Ce travail a été soutenu par des fonds du ministère des animaux et aviaires Sciences de BT.

Toutes les expériences animales ont été approuvés par la Région Beltsville soin et l&#39;utilisation des animaux Comités (BAACUC 11-015) en conformité avec l&#39;USDA Animal Care et Directives d&#39;utilisation. Une. Anesthésie et l&#39;analgésie (commune pour les deux interventions chirurgicales) <ol><li> Peser la souris et charger les anesthésiques et analgésiques suivants dans deux seringues de 1 ml avec 27 g d&#39;aiguilles: <ol><li> La kétamine (0,1 mg / g: 0,01 ml / g d&#39;une solution à 10 mg / ml) et de xylazine (0,01 mg / g: 0,005 ml / g d&#39;une solution à 2 mg / ml). </li><li> La buprénorphine (0,1 pg / g: 0,01 ml d&#39;une solution à 0,01 mg / ml). </li></ol></li><li> Immobiliser la souris en décrochant le peau du cou au plus près des mâchoires que possible avec le pouce et l&#39;index et tenant la queue entre les petits et l&#39;annulaire. </li><li> Injecter mélange de kétamine-xylazine par voie intrapéritonéale. Pour éviter de percer les organes internes, tenir la souris avecsa tête légèrement au-dessous du niveau de ses hanches (figure 1A) </li><li> Injecter buprénorphine sous-cutanée dans la peau du maintien de cou entre le pouce et l&#39;index (figure 1B). </li><li> Laissez la souris dans la cage (propre et sans aucun autre animal) sur une scène chaude. </li><li> Une fois inconscient, vérifier l&#39;absence de réflexes du pied arrière (vérifié par pincement de l&#39;orteil). Appliquer une pommade pour les yeux pour éviter la sécheresse de l&#39;œil et de vérifier l&#39;absence de réflexe palpébral (figure 1C). </li><li> Ce protocole prévoit un plan d&#39;anesthésie chirurgicale pour un minimum de 30 minutes, assez pour effectuer les procédures décrites ci-dessous (les protocoles 2 et 3). Si des temps plus longs sont nécessaires, une injection supplémentaire de la kétamine + xylazine avec la moitié du dosage décrit dans 1.1.1 peut être appliquée après 30 min. Un changement dans le mode de respiration pour une plus rapide et une irrégularité indique le loss du plan d&#39;anesthésie appropriée. </li></ol> 2. Vasectomie <ol><li> Utilisez un homme avec une capacité d&#39;accouplement prouvé. </li><li> Stériliser les instruments chirurgicaux, nettoyer les surfaces où la chirurgie sera effectuée et les essuyer avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Effectuer anesthésie détaillé précédemment (Protocole 1), la vérification de la perte des réflexes. </li><li> Placez la souris sur une scène chaude, enlever la fourrure avec une tondeuse électrique de la région ventrale entre deux lignes transversales imaginaires placé 0,5 cm et 2,5 cm au-dessus du pénis (figure 2A). </li><li> Désinfecter la zone rasée par essuyage séquentiel avec 10% de l&#39;iode de povidone, et de 70% d&#39;éthanol. </li><li> Placez la souris en position couchée avec sa queue vers le chirurgien et la couverture avec une serviette stérile avec un trou d&#39;exposer la zone rasée. Éclairer la zone chirurgicale. </li><li> Effectuez une incisio de la peau longitudinale 10-15 mmn à la ligne médiane de l&#39;abdomen, à environ 1 cm au-dessus du pénis. Maintenez la peau avec dressing pince dentelées et puis couper avec des ciseaux (Figures 2A et 2B). </li><li> Effectuer une incision longitudinale de 5-10 mm dans la ligne blanche. Tenez le muscle avec microdissecting forceps dentelées et couper avec des ciseaux (figure 2C). </li><li> Prenez le coussin adipeux des testicules d&#39;un côté avec micro dissection forceps dentelées et tirez pour exposer les testicules, les canaux déférents et l&#39;épididyme. Canaux déférents est situé en dedans de l&#39;testicule et il est un tube sans distinguer clairement (pas attaché à la paroi du testicule comme l&#39; épididyme) avec un vaisseau sanguin le long d&#39;un côté (figure 2D). </li><li> Tenir le canal déférent avec dissection dentelée micro forceps, pinces à pansement flamme jusqu&#39;à ce qu&#39;ils deviennent rouges (figure 2E </strong&gt;), puis les utiliser pour couper et cautériser le