Les auteurs tiennent à remercier Jen Sheen de l&#39;Hôpital général du Massachusetts pour le généreux don de plants de Nicotiana benthamiana. Jen Bush nous a beaucoup aidé dans le conseil en culture des plantes et la mise en place d&#39;une zone de la chambre de croissance. Tom Ferrante de l&#39;Institut Wyss a offert une aide cruciale à la microscopie confocale. Les auteurs tiennent tout particulièrement à remercier Don Ingber de l&#39;Hôpital pour enfants de Boston et de l&#39;Institut Wyss pour le don généreux d&#39;un pistolet Gene et fournitures associées. Le financement de ce projet était prévu par un accord de coopération avec le ministère de l&#39;Énergie Advanced Research Projects Agency (ARPA-E Award # DE-000079) pour PAS, JCW, et MdM, et par Chimerion Biotechnology, Inc. pour MJV.

1. Conception de séquences d&#39;épissage alternative-pour Multiple Organelle ciblage <ol><li> Déterminer les sites d&#39;expression de la protéine finale. Pour ce travail, l&#39;intérêt est de cibler le chloroplaste, peroxysomes, et cytosol. </li><li> Utilisez la littérature pour identifier les protéines et les séquences d&#39;ADN connues pour cibler des protéines vers les organites d&#39;intérêt. Dans ce cas, une séquence de ciblage du chloroplaste d&#39;Arabidopsis thaliana L-méthyltransférase isoaspartate 6,15, et une séquence de ciblage de peroxysome de Arabidopsis thaliana transthyrétine-S-comme l&#39;allantoïne 16,17 synthase ont été déterminés. </li><li> Identifier un régime alternatif-épissage qui devrait cibler les protéines d&#39;intérêt pour les organites correctes. Pour ce travail, les sites d&#39;épissage comme observé dans un système de Arabidopsis naturel 6. La séquence de l&#39;ARNm a été redessiné en laissant les sites d&#39;épissage naturels, mais les séquences codantes ont été placés peroxis chloroplastiques ouome-balises de ciblage dans les introns épissés alternativement-(Figure 1). </li></ol> 2. Assemblée Gibson des parties ADN Voir aussi la figure 2. Le procédé d&#39;assemblage Gibson dépend de l&#39;action de plusieurs enzymes dans un mélange de pré-mesure pour 1) digérer partiellement les extrémités de l&#39;ADN double brin de faire brins simples et 2) recuire les paires de bases complémentaires de parties de l&#39;ADN voisin. Ceci permet le clonage de fragments d&#39;ADN, sans les limitations des sites de restriction. <ol><li> Choisir une commande pour les éléments dans le produit d&#39;assemblage d&#39;ADN plasmidique. A titre d&#39;exemple TriTag-1 a des éléments de: a) un vecteur plasmidique (pores, contenant une construction de GFP connu pour fonctionner dans les plantes, un marqueur de résistance à la kanamycine, et des origines de replication pour E. coli et Agrobacterium tumefaciens des hôtes), b) un séquence de promoteur, (P ENTCUP2, montré pour être constitutive dans les plantes), C) une séquence de ciblage du chloroplaste (CTS), c) une séquence de ciblage des peroxysomes (PTS), et d) une série de sites d&#39;épissage tel que décrit précédemment 6. </li><li> Concevoir la base de base de construction avec des logiciels de design in silico. ApE est un logiciel gratuit open source utile pour ce travail. Remarque: TriTag-1, a l&#39;ordre: vecteur plasmidique, promoteur, ATG, site donneur d&#39;épissage, séquence cible chloroplastes, site donneur d&#39;épissage, un site neutre, site accepteur d&#39;épissage, séquence cible peroxysomes, site accepteur d&#39;épissage, GFP figurant dans le vecteur plasmidique . <ol><li> Concevoir la construction d&#39;ADN en silico telle qu&#39;il y ait un chevauchement de 50 pb entre chaque pièce lors de la commande des amorces pour PCR. Il est possible d&#39;utiliser le chevauchement de 50 pb comme amorces: 25 paires de bases respectivement. <ol><li> Assurez-vous de garder une trace de l&#39;origine de chacun des morceaux de séquence. Est-il aussi: un plasmide d&#39;être cultivées et miniprepped; une séquence linéaire qui peut être utilisé comme matrice de PCR; ou une séquence qui devra êtresynthétisé dans le commerce? Plusieurs entreprises offrent des services de synthèse d&#39;ADN à faible coût pour les fragments &lt;500 pb. Dans ce cas, la TriTag lui-même est 437 pb si il était avantageux de commander le commerce. </li><li> Les meilleurs résultats sont si tous les fragments sont amplifiés par PCR et purifiés à partir de leur ADN matrice. Le marqueur de résistance est un bon endroit pour partager ce grand ADN en deux modèles plus petits qui sont plus facilement amplifié par PCR. </li><li> Restriction enzyme de restriction Dpnl coupe l&#39;ADN méthylé. Si la matrice de PCR était une miniprep à partir de E. coli, le traitement Dpnl va supprimer la matrice d&#39;ADN contaminant. </li></ol></li></ol></li><li> Purifier toutes les séquences d&#39;ADN et éluer séparément dans l&#39;eau, ou du tampon TE EB. <ol><li> vecteur de pores partie 1, ~ 3000 pb (flèches vertes). PCR amplifié et traité Dpnl. </li><li> vecteur de pores partie 2, ~ 3000 pb (flèches noires). PCR amplifié et traité Dpnl. </li><li> TriTag insert, 437 pb (flèches bleues). Commandé le commerce. Resuspend dans le trou DDH 2 O. </li><li> P ENTCUP promoteur, ~ 750 pb (flèches oranges). PCR-amplifié et traité