Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del Dipartimento di Scienze Animali e aviaria a BT.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Beltsville Area cura degli animali ed uso Comitati (BAACUC 11-015) secondo USDA cura degli animali e uso orientamenti. 1. Anestesia e Analgesia (comune per entrambe le procedure chirurgiche) <ol><li> Pesare il mouse e caricare i seguenti anestetici e analgesici in due siringhe da 1 ml con 27 aghi G: <ol><li> Ketamina (0,1 mg / g: 0,01 ml / g di una soluzione 10 mg / ml) e xilazina (0,01 mg / g: 0.005 ml / g di una soluzione di 2 mg / ml). </li><li> Buprenorfina (0,1 mcg / g: 0,01 ml di una soluzione 0,01 mg / ml). </li></ol></li><li> Immobilizzare il mouse sollevando la collottola il più vicino alle mascelle il più possibile con il pollice e l&#39;indice e tenendo la coda tra le piccole e anulare. </li><li> Iniettare miscela di ketamina-xylazina intraperitoneale. Al fine di evitare la puntura organi interni, tenere il mouse conla testa leggermente al di sotto del livello dei suoi fianchi (Figura 1A) </li><li> Iniettare buprenorfina per via sottocutanea nella nuca della stiva collo tra il pollice e l&#39;indice (Figura 1B). </li><li> Lasciare il mouse nella gabbia (pulito e senza alcun altro animale) in una fase calda. </li><li> Una volta incosciente, verificare l&#39;assenza di riflesso del piede posteriore (controllato da un pizzico tep). Applicare una pomata oculare per evitare la secchezza degli occhi e per verificare l&#39;assenza di riflesso palpebrale (Figura 1C). </li><li> Questo protocollo fornisce un piano anestesia chirurgica per un minimo di 30 minuti, sufficiente per eseguire le procedure descritte di seguito (protocolli 2 e 3). Se sono necessari tempi più lunghi, un&#39;ulteriore iniezione di ketamina + xilazina con metà della dose descritto in 1.1.1 può essere applicata dopo 30 min. Un cambiamento nel modello di respirazione ad uno più veloce e irregolare indica la loss del piano di anestesia corretta. </li></ol> 2. Vasectomia <ol><li> Usare un maschio con una performance comprovata accoppiamento. </li><li> Sterilizzare strumenti chirurgici, pulire le superfici in cui verrà eseguita la chirurgia e asciugarli con il 70% di etanolo. </li><li> Eseguire l&#39;anestesia come precedentemente descritto (Protocollo 1), controllando per la perdita dei riflessi. </li><li> Posizionare il mouse su una fase calda, rimuovere pelliccia con tagliaunghie elettrici dalla zona ventrale tra due linee trasversali immaginarie collocato 0,5 centimetri e 2,5 centimetri al di sopra del pene (Figura 2A). </li><li> Disinfettare la zona rasata pulendo sequenziale con il 10% di povidone iodio e il 70% di etanolo. </li><li> Posizionare il mouse nella posizione supina con la coda verso il chirurgo e coprire con un tovagliolo sterile con un foro di esporre l&#39;area rasata. Illuminare l&#39;area chirurgica. </li><li> Eseguire un incisio pelle longitudinale 10-15 mmn nella linea mediana dell&#39;addome, circa 1 cm sopra il pene. Tenere la pelle con spogliatoio pinza seghettati e poi tagliare con le forbici (Figure 2A e 2B). </li><li> Eseguire una incisione longitudinale 5-10 mm in linea alba. Tenere il muscolo con microdissecting pinze dentellate e tagliare con le forbici (Figura 2C). </li><li> Afferra il cuscinetto adiposo testicolare di un lato con micro dissezione forcipe seghettati e tirarlo per esporre testicolo, deferenti e dell&#39;epididimo. Vasi deferenti si trova mediale al testicolo ed è un tubo libero chiaramente distinguibile (non attaccato al muro testicolo come il epididimo) con un vaso sanguigno che corre lungo un lato (Figura 2D). </li><li> Tenendo il dotto deferente con un micro dissezione seghettato pinze, pinze medicazione fiamma fino a che non diventa rosso (Figura 2E </strong&gt;), e poi usarle per tagliare e cauterizzare i vasi deferenti in due punti contemporaneamente (Figura 2F). Il taglio dovrebbe rimuovere una porzione di circa 