Ce travail a été soutenu par le BMBF Forschungsinitiative &quot;BioEnergie 2021 - Forschung für die Nutzung von Biomasse&quot; et le pôle d&#39;excellence &quot;carburants sur mesure à partir de la biomasse&quot;, qui est financé par l&#39;Initiative d&#39;excellence par les gouvernements fédéral et de l&#39;Etat allemand pour promouvoir la science et de la recherche dans les universités allemandes.

1. Croissance de type sauvage N. tabacum plantes <ol><li> Pour grandir N. tabacum L. cv. Plantes Petit Havana SR1 sur le sol, placez les graines de tabac sur les pots appropriés remplis avec du terreau normal pour la germination. Après 2 semaines, transférer les plants dans des pots individuels. Incuber les plantes dans une serre avec une constante de 22 ° C (période sombre) ou 25 ° C (période de lumière) et 70% d&#39;humidité relative de l&#39;air. Fournir un éclairage dans un 16/8 h cycle lumière / obscurité (par exemple Philips IP65 400 lampes de W; 180 pmol · s -1 · m -2; λ = 400-700 nm) et de l&#39;eau tous les jours. </li></ol> 2. Expression transitoire de TrCel5A et TrCel5A-mCherry protéines <ol><li> Dans des conditions stériles, prélever des colonies simples d&#39;Agrobacterium Agarobacterium (de GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RIFR) contenant soit pTRAkc-ER-TrCel5A ou pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry et transfert dans un erlenmeyer contenant 10 ml d&#39;extrait de levurebouillon (YEB, préparé selon les spécifications du fabricant) à moyen et à la kanamycine (50 mg / ml), de rifampicine (50 mg / ml) et de la carbénicilline (100 mg / ml) pour la sélection. Incuber pendant 36-40 heures à 26 ° C et 180 rpm. Remarque: La conception de constructions appropriées pour l&#39;expression de la protéine est en dehors du champ d&#39;application de cet article, mais à titre indicatif, les méthodes de Maclean et al 13 et Munro et Pellham 14 peut être suivie pour la conception de construction.. </li><li> Prendre 200 pi de chaque culture pour inoculer 20 ml de YEB avec les concentrations en antibiotiques mentionnés ci-dessus et incuber dans les mêmes conditions que précédemment. </li><li> Après 36 à 40 h, les cultures preinduce en ajoutant 2 ul acetosyringon (200 pM concentration finale), 100 ul de 40% (p / v) de solution de glucose et de 200 pi de tampon de 1 M de MES pH 5,6. Incuber pendant la nuit. </li><li> Préparer 100 ml d&#39;un tampon d&#39;infiltration 2x (sels basaux 100 g / L de saccharose, 3,6 g / L de glucose, 8,6 g / L de Murashige et Skoog, Ajuster le pH à 5,6 avec de l&#39;hydroxyde de potassium). </li><li> Mesurer la DO 600 des cultures avec des dilutions 1:05 jusqu&#39;à atteindre une DO 600 de 5-6. Calculer le volume de culture nécessaire pour 30 ml de milieu d&#39;infiltration à DO 600. Ajouter 15 ml de tampon d&#39;infiltration 2x, puis ajouter H 2 O déminéralisée pour rendre le tampon jusqu&#39;à 30 ml. </li><li> Prendre des plantes de serre et utiliser un embout de pipette pour entailler le côté abaxial de la 3 e à 5 e feuille du haut pour faciliter l&#39;infiltration. </li><li> Utiliser un embout de pipette pour entailler le côté abaxiale des feuilles pour faciliter l&#39;infiltration. </li><li> Remplir une seringue avec du milieu de l&#39;infiltration et de le mettre (sans aiguille) sur l&#39;une des entailles faites précédemment. Supporte seringue avec un doigt sur le côté ventral de la feuille. Appuyez sur le support avec soin dans le tissu des zones de la feuille interveinales. Note: Après infiltration, de cultiver les plantes dans une serre, dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus. En outre, maintenir une proportion égale de untreated, plantes non-expression transitoire (NTEPs) que les contrôles, dans les mêmes conditions que les plantes infiltrés. </li></ol> 3. Évaluation de TrCel5A-mCherry expression dans les feuilles des plantes <ol><li> Après 4-6 jours, prendre des plantes infiltrées par A. tumefaciens contenant pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry de l&#39;effet de serre et les placer dans une pièce sombre pour l&#39;analyse de fluorescence. </li><li> Pour