canal déférent de deux points à la fois (figure 2F). La coupe doit enlever une partie d&#39;environ 5 mm et laisser deux extrémités cautérisés clairement séparés (figure 2G). </li><li> Déplacez les testicules, épididyme et le canal déférent vers la cavité abdominale. </li><li> Passez à l&#39;étape 9 dans l&#39;autre testicule. </li><li> Suturer le muscle avec un ou deux points de suture de matelassier horizontale à base de 5/0 suture absorbable (figure 2H). </li><li> Suturer la peau avec un ou deux tondeuses de la plaie (figure 2I). </li><li> Identifier le vasectomisé (de boucle d&#39;oreille, tatouage doigt ...), déplacer la cage placée sur une étape chaleureuse et observer jusqu&#39;à ce qu&#39;il récupère de l&#39;anesthésie (conscient et maintenir décubitus sternal). Une injection sous-cutanée de 0,5 à 1 ml de solution saline chaude améliore redécouverte. Enregistrer les incidents pouvant se produire pendant le transfert vasectomie, ajouter antibiotique à l&#39;eau potable. </li><li> Clips plaies peuvent être retirés 10 jours après la vasectomie avec un dissolvant blessure de tondeuse ou une paire de pinces à dents. Le mâle vasectomisé sera prête à s&#39;accoupler 2 semaines après la chirurgie. </li><li> Testez l&#39;infertilité du mâle vasectomisé par accouplement avec des femelles fertiles avant de l&#39;utiliser pour obtenir des bénéficiaires. </li></ol> 3. Utéro-tubaire de transfert d&#39;embryons <ol><li> Souris morula ou blastocyste peuvent être transférés par cette technique à un destinataire femelle pseudo à 2,5 dpc. </li><li> Préparer embryon pipette en verre de manipulation: <ol><li> Polir les extrémités des capillaires en verre, afin d&#39;éviter d&#39;endommager le porte-pipette. </li><li> Adoucir une partie médiane du capillaire de verre par chauffage d&#39;une amende flamme tout en tournant légèrementle capillaire avec les deux mains de manière synchrone. Une fois la section capillaire devient mou et malléable (rouge clair), le retirer rapidement de la flamme et tirez les deux extrémités pour réduire son diamètre externe de 130-150 um. </li><li> Attendez que le verre refroidisse et le couper en marquant légèrement la partie étroite avec un crayon pointe de diamant, pierre abrasive ou lime à ongles et en tirant des deux côtés. La rupture doit être propre et perpendiculaire </li></ol></li><li> Polir la pointe à la flamme très rapidement, laissant une ouverture de 100-130 um. Les pipettes peuvent être stockés pour une utilisation ultérieure. </li><li> Chaud médias de manipulation de l&#39;embryon (CZBH ou M2, voir la discussion). </li><li> Stériliser les instruments chirurgicaux, nettoyer les surfaces où la chirurgie sera effectuée et les essuyer avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Effectuer anesthésie détaillé précédemment (Protocole 1), la vérification de la perte des réflexes. </li><li> Garder til la souris sur une scène chaude, retirez la fourrure avec une tondeuse électrique de la région dorsale entre les genoux et les nervures distales (figures 3A et 3B). </li><li> Désinfecter la zone rasée par essuyage séquentiel avec 10% de l&#39;iode de povidone, et de 70% d&#39;éthanol. </li><li> Déplacez les embryons de l&#39;incubateur pour les médias de manipulation de l&#39;embryon préchauffé. </li><li> Déplacez le destinataire à un stade chaud sous la loupe binoculaire et placez-le en position latérale sujettes au chirurgien (avec sa tête regardant vers la droite ou la gauche du chirurgien). </li><li> Couvrir la zone avec une serviette stérile avec un trou d&#39;exposer la zone rasée et éclairer la zone chirurgicale. </li><li> Effectuer un 1 cm transversale (verticale) incision dans la peau à un endroit situé sur le crâne ⅓ de la ligne entre la dernière côte et les hanches et le ⅓ dorsale de la ligne entre le dos et l&#39;abdomen (figures 3A unee 3B). Maintenez la peau avec dressing pince dentelées et couper avec des ciseaux (figure 3C). </li><li> Une fois que la peau a été coupée, de l&#39;ovaire (rouge / orange) ou le pad adipeux entourant l&#39;ovaire (blanc) peuvent être visualisées