5 mm e lasciare due estremità cauterizzato nettamente separate (Figura 2G). </li><li> Spostare il testicolo, epididimo e deferenti torna alla cavità addominale. </li><li> Procedere dal punto 9 nell&#39;altro testicolo. </li><li> Suturare il muscolo con uno o due punti di sutura materasso orizzontali realizzate con 5/0 sutura riassorbibile (Figura 2H). </li><li> Suturare la pelle con uno o due tagliatori di ferita (Figura 2I). </li><li> Identificare il maschio vasectomizzato (anello di orecchio, dito tatuaggio ...), spostare la gabbia collocata su una fase calda e osservare fino a che non recupera dall&#39;anestesia (cosciente e mantenere decubito sternale). Una iniezione sottocutanea 0,5-1 ml di soluzione salina calda migliora recupero. Registrare le possibili incidenze che si verificano durante il trasferimento vasectomia, aggiungere antibiotico per l&#39;acqua potabile. </li><li> Clip della ferita possono essere rimossi 10 giorni dopo la vasectomia con un dispositivo di rimozione ferita tagliatore o un paio di pinze denti. Il maschio vasectomizzato sarà pronto per accoppiarsi 2 settimane dopo l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Provare la sterilità del maschio vasectomizzato da accoppiamento con femmine fertili prima di utilizzarlo per ottenere destinatari. </li></ol> 3. Utero-tubarica Embryo Transfer <ol><li> Mouse morule o blastocisti possono essere trasferiti da questa tecnica ad una femmina destinatario pseudopregnant a 2,5 DPC. </li><li> Preparare embrione vetro manipolazione pipetta: <ol><li> Lucidare le punte dei capillari di vetro, al fine di evitare danni al titolare pipetta. </li><li> Ammorbidire una porzione centrale del capillare di vetro riscaldando con una bella fiammata mentre leggermente la rotazioneil capillare con entrambe le mani sincrono. Una volta che la sezione capillare diventa morbida e malleabile (colore rosso chiaro), ritirarsi rapidamente dal fuoco e tirare entrambe le estremità per ridurre il suo diametro esterno di 130-150 micron. </li><li> Attendere che il vetro si raffreddi e poi tagliarla con una leggera segnando la parte stretta con una matita a punta di diamante, pietra abrasiva o limetta per unghie e tirando da entrambi i lati. La pausa deve essere pulita e perpendicolare </li></ol></li><li> Lucidare la punta molto velocemente fiammeggiante, lasciando un&#39;apertura di 100-130 micron. Le pipette possono essere memorizzati per un uso successivo. </li><li> Warm mezzi di manipolazione di embrioni (CZBH o M2, vedi la discussione). </li><li> Sterilizzare strumenti chirurgici, pulire le superfici in cui verrà eseguita la chirurgia e asciugarli con il 70% di etanolo. </li><li> Eseguire l&#39;anestesia come precedentemente descritto (Protocollo 1), controllando per la perdita dei riflessi. </li><li> Mantenere tegli mouse su una fase calda, rimuovere pelliccia con tagliaunghie elettrici dalla zona dorsale tra le ginocchia e le costole distali (Figure 3A e 3B). </li><li> Disinfettare la zona rasata pulendo sequenziale con il 10% di povidone iodio e il 70% di etanolo. </li><li> Spostare gli embrioni dall&#39;incubatore ai mezzi di manipolazione dell&#39;embrione preriscaldata. </li><li> Spostare il destinatario di una fase calda con lo stereomicroscopio e collocarlo in posizione prona lateralmente al chirurgo (con la testa che guarda a destra oa sinistra del chirurgo). </li><li> Coprire l&#39;area con un asciugamano sterile con un foro di esporre l&#39;area rasata e illuminare la zona chirurgica. </li><li> Eseguire da 1 cm trasversale (verticale) incisione nella pelle in un punto situato sulla cranica ⅓ della linea tra l&#39;ultima costola e fianchi e la ⅓ dorsale della linea tra la schiena e l&#39;addome (Figure 3A unnd 3B). Tenere la pelle con spogliatoio pinze dentellate e tagliare con le forbici (Figura 3C). </li><li> Una volta che la pelle è stata tagliata, ovaio (rosso / arancione) o il pad adiposo che circonda l&#39;ovaio (bianco) possono