visualiser la fluorescence dans des sections de feuilles exprimant TrCel5A-mCherry, plantes d&#39;éclairage utilisant une source de lumière portable émettant de la lumière verte à 515 nm avec un filtre rouge (620-750 nm). Remarque: Dans une caractérisation approfondie de l&#39;expression des protéines dans les feuilles des plantes peut être réalisé en feuilles minces sectionnement avec un vibratome et examen à la lumière et microscopie de fluorescence. Pour cette suivez les étapes ci-dessous: <ol><li> Couper de petites sections d&#39;environ 5 x 5 mm de taille d&#39;une feuille infiltré et les incorporer dans 4% d&#39;agarose dissous dans 50 mM de tampon phosphate (pH 5,7). </li><li> Cutsection de 80 à 90 um de taille à partir de feuilles en utilisant un vibratome embarqués. Placez-les sur une lame de microscope, couvrir avec un tampon ou une lamelle et examiner les en utilisant un microscope à un grossissement de 10X avec un détecteur de fluorescence, en utilisant la même longueur d&#39;onde et de filtrage ci-dessus. </li></ol></li></ol> 4. TrCel5A extraction à partir de feuilles de tabac <ol><li> Couper des morceaux de feuilles de tabac pour un poids approximatif de 1 g de plantes infectées par A. tumefaciens contenant pTRAkc-ER-TrCel5A et placer dans un mortier préalablement refroidi à l&#39;azote liquide. Ajouter une quantité appropriée de l&#39;azote liquide pour les échantillons. Grind laisse à poudre à l&#39;aide d&#39;un pilon préalablement refroidi. </li><li> Ajouter 2 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant du fluorure de phénylméthylsulfonyle 1 mM à la matière de la feuille de sol et mélanger jusqu&#39;à ce que la majorité de la matière de la feuille se trouve en suspension. Extrait du Centrifuger à 15 000 g pendant 20 min à 4 ° C et à prendre surnageant contenant des protéines. </li><li> Centrifuge l&#39;extrait à 15 000 g pendant 20 min à 4 ° C et de prendre surnageant contenant des protéines en faisant attention de ne pas perturber le culot. Éliminer le culot. </li><li> Purifier partiellement TrCel5A par incubation du surnageant contenant des protéines à 55 ° C pendant 10 min. Laisser reposer à température ambiante pendant encore 10 min, puis centrifuger à 15 000 g pendant 10 min à température ambiante. Répétez le processus de purification partielle pour les plantes non infiltrées d&#39;obtenir des échantillons de contrôle. Utiliser ces échantillons pour toutes les expériences suivantes. Remarque: Les solutions de protéines peuvent être stockés à 4 ° C pendant 1 semaine ou à -20 ° C pendant jusqu&#39;à 3 mois. </li><li> Répéter le procédé de purification partielle pour les plantes non infiltrées d&#39;obtenir des échantillons de contrôle. Utiliser ces échantillons pour toutes les expériences suivantes. Remarque: Les solutions de protéines peuvent être stockés à 4 ° C pendant 1 semaine ou à -20 ° C pendant jusqu&#39;à 3 mois. </li></ol> 5. SDS-PAGE, transfert de Western, et Azo-CMC Zymographie de TrCel5A-mCherry &lt;/ P&gt; <ol><li> Achat ou préparer 12% (p / v) des gels de SDS-PAGE que par des méthodes établies 15. </li><li> Dissoudre la CMC dans l&#39;eau pour obtenir un (m / v) solution à 1,5%. Pour faire des gels de CMC-SDS-PAGE, substituer 1 ml de 1,5% de CMC à 1 ml d&#39;eau dans une solution de 10 ml de gel de SDS-PAGE mélange, résultant en un 0,1% (p / v) de CMC + 12% (p / v ) gel SDS-PAGE mélange. Verser gel normalement. Remarque: S&#39;assurer que la CMC dans la solution initiale est complètement dissous par une combinaison d&#39;agitation et chauffage à 40 ° C (répéter directement avant la préparation de la solution de gel). </li><li> Dénaturer les échantillons par ébullition en présence de SDS, selon des méthodes établies 12. Comme témoin positif, en utilisant une dilution 1:500 d&#39;un mélange de cellulases disponibles dans le commerce à partir de T. reesei, tel que T. reesei ATCC 26921. Comme témoin négatif utiliser une solution de protéines de même préparé à partir de feuilles non infiltrées (NTEPs). </li><li> Effectuer le électrophorèse selon les protocoles normaux 15,par exemple, l&#39;utilisation de 200 V