à travers la paroi du corps. Effectuez une 0,3-0,5 cm transversale (verticale) incision dans la paroi du corps sur l&#39;ovaire ou un coussin adipeux dans un endroit où l&#39;incision ne coupe pas tout navire grande de sang. Tenez le muscle avec micro dissection pince dents de scie et couper avec des ciseaux (figure 3D). </li><li> Déplacez la souris pour avoir sa tête tournée vers le chirurgien. </li><li> Chargez la manipulation pipette de l&#39;embryon (figure 3E): <ol><li> Permettre aux médias CZBH à monter par capillarité à travers la partie étroite de la pipette de manipulation jusqu&#39;à environ 5 mm de la partie la plus large. </li><li> Prenez une petite bulle d&#39;air (0,2-0,5 mm). </li><li> Présentez les embryons (5-10) dansune quantité minimale de supports (2-4 mm). </li><li> Prenez une autre petite bulle d&#39;air (0,2-0,5 mm) et une petite quantité de médias (0,5-1 mm). </li><li> Laisser la pipette en verre fixé au support de l&#39;aspirateur de la bouche ou au dispositif actionné à la main, prêt à l&#39;étape 3.17. </li></ol></li><li> Prenez le coussin adipeux entourant l&#39;ovaire avec micro dissection forceps en dents de scie et tirez-le vers la tête de la souris pour exposer l&#39;ovaire, oviducte, et une petite partie de l&#39;utérus supérieure de la cavité abdominale (figures 3F et 3G). </li><li> Maintien de la pièce aspirateur à bouche dans la bouche, prêt à être utilisé, prenez le pad adipeux avec micro dissection pince dents de scie pour déplacer l&#39;oviducte et exposer la jonction utéro-tubaire (c&#39;est à dire où l&#39;oviducte répond l&#39;utérus). </li><li> Garder la jonction utéro-tubaire accessible, prendre de légères micro pinces à dissection courbes de la main gauche (pour un droitier) et les placer juste en dessousla jonction utéro-tubaire saisissant l&#39;oviducte sur 2 mm au-dessus de la partie. </li><li> Tenir la jonction utéro-tubaire avec les légères micro pinces à dissection courbes, percer la section oviducte à proximité de la pince avec une aiguille de calibre 27 (figure 3H). </li><li> Insérez l&#39;embryon manipulation pipette dans l&#39;orifice effectué avec l&#39;aiguille et l&#39;avance de l&#39;utérus à travers la jonction utéro-tubaire (figures 3I et 3J). Une fois la pipette a passé la jonction utéro-tubaire (Figure 3K), il se glisse facilement. Ne pas progresser très loin dans l&#39;utérus pour éviter d&#39;endommager l&#39;endomètre (pas plus de 3 mm) et le blocage de la pipette par des débris. </li><li> Relâchez les embryons dans l&#39;utérus par soufflant doucement (Figure 3L). Les bulles d&#39;air doivent passer par l&#39;utérus. Certains médias-dessus de la première bullepeuvent également être disséminés dans l&#39;utérus, mais éviter d&#39;introduire plus d&#39;air, car il pourrait entraver l&#39;implantation. </li><li> Retirer la pipette juste après embryons ont été libérés dans l&#39;utérus. </li><li> Déplacez l&#39;oviducte et de l&#39;ovaire vers la cavité abdominale en saisissant le pad adipeux. </li><li> Suturer le muscle avec un point de matelassier horizontale avec 5/0 suture absorbable (figure 3M). </li><li> Suturer la peau avec une tondeuse de la plaie (figure 3N). </li><li> Passez à l&#39;étape 10 de l&#39;autre côté si nécessaire. </li><li> Identifier le destinataire (boucle d&#39;oreille, tatouage doigt ...), le déplacer vers sa cage (placé sur une scène chaude) et observer jusqu&#39;à ce qu&#39;il récupère de l&#39;anesthésie (conscient et maintenir décubitus sternal). </li><li> Annoter les incidences possibles survenant pendant le transfert d&#39;embryons et d&#39;ajouter des antibiotiques à l&#39;eau potable. Un 0,5-1 ml injection sous-cutanée de sali chaudsolution ne améliore la récupération. </li><li> Clips plaies peuvent être retirés 10 jours après le transfert d&#39;embryon avec un dissolvant plaie de coupe ou deux paires de pinces (Figure 3O). Le destinataire peut être pesé ce jour pour évaluer la grossesse et estimer le nombre de chiots. Fournir du matériel niché au destinataire 15 jours après le transfert d&#39;embryon. </li></ol>