essere visualizzati attraverso la parete del corpo. Eseguire un 0,3-0,5 cm trasversale (verticale) incisione nella parete del corpo sopra l&#39;ovaio o pad adiposo in un punto in cui l&#39;incisione non taglia qualsiasi grande vaso sanguigno. Tenere il muscolo con micro dissezione pinza dentata e tagliare con le forbici (Figura 3D). </li><li> Muovi il mouse per avere la testa rivolta verso il chirurgo. </li><li> Caricare la manipolazione dell&#39;embrione pipetta (Figura 3E): <ol><li> Lasciare i media CZBH di salire per capillarità attraverso la parte stretta della pipetta manipolazione fino a circa 5 millimetri della parte più larga. </li><li> Prendete una piccola bolla d&#39;aria (0,2-0,5 mm). </li><li> Introdurre gli embrioni (5-10) inuna quantità minima di media (2-4 mm). </li><li> Prendete un&#39;altra piccola bolla d&#39;aria (0,2-0,5 mm) e una piccola quantità di materiale (0,5-1 mm). </li><li> Lasciare la pipetta di vetro attaccato al titolare aspirazione bocca o al dispositivo azionati a mano, pronta per il passo 3.17. </li></ol></li><li> Afferra il pad adiposo che circonda l&#39;ovario con micro dissezione pinza dentata e tirarlo verso la testa del mouse per esporre l&#39;ovaio, ovidotto, e una piccola porzione di utero superiore fuori della cavità addominale (Figure 3F e 3G). </li><li> Tenendo il pezzo aspirazione bocca in bocca, pronto per essere utilizzato, afferrare il pad adiposo con micro dissezione pinza dentata per spostare il ovidotto ed esporre la giunzione utero-tubarica (cioè dove l&#39;ovidotto incontra l&#39;utero). </li><li> Mantenere la giunzione utero-tubarica accessibili, prendere lievi curve micro pinza per dissezione con la mano sinistra (destra se consegnato) e metterli subito sottola giunzione utero-tubarica afferrare nell&#39;ovidotto circa 2 mm sopra quella parte. </li><li> Tenendo la giunzione utero-tubarica con le lievi curve micro pinze dissezione, forare la sezione ovidotto vicino alle pinze con un ago G 27 (Figura 3H). </li><li> Inserire l&#39;embrione manipolazione pipetta nel foro effettuato con l&#39;ago e avanzare verso l&#39;utero attraverso la giunzione utero-tubarica (Figure 3I e 3J). Una volta che la pipetta ha superato la giunzione utero-tubarica (Figura 3K) si infila facilmente. Non progredire molto lontano nell&#39;utero per evitare danni endometriale (non più di 3 mm) e pipetta blocco dai detriti. </li><li> Rilasciare gli embrioni nell&#39;utero soffiando delicatamente (figura 3L). Entrambe le bolle d&#39;aria deve passare attraverso l&#39;utero. Alcuni dei supporti oltre la prima bollapuò anche essere rilasciato in utero, ma evitare di introdurre più aria, in quanto può impedire l&#39;impianto. </li><li> Rimuovere la pipetta appena dopo embrioni sono stati rilasciati nell&#39;utero. </li><li> Spostare il ovidotto e ovaio torna alla cavità addominale afferrando il pad adiposo. </li><li> Suturare il muscolo con un punto materasso orizzontale con 5/0 sutura riassorbibile (Figura 3M). </li><li> Suturare la pelle con un clipper ferita (Figura 3N). </li><li> Procedere dal punto 10 sul lato opposto, se necessario. </li><li> Identificare il destinatario (anello di orecchio, dito tatuaggio ...), spostarlo sua gabbia (posto su una fase calda) e osservare fino a che non recupera dall&#39;anestesia (cosciente e mantenere decubito sternale). </li><li> Annotare le possibili incidenze che si verificano durante il trasferimento di embrioni e aggiungere antibiotico per l&#39;acqua potabile. Una iniezione sottocutanea 0,5-1 ml di sali caldoSoluzione ne migliora il recupero. </li><li> Clip della ferita possono essere rimossi 10 giorni dopo il trasferimento di embrioni con un dispositivo di rimozione ferita tagliatore o due paia di pinze (Figura 3O). Il destinatario può essere pesato in quel giorno per valutare la gravidanza e stimare il numero di cuccioli. Fornire materiale adagiato al beneficiario 15 giorni dopo il trasferimento dell&#39;embrione. </li></ol>

