, y compris la chambre Zigmond 2 et la chambre Dunn3. Ces approches collectives ont donné un aperçu significatif dans le mouvement de nombreux types de cellules différents. En plus d&#39;interroger les principes de base de la chimiokinèse et la chimiotaxie, des dosages à deux chambres ont facilité l&#39;étude de la migration des cellules à travers les composants de la matrice extracellulaire et les deux couches de cellules endothéliales et épithéliales. Un avantage des systèmes à deux chambres par rapport aux autres techniques est que la membrane poreuse peut être revêtu avec des protéines telles que le collagène ou le fibrinogène, et la migration cellulaire à travers une barrière de la matrice extracellulaire analogue peut être évaluée. En outre, les lignées cellulaires cultivées peuvent être cultivées et différenciées sur les supports perméables. Pour étudier le mouvement des cellules à travers une barrière endothéliale, les cellules endothéliales en culture sont ensemencées et cultivées dans le réservoir supérieur des supports perméables. Cellules mobiles, tels que les cellules du système immunitaire, sont ajoutés au réservoir supérieur et la migration dans le réservoir inférieur à travers la sallebarrière endothéliale dans le sens physiologique apicale à basolatérale est observée. Ce modèle a été inestimable dans la compréhension de l&#39;extravasation des cellules immunitaires de la circulation sanguine. A la différence de la migration trans-endothéliale, la circulation des cellules à travers une barrière épithéliale se produit généralement dans le sens basolatéral à apical. Afin de modéliser ces événements in vitro, les chercheurs semences et la croissance des cellules épithéliales cultivées sur la face inférieure des supports perméables. Cellules mobiles sont ajoutés au réservoir supérieur et la migration à travers la barrière epitheliale, qui représente le sens basolatéral à apical, est surveillée. Ces modèles de migration trans-épithéliale ont contribué de manière significative à notre compréhension des réactions inflammatoires au niveau des surfaces muqueuses, en particulier ceux du poumon et l&#39;intestin 4,5. En revanche, le trafic des cellules immunitaires à travers l&#39;épithélium du tractus urinaire a reçu beaucoup moins d&#39;attention. Pour approfondir notre understanding des réponses immunitaires innées dans les voies urinaires pendant l&#39;infection avec uropathogène Escherichia coli (UPEC), nous avons développé un test in vitro, le test de la migration des neutrophiles transuroepithelial, qui permet l&#39;étude des leucocytes polynucléaires (PMN; neutrophiles) mouvement à travers une barrière vessie épithéliale 6 -8. Comme avec d&#39;autres modèles à deux chambres de migration trans-épithéliale, des cellules humaines cultivées de la vessie épithéliales sont cultivées sur la face inférieure d&#39;un support perméable et forment des couches epitheliales confluentes. Les neutrophiles humains, isolés à partir de sang veineux, sont appliquées sur le côté basolatéral de la couche epitheliale, et la migration à travers l&#39;épithélium dans le sens basolatéral à apical physiologiquement pertinent est quantifiée en réponse à l&#39;infection par différentes souches de E. coli ou de la présence de molécules chimiotactiques. De nombreuses recherches ont porté sur le mouvement des neutrophiles, à la fois la chimiokinèse et la chimiotaxie, en l&#39;absence de types de cellules additionnelles. Le dosage de la migration des neutrophiles transuroepithelial est avantageuse car elle prend en compte les interactions complexes entre les cellules épithéliales de la vessie et les cellules du système immunitaire lors de l&#39;infection. Cette docile modèle in vitro a le potentiel de permettre la vérification détaillée de la réponse immunitaire au niveau des surfaces uroépithéliales.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Inserts (i.e.&#160;permeable supports)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td>6.5 mm, 3 &#956;m pore, polyester membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>366480</td>
			<td>16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>367281</td>
			<td>21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer one-use, nonstackable holder</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>364815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4876</td>
			<td>From Leuconostoc mesenteroides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td>24-well, clear flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reconstituted in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CXCL8/IL-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL</td>
			<td>Reconstituted in PBS to 100 &#956;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative assessment of human neutrophil migration across a cultured bladder epithelium

Le recrutement de cellules immunitaires de la périphérie vers le site de l&#39;inflammation est une étape essentielle dans la réponse immunitaire innée à n&#39;importe quelle surface de la muqueuse. Au cours de l&#39;infection de la vessie, les leucocytes polymorphonucléaires (PMN; neutrophiles) migrent de la circulation sanguine et traversent l&#39;épithélium de la vessie. L&#39;incapacité à résoudre l&#39;infection en l&#39;absence d&#39;une réponse neutrophile démontre l&#39;importance de PMN dans la défense de la vessie. Afin de faciliter la colonisation de l&#39;épithélium de la vessie, uropathogène d&#39;Escherichia coli (UPEC), l&#39;agent causal de la majorité des infections du tractus urinaire (ITU), atténuer la réponse inflammatoire aiguë en utilisant une variété de mécanismes partiellement définies. Pour approfondir l&#39;interaction entre l&#39;hôte et l&#39;agent pathogène bactérien, nous avons développé un modèle in vitro de cet aspect de la réponse immunitaire innée à l&#39;UPEC. Dans le dosage de la migration des neutrophiles transuroepithelial, une variante de la chambre de Boyden, en culture vessie epithElial cellules sont cultivées jusqu&#39;à confluence sur la face inférieure d&#39;un support perméable. PMN sont isolés à partir de sang veineux humain, et sont appliquées sur le côté basolatéral des couches de cellules épithéliales de la vessie. Migration des PMN représentant la direction basolatérale à apicale physiologiquement pertinents en réponse à une infection bactérienne ou molécules chimiotactiques est énumérée en utilisant un hématimètre. Ce modèle peut être utilisé pour étudier les interactions entre les cellules eucaryotes et UPEC ainsi que pour interroger les exigences moléculaires pour la traversée de l&#39;épithélium de la vessie par les PMN. Le modèle de la migration des neutrophiles transuroepithelial fera progresser notre compréhension de la réponse inflammatoire initiale à l&#39;UPEC dans la vessie.