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Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

La vasectomie est une technique chirurgicale relativement simple qui ne comporte pas de difficultés majeures. Quand la stérilisation avec de la povidone iode et de l&#39;éthanol assurez-vous que le dernier lavage (avec de l&#39;éthanol) supprime povidone iode, car il peut irriter le péritoine. L&#39;accès au canal déférent peut également être obtenue par le scrotum ou la réalisation d&#39;une incision transversale dans l&#39;abdomen 8. Incision scrotale a été recommandé de transversales...

Le transfert d&#39;embryons est probablement l&#39;intervention chirurgicale le plus souvent réalisée dans le modèle de souris. Cette technique est essentielle pour obtenir la progéniture d&#39;embryons in vitro soumis à des techniques de manipulation dans et, par conséquent, constitue une étape nécessaire pour le développement de modèles génétiquement modifiés par injection pronucléaire, transduction lentivirus, ou la formation de chimère. En outre, la technique permet l&#39;étude des effets sur le développement de diverses insultes qui se produisent au cours du développement préimplantatoire. L&#39;utilisation des techniques de reproduction artificielle 1 ou l&#39;exposition à des concentrations anormales de différentes substances ou métabolites 2 mai affecter le développement de l&#39;embryon, entraînant des échecs d&#39;implantation ou placentation et les effets à long terme sur la progéniture. Une technique de transfert d&#39;embryons fiable et reproductible est cruciale pour tester les effets négatifs possibles du traitement expérimental sur l&#39;implantation et le développement du fœtus chez un homme cohérentner. Embryons préimplantatoires murins peuvent être transférés à un destinataire femelle soit dans l&#39;oviducte par les ampoules de 0,5 jours après le coït (DPC) des destinataires pseudo-(transfert de l&#39;oviducte) 3,4 ou dans l&#39;utérus de 2,5 dpc destinataire pseudogestante (transfert de l&#39;utérus) 5,6 en fonction de leur stade de développement. Des embryons au stade de blastocyste, tels que ceux qui sont utilisés pour générer des souris chimères par injection de cellules souches embryonnaires pluripotentes ou induites, sont généralement transférés par transfert de l&#39;utérus. Blastocystes peuvent aussi être transférées à l&#39;oviducte d&#39;une DPC bénéficiaire de 0,5, mais il constitue un test moins physiologique pour les perturbateurs de développement, parce que l&#39;embryon subit diapause et dispose de 2 jours pour récupérer de l&#39;insulte avant l&#39;implantation a lieu. transfert de l&#39;utérus implique la perforation de la paroi de l&#39;utérus avec une aiguille étroit afin de générer une ouverture qui permet l&#39;accès d&#39;une pipette manipulation de l&#39;embryon dans la lumière utérine. Aien que cette technique peut donner de bons résultats, la survie à long terme (à savoir le pourcentage d&#39;embryons transférés qui se développent à un chiot) est souvent faible et imprévisible 7,8. La perforation de la paroi utérine entraîne des effets secondaires néfastes. Tout d&#39;abord, le myomètre est un tissu très vascularisé et sa perforation en résulte souvent une petite hémorragie. Le sang peut bloquer la pipette de transfert d&#39;embryons ou d&#39;envahir la lumière utérine causant la mort de l&#39;embryon et / ou de l&#39;échec de l&#39;implantation. Ceci est particulièrement pertinent lorsque les embryons sont transférés sans zona, comme les cellules sanguines et les débris peuvent joindre les blastomères. Deuxièmement, l&#39;ouverture réalisée n&#39;est pas étanche après les embryons ont été transférés, de sorte qu&#39;ils peuvent circuler à travers l&#39;orifice et être expulsé de la cavité abdominale quand un trop grand volume a été d&#39;introduire dans l&#39;utérus. Le transfert de l&#39;embryon in utero-tubaire décrit ici profiter de la jonction utéro-tubaire de livrer le embryo dans l&#39;utérus sans avoir besoin de perforer la paroi utérine et ainsi éviter ses conséquences néfastes 9. Les femmes bénéficiaires de pseudo-utilisés pour le transfert d&#39;embryons sont obtenus par accouplement naturel avec des hommes ayant subi une vasectomie 8. Les sécrétions séminales produites par un mâle stérile sont nécessaires pour l&#39;utérus à devenir réceptive aux embryons transférés. Pour obtenir un destinataire, un maximum de 2 femelles de 8 semaines à 6 mois d&#39;âge sont placés avec un mâle vasectomisé dans l&#39;après-midi. Le lendemain matin, les femmes sont vérifiés pour la présence d&#39;un bouchon de copulation vaginale, un bouquet de protéines coagulées du liquide séminal masculin. Comme l&#39;accouplement a lieu habituellement pendant minuit, le jour de la détection de bouchon vaginal est considéré comme 0,5 dpc. Bien que les mâles vasectomisés peuvent être achetés auprès de certains fournisseurs, la procédure chirurgicale décrite ici est relativement facile et ne nécessite pas d&#39;instruments supplémentaires que nécessaire pour le transfert d&#39;embryons.