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Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

La vasectomia è una tecnica chirurgica in avanti relativamente semplice che non comporta grandi difficoltà. Quando sanificazione con povidone iodio ed etanolo assicurarsi che l&#39;ultimo lavaggio (con etanolo) rimuove povidone iodio, in quanto può irritare il peritoneo. L&#39;accesso al dotto deferente può essere ottenuta anche scroto o eseguendo una incisione trasversale nell&#39;addome 8. Incisione scrotale è stato raccomandato di trasversali incisione addominale dovuto alla incisione relativ...

Il trasferimento embrionale è probabilmente la procedura chirurgica più frequente eseguita nel modello murino. Questa tecnica è essenziale per ottenere discendenza di embrioni sottoposti a tecniche di manipolazione in vitro e, di conseguenza, costituisce un passo necessario per lo sviluppo di modelli geneticamente modificati mediante iniezione pronucleo, trasduzione lentivirale, o formazione di chimera. Inoltre, la tecnica consente di studiare gli effetti dello sviluppo di diverse insulti che si verificano durante lo sviluppo preimpianto. L&#39;uso di tecniche di riproduzione artificiale 1 o l&#39;esposizione a concentrazioni anomale di sostanze o metaboliti 2 diversi possono influenzare lo sviluppo embrionale con conseguente impianto o placentation guasti e gli effetti a lungo termine nella prole. Una tecnica di trasferimento di embrioni affidabile e riproducibile è fondamentale per verificare i possibili effetti negativi del trattamento sperimentale per l&#39;impianto e lo sviluppo del feto in un uomo coerenteNER. Embrioni murini preimpianto possono essere trasferiti ad una femmina destinatario sia in ovidotto tramite le ampolle di 0,5 giorni dopo coitum (DPC) destinatari pseudopregnant (trasferimento oviduct) 3,4 o nell&#39;utero di 2,5 DPC destinatario pseudopregnant (trasferimento uterina) 5,6 a seconda del loro stadio di sviluppo. Embrioni allo stadio di blastocisti, come quelli utilizzati per generare topi chimerici mediante iniezione di cellule staminali pluripotenti embrionali o indotte, vengono di solito trasferite mediante trasferimento uterino. Blastocisti possono anche essere trasferiti a nell&#39;ovidotto di un DPC destinatario 0.5, ma costituisce una prova meno fisiologica per disgregatori di sviluppo, perché l&#39;embrione subisce diapausa e ha 2 giorni per recuperare dalla insulto prima dell&#39;impianto avviene. Trasferimento uterino comporta perforando la parete uterina con un ago stretta in modo da generare una apertura che consente l&#39;accesso di un embrione manipolazione pipetta nelle cavità uterina. Lanche se questa tecnica può produrre buoni risultati, la sopravvivenza a termine (ossia la percentuale di embrioni trasferiti che si sviluppano ad un cucciolo) è spesso bassa e imprevedibile 7,8. La puntura della parete uterina comporta alcuni effetti collaterali dannosi. Primo, miometrio è un tessuto altamente vascolarizzato e la sua puntura provoca spesso una piccola emorragia. Il sangue può bloccare la pipetta di trasferimento dell&#39;embrione o invadere il lume uterino causando la morte embrionale e / o guasto dell&#39;impianto. Ciò è particolarmente rilevante quando gli embrioni senza zona vengono trasferiti, come le cellule del sangue e detriti possono allegare i blastomeri. In secondo luogo, l&#39;apertura eseguita non sigilla dopo che gli embrioni sono stati trasferiti, in modo che può rifluire attraverso l&#39;orifizio ed essere espulso alla cavità addominale quando un eccessivo volume è stato introdurre nell&#39;utero. Il trasferimento di embrioni in utero-tubarica qui descritto approfittare della giunzione utero-tubarica per consegnare il embryos nell&#39;utero senza la necessità di bucare la parete uterina e quindi evitando le conseguenze negative 9. Le femmine destinatario pseudopregnant utilizzati per il trasferimento degli embrioni sono ottenuti per accoppiamento naturale con i maschi vasectomized 8. Le secrezioni seminali prodotti da un maschio sterile sono necessari per l&#39;utero di diventare ricettivo agli embrioni trasferiti. Per ottenere un destinatario, un massimo di 2 femmine di otto settimane a 6 mesi di età sono posti con un maschio vasectomizzato nel pomeriggio. La mattina seguente, le femmine vengono controllati per la presenza di una spina copula vaginale, un ciuffo di proteine ​​coagulate dal liquido seminale maschile. Come accoppiamento avviene di solito durante la mezzanotte, il giorno di rilevazione spina vaginale è considerato 0.5 dpc. Anche se i maschi vasectomized possono essere acquistati presso alcuni fornitori, la procedura chirurgica qui descritta è relativamente facile e non richiede strumenti aggiuntivi di quanto richiesto per il trasferimento degli embrioni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1234">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:232px;">Ketamine</td>