Dpnl. </li></ol></li><li> Mesurer les concentrations de chacun des morceaux d&#39;ADN. But pour 150 ng / ul des morceaux de vecteur. </li><li> Prélever une partie aliquote de l&#39;ensemble mélange Gibson du congélateur et décongeler sur la glace. C&#39;est disponible dans le commerce, mais aussi simple à faire dans le laboratoire 12-14. <ol><li> Il ya deux étapes à cette recette: un mélange maître de 5x visqueux et 15 pi 1,33 aliquotes réaction de taille. Le mélange maître 5x contient: 3 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 300 ul de 1 M de MgCl2, 600 ul de 10 mM de chaque dNTP, 300 ul de 1 M DTT, 1,5 g de PEG-8000, 20 mg de NAD, et le trou DDH 2 O à 6 ml. Préparer 320 aliquotes (18) et de geler tous mais à -20 ° C. La solution sera très visqueux. Étiqueter ces &quot;tampon isotherme 5X&quot; </li><li> Pour celui qui reste (320 pi), ajouter 1,2 pi T5 Exonuclease, 20 pl Phusion Haute-Fidelity ADN polymérase, 160 pi de Taq ADN ligase et 700 pi ddH 2 O. Préparer 15 aliquotes (~ 80) sur la glace dans des tubes PCR et conserver à -20 ° C. </li></ol></li><li> Déterminer les volumes de quantités équimolaires de chacun des fragments. Il ya quelques calculatrices en ligne, y compris Gibthon.org. Il devrait y avoir un total de 5 ul de tous les morceaux d&#39;ADN. Ajoutez-les à la 15 pi Gibson mélanger aliquote. Si cela nécessite des volumes trop petits à la pipette, diluer les fragments d&#39;ADN et / ou d&#39;utiliser plus d&#39;une aliquote. <ol><li> N&#39;oubliez pas de préparer un contrôle de l&#39;ADN du vecteur seul (par exemple, la partie de l&#39;ADN contenant le marqueur de résistance à un antibiotique) et porter au volume avec de l&#39;eau. </li></ol></li><li> Incuber les tubes dans un cycleur thermique à 50-55 ° C pendant 30-60 minutes. Remplacer sur la glace et se transformer en E. coli via choc thermique cellules chimiquement compétentes. Ne pas utiliser des cellules électrocompétentes. La forte concentration en sel et la concentration d&#39;ADN relativement faiblepeut causer des cellules à l&#39;arc. <ol><li> Appliquer tous les 20 pi à une préparation commerciale de 200 pi du chlorure de calcium E. compétente coli. Incuber sur de la glace 30 min et 60 sec choc thermique à 42 ° C </li><li> Retour à la glace 2 min, appliquer 750 pi SOC ou milieu LB et récupérer secouant dans un tube à centrifuger 30 min à 37 ° C. Plaque du mélange et des dilutions appropriées sur LB + Kan (ou autre antibiotique approprié). Il peut en résulter fond supérieur (et un nombre plus élevé d&#39;événements de recombinaison non-cibles) que le traditionnel clonage basé ligature, mais il est utile de dépister environ 10 colonies. </li></ol></li><li> Confirmez clone par séquence et stocker une aliquote à -80 ° C </li></ol> 3. Biolistic transfection de tabac avec le pistolet à gènes Il s&#39;agit d&#39;une technique qui est établi dans JoVE 18,19. Étapes et les principales différences sont décrites ci-dessous. <ol><li> Cultivez 50-100 ml E. coli 200 ml ou Agrobacterium. Maxi-prep la culture. Une concentration d&#39;environ 1 500 ng / pl est nécessaire pour continuer. </li><li> Préparer gènes balles d&#39;arme à feu tel que décrit précédemment. Chargez-les dans le pistolet à gènes. </li><li> Pour la transfection de Nicotiana benthamiana tabac tissu feuille épidermique, choisissez une grande feuille près de la base d&#39;une usine de 3 mois. Découpez soigneusement et placez-le côté bas en haut sur des serviettes en papier humide dans une boîte de Petri de 15 cm. </li><li> Régler la pression Il pour le pistolet à gènes à 200-250 psi. </li><li> Viser soigneusement le pistolet à gènes entre les nervures sur la face inférieure d&#39;une feuille, environ 3-5 cm au-dessus. Relâcher la sécurité et délivrer les particules à la feuille. Chaque puce peut être utilisée deux fois au même endroit sur la feuille. Si l&#39;explosion de la feuille, jeter et recommencer une feuille-il nouveau, c&#39;est une certaine variation dans la feuille ténacité en raison de conditions de croissance tels que l&#39;âge, l&#39;humidité, etc Pour un 12 cm feuille, s&#39;attendre à tenir environ 6 coups. </li><li> Rangez la feuille, couvert avec le haut d&#39;unBoîte de Pétri pendant 2-3 jours en basse lumière sur le banc. </li><li> Examinez la feuille dans un microscope de dissection équipé fluorescence UV, et la recherche de cellules individuelles exprimant la GFP. Disséquer 5-10 sections mm de feuille. </li><li> Plonger la feuille dans une lame de microscope dans des puits profonds sous ~ 200 ul de 0,1% de Triton X-100. Le détergent permet d&#39;éviter les bulles d&#39;air de se former sur la surface, et la glissière de microscope bien profond permet une plus grande surface d&#39;imagerie des tissus. </li></ol> 4. Microscopie confocale de tissus transfectées Ces instructions varient pour chaque instrument, il est donc essentiel de se bien formés. <ol><li> Pour les expériences de détection par fluorescence, réglez le laser d&#39;excitation à 489 nm, et définir les détecteurs photomultiplicateurs à 500-569 nm pour fluorescence de la GFP et de 630 à 700 nm pour la chlorophylle auto-fluorescence. cellules de l&#39;image en utilisant un objectif 40x immersion dans l&#39;eau. </li></ol>