Le dosage de la migration des neutrophiles transuroepithelial permet l&#39;évaluation quantitative de la migration des PMN humains à travers les couches de cellules épithéliales de la vessie en culture en réponse à divers stimuli (figure 1B). Alors que le protocole est très simple, il existe un certain nombre de variables qui peuvent influencer la migration des PMN et par conséquent d&#39;affecter la reproductibilité de cet essai. Des mesures devraient être prises lors de la préparation des s...

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Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Nous avons développé un modèle in vitro qui imite un élément important de la réponse inflammatoire aiguë lors d&#39;une infection de la vessie avec Escherichia coli uropathogènes. Le dosage de la migration des neutrophiles transuroepithelial permet une évaluation quantitative de la migration des neutrophiles humains à travers l&#39;épithélium de la vessie, cultivées sur des supports perméables, en réponse à une infection bactérienne ou substances chimiotactiques.

Évaluation quantitative des neutrophiles migrations humaines à travers une culture d&#39;épithélium de la vessie

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

quantitative-assessment-human-neutrophil-migration-across-cultured

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.9K vues.  Washington University School of Medicine.  Nous avons développé un modèle in vitro qui imite un élément important de la réponse inflammatoire aiguë lors d'une infection de la vessie avec Escherichia coli uropathogènes. Le dosage de la migration des neutrophiles transuroepithelial permet une évaluation quantitative de la migration des neutrophiles humains à travers l'épithélium de la vessie, cultivées sur des supports perméables, en réponse à une infection bactérienne ou ...

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Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

Expansion, purification et d&#39;évaluation fonctionnelle des cellules NK humaines périphérique Sang

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Recherche

Immunologie et infection

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

Suivi des rampants neutrophiles intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus par microscopie intravitale Vidéo

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

Une évaluation quantitative de la migration cellulaire par le test de motilité piste Phagokinetic

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Test pour mesurer l&#39;adhésion des neutrophiles à Activé cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires dans des conditions statiques

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

In vitro Essai de coculture pour évaluer la migration transépithéliale des neutrophiles induite par l’agent pathogène

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Human neutrophiles Chambre flux Essai d&#39;adhésion

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

Développement et identification d&#39;une sous-population Novel of Human neutrophiles dérivé phagocytes géant<em&gt; In vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

In Vitro Formation canine piège extracellulaire neutrophiles : Analyse dynamique et Quantitative par microscopie de Fluorescence

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

Évaluation de la migration des lymphocytes dans un système de transmigration ex vivo

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water while preventing passage of luminal bacteria and exogenous substances. A breach of this layer results in increased permeability to luminal contents and recruitment of immune cells, both of which are hallmarks of pathologic states in the gut including inflammatory bowel disease (IBD). 
Mechanisms regulating epithelial barrier function and transepithelial migration (TEpM) of polymorphonuclear neutrophils (PMN) are incompletely understood due to the lack of experimental in vivo methods allowing quantitative analyses. Here, we describe a robust murine experimental model that employs an exteriorized intestinal segment of either ileum or proximal colon. The exteriorized intestinal loop (iLoop) is fully vascularized and offers physiological advantages over ex vivo chamber-based approaches commonly used to study permeability and PMN migration across epithelial cell monolayers.
We demonstrate two applications of this model in detail: (1) quantitative measurement of intestinal permeability through detection of fluorescence-labeled dextrans in serum after intraluminal injection, (2) quantitative assessment of migrated PMN across the intestinal epithelium into the gut lumen after intraluminal introduction of chemoattractants. We demonstrate feasibility of this model and provide results utilizing the iLoop in mice lacking the epithelial tight junction-associated protein JAM-A compared to controls. JAM-A has been shown to regulate epithelial barrier function as well as PMN TEpM during inflammatory responses. Our results using the iLoop confirm previous studies and highlight the importance of JAM-A in regulation of intestinal permeability and PMN TEpM in vivo during homeostasis and disease. 
The iLoop model provides a highly standardized method for reproducible in vivo studies of intestinal homeostasis and inflammation and will significantly enhance understanding of intestinal barrier function and mucosal inflammation in diseases such as IBD.

Dysregulated intestinal epithelial barrier function and immune responses are hallmarks of inflammatory bowel disease that remain poorly investigated due to a lack of physiological models. Here, we describe a mouse intestinal loop model that employs a well-vascularized and exteriorized bowel segment to study mucosal permeability and leukocyte recruitment in vivo.

Évaluation fonctionnelle de la perméabilité intestinale et de la migration transépithéliale des neutrophiles chez la souris à l’aide d’un modèle normalisé de boucle intestinale

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...