			<td style="width:111px;">VEDCO</td>
			<td style="width:203px;">Ketaved ANADA 200-257</td>
			<td style="width:691px;">To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:232px;">Xylazine</td>
			<td style="width:111px;">Lloyd laboratories</td>
			<td style="width:203px;">Anased NADA #139-236</td>
			<td style="width:691px;">To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:232px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:111px;">Generic</td>
			<td style="width:203px;">NDC 400-42-010-01</td>
			<td style="width:691px;">To be ordered by a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Eye ointment</td>
			<td style="width:111px;">Novartis</td>
			<td style="width:203px;">Genteal</td>
			<td style="width:691px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:232px;">Antibiotic</td>
			<td style="width:111px;">Pfizer</td>
			<td style="width:203px;">Clavamox NADA #55-101.</td>
			<td style="width:691px;">Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Dressing serrated forceps</td>
			<td style="width:111px;">ROBOZ</td>
			<td style="width:203px;">RS-8120</td>
			<td style="width:691px;">Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Micro dissecting serrated forceps</td>
			<td style="width:111px;">ROBOZ</td>
			<td style="width:203px;">RS-5137</td>
			<td style="width:691px;">These ones are curved at a 90&#186; angle. Straight forceps can be used if preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Slight curved micro dissection forceps</td>
			<td style="width:111px;">ROBOZ</td>
			<td style="width:203px;">RS-5136</td>
			<td style="width:691px;">This model is particularly useful to hold the oviduct.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:232px;">Scissors</td>
			<td style="width:111px;">ROBOZ</td>
			<td style="width:203px;">RS-5880</td>
			<td style="width:691px;">Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">27G needles</td>
			<td style="width:111px;">Beckton-Dickinson</td>
			<td style="width:203px;">305136</td>
			<td style="width:691px;">Smaller needles (30G) can be also used. 25G may be a bit too big.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:232px;">Clip applier</td>
			<td style="width:111px;">MiKRon</td>
			<td style="width:203px;">42763</td>
			<td style="width:691px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:232px;">9 mm Clips</td>
			<td style="width:111px;">MiKRon</td>
			<td style="width:203px;">427631</td>
			<td style="width:691px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Clip remover</td>
			<td style="width:111px;">MiKRon</td>
			<td style="width:203px;">7637</td>
			<td style="width:691px;">Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:232px;">Suture needle holder</td>
			<td style="width:111px;">ROBOZ</td>
			<td style="width:203px;">RS-7820</td>
			<td style="width:691px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:232px;">Suture</td>
			<td style="width:111px;">Dowist Gell</td>
			<td style="width:203px;">5-0 Dexon S 7204-21</td>
			<td style="width:691px;">Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:232px;">Glass capillaries</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">100 ul calibrated pipettes 53432-921</td>
			<td style="width:691px;">It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 um filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in ref. 8.</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:232px;">Burner</td>
			<td style="width:111px;">KISAG AG</td>
			<td style="width:203px;">Typ 2002</td>
			<td style="width:691px;">Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:232px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:111px;">Leica</td>
			<td style="width:203px;">MZFLIII</td>
			<td style="width:691px;">This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:232px;">Fiber optics ilumination</td>
			<td style="width:111px;">Dolan Jenner</td>
			<td style="width:203px;">Fiber lite</td>
			<td style="width:691px;">To iluminate the surgical area. There are different systems available.</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:232px;">Warm stages</td>
			<td style="width:111px;">American scope</td>
			<td style="width:203px;"><a href="https://exch.mail.umd.edu/owa/redir.aspx?C=1qTJKejamUSfudeYG_MlZHvTY3dsJM9Iaqr2SnwGD4ECWGzB8e8Rpg--_L7u0vJmyatXQJzGQ0k.&amp;URL=http%3a%2f%2fstore.amscope.com%2ftcs-100.html" target="_blank">http://store.amscope.com/tcs-100.html</a></td>
			<td style="width:691px;">These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Culture dishes for embryo manipulation</td>
			<td style="width:111px;">Falcon</td>
			<td style="width:203px;">353001</td>
			<td style="width:691px;">351008 may be also used, they made narrower drops.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model