<ol>
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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).</li><li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome.">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li><li>Lowenson, J. D., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+D-aspartyl+residues+in+polypeptides+by+the+erythrocyte+L-isoaspartyl/D-aspartyl+protein+methyltransferase.+Implications+for+the+repair+hypothesis.">Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).</li><li>Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+a+camel+through+the+eye+of+a+needle:+the+import+of+folded+proteins+by+peroxisomes.">Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).</li><li>Reumann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+Arabidopsis+leaf+peroxisomes+reveals+novel+targeting+peptides,+metabolic+pathways,+and+defense+mechanisms.">Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms.</a> The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).</li><li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture.">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li><li>Hollender, C. A., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+Fluorescence+Complementation+(BiFC)+Assay+for+Protein-Protein+Interaction+in+Onion+Cells+Using+the+Helios+Gene.">Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene.</a> (40), (2010).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Dans cette étude, des stratégies simples sont décrits pour la localisation d&#39;une seule protéine transgénique à plusieurs compartiments cellulaires chez les plantes. L&#39;objectif était de concevoir construction qui exprimerait un seul gène dans plus d&#39;un organite dans Nicotiana benthamiana. Les stratégies comprennent la conception rationnelle de constructions à base d&#39;ADN GFP, assemblage Gibson, la livraison des plasmides aux cellules de la feuille avec le pistolet à gènes, et l&#39;obs...