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	<colgroup>
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	<tbody>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:232px;">Ketamine</td>
			<td style="width:111px;">VEDCO</td>
			<td style="width:203px;">Ketaved ANADA 200-257</td>
			<td style="width:691px;">To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:232px;">Xylazine</td>
			<td style="width:111px;">Lloyd laboratories</td>
			<td style="width:203px;">Anased NADA #139-236</td>
			<td style="width:691px;">To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:232px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:111px;">Generic</td>
			<td style="width:203px;">NDC 400-42-010-01</td>
			<td style="width:691px;">To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Eye ointment</td>
			<td style="width:111px;">Novartis</td>
			<td style="width:203px;">Genteal</td>
			<td style="width:691px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:232px;">Antibiotic</td>
			<td style="width:111px;">Pfizer</td>
			<td style="width:203px;">Clavamox NADA #55-101.</td>
			<td style="width:691px;">Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Dressing serrated forceps</td>
			<td style="width:111px;">ROBOZ</td>
			<td style="width:203px;">RS-8120</td>
			<td style="width:691px;">Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Micro dissecting serrated forceps</td>
			<td style="width:111px;">ROBOZ</td>
			<td style="width:203px;">RS-5137</td>
			<td style="width:691px;">These ones are curved at a 90&#186; angle. Straight forceps can be used if preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Slight curved micro dissection forceps</td>
			<td style="width:111px;">ROBOZ</td>
			<td style="width:203px;">RS-5136</td>
			<td style="width:691px;">This model is particularly useful to hold the oviduct.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:232px;">Scissors</td>
			<td style="width:111px;">ROBOZ</td>
			<td style="width:203px;">RS-5880</td>
			<td style="width:691px;">Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">27G needles</td>
			<td style="width:111px;">Beckton-Dickinson</td>
			<td style="width:203px;">305136</td>
			<td style="width:691px;">Smaller needles (30G) can be also used. 25G may be a bit too big.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:232px;">Clip applier</td>
			<td style="width:111px;">MiKRon</td>
			<td style="width:203px;">42763</td>
			<td style="width:691px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:232px;">9 mm Clips</td>
			<td style="width:111px;">MiKRon</td>
			<td style="width:203px;">427631</td>
			<td style="width:691px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Clip remover</td>
			<td style="width:111px;">MiKRon</td>
			<td style="width:203px;">7637</td>
			<td style="width:691px;">Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:232px;">Suture needle holder</td>
			<td style="width:111px;">ROBOZ</td>
			<td style="width:203px;">RS-7820</td>
			<td style="width:691px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:232px;">Suture</td>
			<td style="width:111px;">Dowist Gell</td>
			<td style="width:203px;">5-0 Dexon S 7204-21</td>
			<td style="width:691px;">Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:232px;">Glass capillaries</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">100 ul calibrated pipettes 53432-921</td>
			<td style="width:691px;">It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 um filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in ref. 8.</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:232px;">Burner</td>
			<td style="width:111px;">KISAG AG</td>
			<td style="width:203px;">Typ 2002</td>
			<td style="width:691px;">Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:232px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:111px;">Leica</td>
			<td style="width:203px;">MZFLIII</td>
			<td style="width:691px;">This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:232px;">Fiber optics ilumination</td>
			<td style="width:111px;">Dolan Jenner</td>
			<td style="width:203px;">Fiber lite</td>
			<td style="width:691px;">To iluminate the surgical area. There are different systems available.</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:232px;">Warm stages</td>
			<td style="width:111px;">American scope</td>
			<td style="width:203px;"><a href="https://exch.mail.umd.edu/owa/redir.aspx?C=1qTJKejamUSfudeYG_MlZHvTY3dsJM9Iaqr2SnwGD4ECWGzB8e8Rpg--_L7u0vJmyatXQJzGQ0k.&amp;URL=http%3a%2f%2fstore.amscope.com%2ftcs-100.html" target="_blank">http://store.amscope.com/tcs-100.html</a></td>
			<td style="width:691px;">These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Culture dishes for embryo manipulation</td>
			<td style="width:111px;">Falcon</td>
			<td style="width:203px;">353001</td>
			<td style="width:691px;">351008 may be also used, they made narrower drops.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model