Il trasferimento di embrioni preimpianto ad una femmina surrogata è un passo necessario per la produzione di topi geneticamente modificati o per studiare gli effetti delle alterazioni epigenetiche originati durante lo sviluppo preimpianto sul successivo sviluppo ed adulto salute del feto. L&#39;uso di una tecnica di trasferimento di embrioni efficace e coerente è fondamentale per migliorare la generazione di animali geneticamente modificati e per determinare l&#39;effetto di trattamenti diversi su tassi di impianto e sopravvivenza a termine. Embrioni allo stadio di blastocisti vengono generalmente trasmesse mediante trasferimento uterino, eseguendo una puntura nella parete uterina introdurre la pipetta manipolazione embrione. L&#39;orifizio eseguita in utero non viene chiuso dopo la pipetta è stata ritirata, e gli embrioni possono deflusso alla cavità addominale causa della pressione positiva dell&#39;utero. La puntura può anche produrre una emorragia che altera l&#39;impianto, blocca la pipetta di trasferimento e può influenzare embrione dviluppo, soprattutto quando gli embrioni che non vengono trasferiti zona. Di conseguenza, questa tecnica spesso si traduce in tassi di sopravvivenza partire embrione molto variabili e globali. Evitare questi effetti negativi, utero-tubarica trasferimento di embrioni approfittare della giunzione utero-tubarica come una barriera naturale che impedisce all&#39;embrione di deflusso ed evitare la puntura della parete uterina. Maschi vasectomized sono necessari per ottenere i destinatari pseudopregnant. Una tecnica per eseguire vasectomia è descritto come un complemento al trasferimento di embrioni in utero-tubarica.