Ce travail est un projet d&#39;ingénierie / de la biologie synthétique métabolique dans lequel les cellules végétales sont modifiées pour exprimer une protéine rapporteur dans plusieurs organites mais avec une seule construction d&#39;ADN. Une approche pour cibler des protéines à plus d&#39;un emplacement de clonage implique de multiples copies génétiques, chacune contenant un peptide de localisation différente. Chaque copie doit être introduite par retransformation successifs, ou encore, par rétrocroisement transformations simples 1. Il s&#39;agit de clonage supplémentaire, et est limitée par une balise de localisation par terminus. Une autre façon de localiser une protéine à plusieurs endroits à travers l&#39;épissage alternatif 2-5. ARN est transcrit à partir d&#39;un seul gène, mais différentes copies de la transcription sont traitées différemment, souvent dans plus d&#39;un titre par cellule. Cela peut entraîner plus d&#39;un ARN messager dans la cellule transcrit à partir d&#39;un gène unique. Ces différents messengeARN R peut coder pour différentes isoformes de la même protéine, ou dans le cas d&#39;un décalage du cadre, une protéine différente. Bien que l&#39;épissage alternatif ont été décrits dans la littérature depuis de nombreuses années, les mécanismes d&#39;action et de donneur conservée et les sites d&#39;épissage des récepteurs ne sont élucidés, plus récemment, 6. Comme ces sites sont mieux décrites, elles ouvrent des opportunités pour l&#39;ingénierie. ingénieurs métaboliques des plantes sont confrontés à un défi en exprimant une protéine dans plusieurs organites. Pour une protéine qui doit être localisée à plus d&#39;un organite, le mécanicien doit cloner le gène même plusieurs fois, chacune avec une séquence signal séparé le diriger vers l&#39;organite d&#39;intérêt. Pour un gène unique en trois organelles, il s&#39;agit simplement de trois gènes. Mais pour une voie métabolique six gène, cela élargit à 18 gènes, un effort significatif de clonage. Combinaison de plusieurs séquences de localisation en un seul signe de gène, alternativement épisséréduit ificantly cet effort. Par exemple, re-engineering photorespiration 7,8 et la synthèse des isoprénoïdes 9,10 implique à la fois les chloroplastes et les peroxysomes. Dans notre cas, nous avons profité de sites d&#39;épissage comme observé dans un système naturel de Arabidopsis thaliana décrit précédemment 6. Nous rationnelle redessiné la séquence d&#39;ARNm de quitter les sites d&#39;épissage naturels seul, mais placés séquences qui coder chloroplastes ou des balises péroxisome ciblage dans les introns épissés alternativement-(Figure 1). La protéine exprimée peut être ou ne pas avoir une étiquette, selon que le pré-ARNm codé qui a été excisé sous la forme d&#39;un intron (figures 1g et 1h). Pour plus d&#39;informations sur la conception des constructions présentées dans ce travail, s&#39;il vous plaît voir l&#39;article de compagnon 11. Parce que c&#39;est encore un effort significatif de clonage, assemblage Gibson, une nouvelle méthode de clonage des constructions d&#39;ADN, est used dans la construction. Procédé Gibson peut être utilisée pour n&#39;importe quelle séquence, indépendamment de sites de restriction (figure 2) de 12 à 14. La composition précise des enzymes permet en une seule étape, l&#39;assemblage isotherme. Dans ce procédé, plusieurs parties linéaires à double brin d&#39;ADN ont été conçus de telle sorte qu&#39;ils ont des séquences chevauchantes de ~ 50 bp. L&#39;ensemble de mélange d&#39;enzymes Gibson digère partiellement les parties d&#39;ADN linéaires, exposant simples brins de séquences homologues. Ces séquences simple brin partiels sont à nouveau recuit dans le mélange réactionnel, résultant en une seule étape, indépendante de la séquence, la réaction de ligature sous-clonage libre-rapide. Ce travail décrit une) conception rationnelle constructions épissage alternatif pour l&#39;expression dans les chloroplastes des plantes, les peroxysomes, et cytosols, 2) leur clonage en utilisant le nouveau procédé d&#39;assemblage Gibson libre ligature, 3) leur livraison dans les cellules de la feuille de tabac avec le pistolet à gènes, et 4) des résultats montrant ciblage organite, comme observé avec la GFPet microscopie confocale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="693">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oligonucleotide primers</td>
			<td style="width:191px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">(custom)</td>
			<td style="width:167px;">Design specifically for construct</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneBlocks</td>
			<td style="width:191px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">(custom)</td>
			<td>500 bp oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ApE software</td>
			<td style="width:191px;">U Utah</td>
			<td style="width:119px;">(download)</td>
			<td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinElute kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28004</td>
			<td>Used to purify PCR products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td>Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion Master Mix with GC Buffer</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0532S</td>
			<td>Used to PCR-amplify gene of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gibson assembly reaction mix</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2611L</td>
			<td>Master mix of the following 9 ingredients</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M Tris-HCl pH7.5</td>
			<td style="width:191px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">T1075</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M MgCl2</td>
			<td style="width:191px;">G Biosiences</td>
			<td style="width:119px;">82023-086</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:191px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">R0192</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M DTT</td>
			<td style="width:191px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">R0861</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PEG-8000</td>
			<td style="width:191px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">19966</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NAD</td>
			<td style="width:191px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A1124,0005</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T5 exonuclease</td>
			<td style="width:191px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">T5E4111K</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phusion polymerase</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">F530S</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taq DNA ligase</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0208L</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gibthon.org</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Website to simplify calculations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid PLUS Maxi kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12963</td>
			<td>Used to prepare DNA for gene gun bullets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gene Gun system</td>
			<td style="width:191px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">165-2451</td>
			<td>Includes all parts necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nicotania benthamiana</td>
			<td style="width:191px;">(n/a)</td>
			<td style="width:119px;">(n/a)</td>
			<td>Gift of Jen Sheen, MGH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">SP5 X MP</td>
			<td>Imaging of resultant cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Deep well slides</td>
			<td style="width:191px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">71561-01</td>
			<td>Used for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">A Plasmid Editor (ApE) </td>
			<td style="width:191px;">University of Utah </td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gibthon:Ligation calculator</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient gene expression in tobacco using gibson assembly and the gene gun