Le transfert d&#39;embryons de pré-implantation à une femme de substitution est une étape nécessaire à la production de souris génétiquement modifiées ou pour étudier les effets de modifications épigénétiques origine au cours du développement préimplantatoire sur le développement et la santé du fœtus adulte ultérieure. L&#39;utilisation d&#39;une technique de transfert d&#39;embryons efficace et uniforme est essentielle pour améliorer la production d&#39;animaux génétiquement modifiés, et à déterminer l&#39;effet de différents traitements sur les taux d&#39;implantation et de survie à long terme. Des embryons au stade de blastocyste sont généralement transférés par transfert de l&#39;utérus, la réalisation d&#39;une ponction dans la paroi utérine pour introduire la pipette de la manipulation de l&#39;embryon. L&#39;orifice effectué dans l&#39;utérus ne se ferme pas après la pipette est retirée, et les embryons peuvent écoulement à la cavité abdominale, en raison de la pression positive de l&#39;utérus. La ponction peut également produire une hémorragie qui affecte l&#39;implantation, bloque la pipette de transfert et peut affecter l&#39;embryon développement, en particulier lorsque les embryons sont transférés sans zona. Par conséquent, cette technique entraîne souvent des taux de survie faible embryon très variables et globaux. Éviter ces effets négatifs, le transfert d&#39;embryon utéro-tubaire profiter de la jonction utéro-tubaire comme une barrière naturelle qui empêche l&#39;embryon sorties et éviter la ponction de la paroi utérine. Les hommes ayant subi une vasectomie sont nécessaires pour obtenir bénéficiaires pseudo-. Une technique pour effectuer la vasectomie est décrite en tant que complément au transfert d&#39;embryons utéro-tubaire.

Transfert d&#39;embryons utéro-tubaire fournit un moyen de transférer les embryons dans l&#39;utérus d&#39;éviter certaines des complications associées au transfert d&#39;embryon de l&#39;utérus 2,9,10. Dans le tableau 1, nous montrons un résultat représentatif, nous avons obtenu le transfert de blastocystes CD1 soumis à différents types de manipulations aux bénéficiaires CD1 suivant le protocole décrit. La survie à long terme (% des embryons résultant en un chiot) ou la survie...

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Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model

Le transfert d&#39;embryons utéro-tubaire utilise la jonction utéro-tubaire comme une barrière pour empêcher l&#39;écoulement de l&#39;embryon qui peut se produire lors de l&#39;exécution de transfert de l&#39;utérus. Les hommes ayant subi une vasectomie sont nécessaires pour obtenir bénéficiaires pseudo-pour le transfert d&#39;embryon. Ces deux techniques sont discutées.

Utéro-tubaire transfert d&#39;embryons et la vasectomie dans le modèle de souris

The transfer of preimplantation embryos to a surrogate female is a required step for the production of genetically modified mice or to study the effects ...

utero-tubal-embryo-transfer-and-vasectomy-in-the-mouse-model

Research

JoVE Journal

Biology

47.4K vues.  United States Department of Agriculture.  Le transfert d'embryons utéro-tubaire utilise la jonction utéro-tubaire comme une barrière pour empêcher l'écoulement de l'embryon qui peut se produire lors de l'exécution de transfert de l'utérus. Les hommes ayant subi une vasectomie sont nécessaires pour obtenir bénéficiaires pseudo-pour le transfert d'embryon. Ces deux techniques sont discutées. 

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Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

Transfert nucléaire dans des ovocytes de la souris

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Recherche

Biologie

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Dosage de l&#39;induction neurale dans l&#39;embryon de poulet

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Enregistrement électrophysiologique dans le Drosophile Embryon

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Techniques de microinjection pour l&#39;étude de la mitose dans les Drosophila melanogaster Embryon syncytial

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

L&#39;imagerie in vivo et des traitements thérapeutiques dans un modèle de souris orthotopique de cancer des ovaires

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

Suivi des déformations des tissus morphogénétiques dans l&#39;embryon de poulet Early

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Souris développement embryonnaire dans tout un système de culture d&#39;embryons sans sérum

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

La génération d&#39;transgénique<em&gt; Hydra</em&gt; Par micro-injection d&#39;embryons

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Validation d&#39;un modèle de souris de perturber CLIC complexes de façon spécifique à la cellule

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...