Utero-tubarica trasferimento di embrioni fornisce un mezzo per trasferire gli embrioni in utero evitare alcune delle complicanze associate uterina trasferimento degli embrioni 2,9,10. Nella Tabella 1 mostriamo qualche risultato rappresentativo abbiamo ottenuto il trasferimento di blastocisti CD1 sottoposti a diversi tipi di manipolazioni ai destinatari CD1 seguendo il protocollo descritto. La sopravvivenza a termine (% di embrioni risultanti in un cucciolo) o sopravvivenza a E15 (nel caso di ...

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Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model

Utero-tubarico trasferimento di embrioni utilizza la giunzione utero-tubarica come barriera per impedire la fuoriuscita embrione che si può verificare quando si esegue il trasferimento uterino. Maschi vasectomized sono tenuti ad ottenere destinatari pseudopregnant per il trasferimento di embrioni. Entrambe le tecniche sono discusse.

Trasferimento di Embrione utero-tubarica e vasectomia nel modello murino

The transfer of preimplantation embryos to a surrogate female is a required step for the production of genetically modified mice or to study the effects ...

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Research

JoVE Journal

Biology

47.2K Views.  United States Department of Agriculture.  Utero-tubarico trasferimento di embrioni utilizza la giunzione utero-tubarica come barriera per impedire la fuoriuscita embrione che si può verificare quando si esegue il trasferimento uterino. Maschi vasectomized sono tenuti ad ottenere destinatari pseudopregnant per il trasferimento di embrioni. Entrambe le tecniche sono discusse. 

Video: Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

Trasferimento nucleare in oociti mouse

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Ricerca

Biologia

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Test di induzione neurale nell&#39;embrione Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Registrazione elettrofisiologiche in Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

Imaging in vivo e trattamenti terapeutici in un modello di mouse ortotopico di cancro ovarico

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

Monitoraggio Deformazioni tessuto morfogenetica in embrione di pollo primi

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Embrionali di topo di sviluppo in un embrione di tutta la cultura di sistema privo di siero

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

La convalida di un modello di topo per Disrupt LINC Complessi in modo specifico-Cell

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Isolamento dei nuclei dal rene di topo adulto per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Pseudogravidanza indotta dalla manipolazione cervicale nei topi per la riproduzione assistita

Inducing Pseudopregnancy in Female Mice Without the Need for Vasectomized Males Prior to Non-Surgical Embryo Transfer or Artificial Insemination

For successfully maintaining pregnancy with embryo transfer or artificial insemination,&#160;female recipient mice must be induced into a pseudopregnant state. Female mice are traditionally paired overnight with vasectomized males, and the following morning, the presence of a copulation plug is assessed. To increase the efficiency of producing pseudopregnant females, a cervical manipulation technique has been standardized to be used in combination with non-surgical embryo transfer or artificial insemination techniques in mice. The blunt end of a small plastic rod is inserted vaginally to contact the cervix and is vibrated for 30 s by contact with a trimmer. The procedure is quick and does not require anesthesia or analgesia. This technique increases the reliability and predictability of producing pseudopregnant females and entirely eliminates the requirement for vasectomized males. For CD1 mice, the efficiency of pseudopregnancy induction using cervical manipulation was 83% for females in estrus (N = 76) but only 38% of females in estrus were plugged by vasectomized males (N = 24). Artificial insemination in CD1 mice was performed by estrus synchronization with hormones, cervical manipulation, and the uterine transfer of sperm. Artificial insemination recipients receiving cervical manipulation (N = 76) had a pregnancy rate of 72% and an average litter size of 8.3 pups. This method can also be used to produce pseudopregnant females for non-surgical embryo transfer. Therefore, inducing pseudopregnancy by cervical manipulation is a convenient and efficient alternative to mating with a vasectomized male when performing non-surgical assisted reproduction techniques. Using cervical manipulation provides 3Rs (replacement, reduction, and refinement) benefits for assisted reproduction techniques by reducing the number of animals required and eliminating the necessity for surgically altered males.

Autore in primo piano: Indurre la pseudogravidanza in topi femmina senza la necessità di maschi vasectomizzati prima del trasferimento non chirurgico dell'embrione o dell'inseminazione artificiale  

The cervical manipulation method presented can induce pseudopregnancy in mice without the need for breeding females with vasectomized males. The induction of pseudopregnancy is required for the success of non-surgical embryo transfer and non-surgical artificial insemination, both of which are also presented.

Indurre una pseudogravidanza in topi femmina senza la necessità di maschi vasectomizzati prima del trasferimento di embrioni non chirurgici o dell'inseminazione artificiale

For successfully maintaining pregnancy with embryo transfer or artificial insemination,&#160;female recipient mice must be induced into a pseudopregnant ...