Afin de cibler une seule protéine à plusieurs organites intracellulaires, plantes généralement double emploi avec les gènes pertinents, et d&#39;exprimer chaque gène séparément à l&#39;aide des stratégies de réglementation complexes, y compris les promoteurs de différentiels et / ou des séquences de signaux. Ingénieurs métaboliques et les biologistes synthétiques intéressés à cibler les enzymes à un organite particulier sont confrontés à un défi: Pour une protéine qui doit être localisée à plus d&#39;un organite, l&#39;ingénieur doit cloner le gène même plusieurs fois. Ce travail présente une solution à cette stratégie: exploiter l&#39;épissage alternatif de l&#39;ARNm. Cette technique tire parti du chloroplaste établi et des séquences de ciblage de peroxysome et les combine en un seul ARNm qui est épissé de façon alternative. Certains variants d&#39;épissage sont envoyés vers le chloroplaste, les uns pour le peroxysome, et certains au cytosol. Ici, le système est conçu pour les multiples ciblant un organite de l&#39;épissage alternatif. Dans ce travail, la GFP a été prévu pour être exprEssed dans le chloroplaste, cytosol, et peroxysomes par une série d&#39;conçus rationnellement 5 &#39;de l&#39;ARNm des tags. Ces balises ont le potentiel de réduire la quantité de clonage nécessaire lorsque des gènes hétérologues doivent être exprimés en plusieurs organites intracellulaires. Les constructions ont été conçues dans le travail précédent 11, et ont été clones en utilisant Gibson assemblage, un procédé de clonage indépendant de la ligature qui ne nécessite pas d&#39;enzymes de restriction. Les plasmides résultants ont été introduits dans les cellules épidermiques des feuilles de Nicotiana benthamiana avec un protocole Gene Gun modifié. Enfin, les feuilles transformées ont été observées par microscopie confocale.

L&#39;effort de conception est le résultat d&#39;une planification importante. Roman de ce projet est l&#39;utilisation de l&#39;épissage alternatif de créer un pré-ARNm qui est traduit en protéines exprimées de façon différentielle. Ces protéines sont exprimées dans différents organelles, dans ce cas, le chloroplaste, des peroxysomes et / ou cytosol. Nous avons adapté gène d&#39;Arabidopsis naturel qui est épissage alternatif 6, et placé chloroplaste 6 et 17 pero...

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Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Ce travail décrit un nouveau procédé pour cibler sélectivement des organelles sous-cellulaires dans les plantes, dosés par la BioRad Gene Gun.

Transient expression des gènes dans le tabac en utilisant Assemblée Gibson et le Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

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Research

JoVE Journal

Environment

20.4K vues.  Harvard University.  Ce travail décrit un nouveau procédé pour cibler sélectivement des organelles sous-cellulaires dans les plantes, dosés par la BioRad Gene Gun. 

Vidéo: Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Much of the nutrient cycling and carbon processing in natural environments occurs through the activity of extracellular enzymes released by microorganisms. Thus, measurement of the activity of these extracellular enzymes can give insights into the rates of ecosystem level processes, such as organic matter decomposition or nitrogen and phosphorus mineralization. Assays of extracellular enzyme activity in environmental samples typically involve exposing the samples to artificial colorimetric or fluorometric substrates and tracking the rate of substrate hydrolysis. Here we describe microplate based methods for these procedures that allow the analysis of large numbers of samples within a short time frame. Samples are allowed to react with artificial substrates within 96-well microplates or deep well microplate blocks, and enzyme activity is subsequently determined by absorption or fluorescence of the resulting end product using a typical microplate reader or fluorometer. Such high throughput procedures not only facilitate comparisons between spatially separate sites or ecosystems, but also substantially reduce the cost of such assays by reducing overall reagent volumes needed per sample.

Microplate based procedures are described for the colorimetric or fluorometric analysis of extracellular enzyme activity. These procedures allow for the rapid assay of such activity in large numbers of environmental samples within a manageable time frame.

Détermination de l&#39;activité enzymatique microbienne extracellulaire dans les eaux, les sols et les sédiments de haut débit microplaques dosages

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Recherche

Environnement

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the exploration of renewable resources are necessary to overcome these challenges. Within the multinational framework MultiBioPro we are developing biorefinery pipelines to maximize the use of plant biomass. More specifically, we use poplar and tobacco tree (Nicotiana glauca) as target crop species for improving saccharification, isoprenoid, long chain hydrocarbon contents, fiber quality, and suberin and lignin contents. The methods used to obtain these outputs include GC-MS, LC-MS and RNA sequencing platforms. The metabolite pipelines are well established tools to generate these types of data, but also have the limitations in that only well characterized metabolites can be used. The deep sequencing will allow us to include all transcripts present during the developmental stages of the tobacco tree leaf, but has to be mapped back to the sequence of Nicotiana tabacum. With these set-ups, we aim at a basic understanding for underlying processes and at establishing an industrial framework to exploit the outcomes. In a more long term perspective, we believe that data generated here will provide means for a sustainable biorefinery process using poplar and tobacco tree as raw material. To date the basal level of metabolites in the samples have been analyzed and the protocols utilized are provided in this article.

Plant biomass offers a renewable resource for multiple products, including fuel, feed, food, and a variety of materials. In this paper we investigate the properties of tobacco tree (Nicotiana glauca) and poplar as suitable sources for a biorefinery pipeline.

Transcription et profilage des métabolites pour l&#39;évaluation des arbres tabac et le peuplier comme matière première pour l&#39;industrie de la bioéconomie

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

Tracking Microbial Contamination in Retail Environments Using Fluorescent Powder - A Retail Delicatessen Environment Example

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne illness. Ready-to-eat (RTE) processed foods such as deli meats, cheese, and in some cases fresh produce, have been involved in foodborne disease outbreaks due to contamination with pathogens such as Listeria monocytogenes. With respect to L. monocytogenes, deli slicers are often the main source of cross contamination. The goal of this study was to use a fluorescent compound to simulate bacterial contamination and track this contamination in a retail setting. A mock deli kitchen was designed to simulate the retail environment. Deli meat was inoculated with the fluorescent compound and volunteers were recruited to complete a set of tasks similar to those expected of a food retail employee. The volunteers were instructed to slice, package, and store the meat in a deli refrigerator. The potential cross contamination was tracked in the mock retail environment by swabbing specific areas and measuring the optical density of the swabbed area with a spectrophotometer. The results indicated that the refrigerator (i.e. deli case) grip and various areas on the slicer had the highest risk for cross contamination. The results of this study may be used to develop more focused training material for retail employees. In addition, similar methodologies could also be used to track microbial contamination in food production environments (e.g.&#160;small farms), hospitals, nursing homes, cruise ships, and hotels.

The overall goal of this study was to demonstrate the potential cross contamination mechanism of foodborne pathogen Listeria monocytogenes in a retail deli setting. This methodology may be applied to a variety of different environments to track pathogen contamination. &#160;

Suivi de la contamination microbienne dans les environnements de vente au détail à l&#39;aide de poudre fluorescente - Un détail Charcuterie Environnement Exemple

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne ...

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture organisms, such as hyphae-building fungi and anaerobic bacteria, has hastened the use of recombinant technologies in this field. Plant expression methods are a desirable system for large-scale production of enzymes and other industrially useful proteins. Herein, methods for the transient expression of a fungal endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum are demonstrated. Successful protein expression is shown, monitored by fluorescence using an mCherry-enzyme fusion protein. Additionally, a set of basic tests are used to examine the activity of transiently expressed T. reesei Cel5A, including SDS-PAGE, Western blotting, zymography, as well as&#160;fluorescence and dye-based substrate degradation assays. The system described here can be used to produce an active cellulase in a short time period, so as to assess the potential for further production in plants through constitutive or inducible expression systems.

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tobacco plants were used to produce a fungal cellulase, TrCel5A, via a transient expression system. The expression could be monitored using a fluorescent fusion protein, and the protein activity was characterized post-expression.

Expression de recombinant cellulase Cel5A de<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Dans les usines de tabac

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.

This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.

Dépistage denrées alimentaires pour les intégrons de classe 1 et Gene Cassettes

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That represents 100 million tons of food being destroyed or diverted to non-human consumption each year. Aflatoxins are powerful carcinogens normally accumulated by the fungi Aspergillus flavus and A. parasiticus in cereals, nuts, root crops and other agricultural products. Silencing of five aflatoxin-synthesis genes by RNA interference (RNAi) in peanut plants was used to control aflatoxin accumulation following inoculation with A. flavus. Previously, no method existed to analyze the effectiveness of RNAi in individual peanut transgenic events, as these usually produce few seeds, and traditional methods of large field experiments under aflatoxin-conducive conditions were not an option. In the field, the probability of finding naturally contaminated seeds is often 1/100 to 1/1,000. In addition, aflatoxin contamination is not uniformly distributed. Our method uses few seeds per transgenic event, with small pieces processed for real-time PCR (RT-PCR) or small RNA sequencing, and for analysis of aflatoxin accumulation by ultra-performance liquid chromatography (UPLC). RNAi-expressing peanut lines 288-72 and 288-74, showed up to 100% reduction (p&#8804;0.01) in aflatoxin B1 and B2 compared to the control that accumulated up to 14,000 ng.g-1 of aflatoxin B1 when inoculated with aflatoxigenic A. flavus. As reference, the maximum total of aflatoxins allowable for human consumption in the United States is 20 ng.g-1. This protocol describes the application of RNAi-mediated control of aflatoxins in transgenic peanut seeds and methods for its evaluation. We believe that its application in breeding of peanut and other crops will bring rapid advancement in this important area of science, medicine and human nutrition, and will significantly contribute to the international effort to control aflatoxins, and potentially other mycotoxins in major food crops.

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

We demonstrate a method for the analysis of aflatoxins and transgene expression in peanut seeds that contain RNA-interference signals for silencing aflatoxin-synthesis genes in the fungus Aspergillus flavus. RNAi-mediated control of mycotoxins in plants has not been reported previously.

Contrôle des aflatoxines dans les arachides ARNi médiée: méthode pour analyser la production de mycotoxines et Transgene expression dans la Peanut /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystème

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly relevant as a model for the studies of osmoregulatory mechanisms because of its extreme tolerance to low salinity. It is also widely used as a model of settling biology, in particular in relation to antifouling research. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae for studies. A protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus has been developed and a detailed description of all steps in the production line is outlined (i.e., the establishment of adult cultures on panels, the collection and rearing of barnacle larvae, and the administration of feed for adults and larvae). The description also provides guidance on troubleshooting and discusses critical parameters (e.g., the removal of contamination, the production of high-quality feed, the manpower needed, and the importance of high-quality seawater). Each batch from the culturing system maximally yields roughly 12,000 nauplii and can deliver four batches in a week, so up to almost 50,000 larvae per week can be produced. The method used to culture B. improvisus is, probably, to a large extent also applicable to other marine invertebrates with free-swimminglarvae. Protocols are presented for the dissection of various tissues from adults as well as the production of high-quality RNA for studies on gene expression. It is also described how cultured adults and reared cyprids can be utilized in a wide array of experimental designs for examining gene expression in relation to external factors. The use of cultured barnacles in gene expression is illustrated with studies of possible osmoregulatory roles of Na+/K+ ATPase and aquaporins.

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is a model for studying osmoregulation and antifouling. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae. Here, a protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus is described, including the production of larvae. The use of cultured barnacles in gene expression studies is illustrated.

balane Balanus improvisus comme modèle Marine - culture et l’Expression des gènes

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into the plant&#39;s genome. Here, we present two transformation systems to genetically modify potato (Solanum tuberosum) plants. In A. tumefaciens transformation, leaves are infected, the transformed cells are selected and a new complete transformed plant is regenerated using phytohormones in 18 weeks. In A. rhizogenes transformation, stems are infected by injecting the bacteria with a needle, the new emerged transformed hairy roots are detected using a red fluorescent marker and the non-transformed roots are removed. In 5-6 weeks, the resulting plant is a composite of a wild type shoot with fully developed transformed hairy roots. To increase the biomass, the transformed hairy roots can be excised and self-propagated. We applied both Agrobacterium-mediated transformation methods to obtain roots expressing the GUS reporter gene driven by a suberin biosynthetic gene promoter. The GUS staining procedure is provided and allows the cell localization of the promoter induction. In both methods, the transformed potato roots showed GUS staining in the suberized endodermis and exodermis, and additionally, in A. rhizogenes transformed roots the GUS activity was also detected in the emergence of lateral roots. These results suggest that A. rhizogenes can be a fast alternative tool to study the genes that are expressed&#160;in roots.

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Here, we present two protocols to transform potato plants. The Agrobacterium tumefaciens transformation leads to a complete transgenic plant while the Agrobacterium rhizogenes produces transgenic hairy roots in a wild type shoot that can be self-propagated. We then detect promoter activity by GUS staining in the transformed roots.

Agrobacterium tumefaciens et Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation des pommes de terre et de l’activité du promoteur d’un gène de subérine par GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more streamlined herbivory protocols. Perturbations of chewing insects are usually studied in whole plant systems. While this whole organism strategy is popular, it is not necessary if similar observations can be replicated in a single detached leaf. The assumption is that basic elements required for signal transduction are present within the leaf itself. In the case of early events in signal transduction, cells need only to receive the signal from the perturbation and transmit that signal to neighboring cells which are assayed for gene expression.
The proposed method simply changes the timing of the detachment. In whole plant experiments, larvae are confined to a single leaf which is eventually detached from the plant and assayed for gene expression. If the order of excision is reversed, from last in whole plant studies, to first in the detached study, the feeding experiment is simplified.
Solanum tuberosum var. Kennebec is propagated by nodal transfer in a simple tissue culture medium and transferred to soil for further growth if desired. Leaves are excised from the parent plant and relocated to Petri dishes where the feeding assay is conducted with the larval stages of M. sexta. Damaged leaf tissue is assayed for the expression of relatively early events in signal transduction. Gene expression analysis identified infestation-specific Cys2-His2 (C2H2) transcription factors, confirming the success of using detached leaves in early response studies. The method is easier to perform than whole plant infestations and uses less space.

The presented method creates natural herbivore damaged plant tissue through the application of Manduca sexta larvae to detached leaves of potato. The plant tissue is assayed for expression of six transcription factor homologs involved in early responses to insect herbivory.

Des essais de feuilles détachées pour simplifier les études sur l'expression génique de la pomme de terre pendant l'infestation par l'insecte à mâcher Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

Estimation de l'indice de la zone des feuilles à l'aide de trois méthodes distinctes dans les peuplements à feuilles caduques pures

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...