pendant environ 50 min avec la électrophorèse interrompu une fois que le front de colorant atteint le bas du gel. </li><li> Une tache gel de SDS-PAGE en utilisant 0,1% (p / v) de bleu brillant de Coomassie et destain en utilisant un mélange méthanol / acide acétique glacial. Remarque: coloration rapide et décoloration peuvent être effectuées en chauffant légèrement la coloration et décoloration des solutions, c&#39;est à dire en utilisant un micro-ondes pendant environ 15 secondes pour se réchauffer (mais pas bouillir) d&#39;abord la coloration et les solutions de décoloration, de changer la solution de décoloration après 10 min , ou lorsqu&#39;il est refroidi, et répéter avec la nouvelle solution de décoloration. </li><li> Effectuer un Western blot d&#39;une gel SDS-PAGE en utilisant des protocoles établis 16,17. Utiliser les anticorps suivants: un anticorps polyclonal de lapin contre un anticorps anti-lapin de région Fc His-tag (primaire) et une chèvre polyclonal qui a été conjugué à une phosphatase alcaline (secondaire). Remarque: Anticorps secondaires doivent être choisis pour permettre la visualisation en utilisant nitrobleu tétrazolium chloride/5-bromo-4-chloro-3 &#39;-indolyphosphate sel de p-toluidine (NBT / BCIP), comme décrit 18. </li><li> Effectuer protéine dans le gel de repliement sur le 0,15% (p / v) de gel de CMC SDS-PAGE par incubation du gel dans 1,5% (p / v) β-cyclodextrine, le phosphate-citrate buffer 20 mM, pH 6,5, à température ambiante, avec agitation douce pendant 15 min 19. </li><li> Jeter la solution de β-cyclodextrine et laver rapidement le gel avec H 2 O. Incuber à température ambiante dans 50 mM de tampon d&#39;acétate de sodium (pH 4,8) pendant encore 15 min. Effectuer zymographie en utilisant la CMC à 0,15% CMC gel SDS-PAGE repliée en faisant incuber le gel dans 30 mM de tampon acétate de sodium pH 4,8 pendant 20 min à 50 ° C. </li><li> Effectuer zymographie en utilisant la CMC repliée 0,15% (p / v) de CMC gel SDS-PAGE, le gel par incubation dans 30 mM de tampon acétate de sodium (pH 4,8) pendant 20 min à 50 ° C. </li><li> Colorer le gel pendant 10 min en utilisant un 0,1% p / v de solution de rouge Congo et destain pendant 30 min ou jusqu&#39;à ce que les bandes claires sont observées en utilisant 1 M de NaCl. Laver le gel avec 0,3% (v / v) d&#39;acide acétique pour une imagerie plus claire. </li></ol> 6. 4 MUC Dosage de l&#39;activité de TrCel5A <ol><li> Préparer une solution stock de 10 mM 4 MUC dans 50% (v / v) méthanol, et de le stocker dans l&#39;obscurité à la température ambiante </li><li> Immédiatement avant le dosage, préparer une solution de travail 4-MUC 2x, composé de 1 mM de 4-MUC et 60 mM d&#39;acétate de sodium, pH 4,8. </li><li> Effectuer ce test sur ​​des échantillons contenant 100 ul de protéine de feuilles (avec ou sans TrCel5A exprimée de manière inductible), 100 ul d&#39;un mélange de cellulases disponibles dans le commerce à partir de T. 1:1000 reesei, et pur H 2 O, respectivement. Tester chaque échantillon en triple exemplaire. </li><li> Ajouter 100 ul de la solution de travail 4-MUC dans des puits séparés d&#39;une plaque de 96 puits, puis ajouter 100 ul de chaque échantillon. </li><li> Déterminer 0 min timepoint de 4-MU fluorescence à travers la spectroscopie de fluorescence, en utilisant une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 360 ​​nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 465 nm. </li><li> Incuber les plaques à 20min à 50 ° C, recouvertes avec des couvercles d&#39;adhésif pour empêcher l&#39;évaporation. Arrêter la réaction par le gel (ou en combinant 100 pi 0,15 M de glycine, pH 10,0, et 100 ul d&#39;échantillon dans une plaque séparée). </li><li> Déterminer le point de terminaison de 4-MU fluorescence par spectroscopie de fluorescence, en utilisant une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 360 ​​nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 465 nm. Soustraire 0 min de point de terminaison (20 min) timepoint pour obtenir le changement de valeurs de fluorescence. </li></ol> 7. Azo-carboxyméthyl cellulose Dosage de l&#39;activité de TrCel5A <ol><li> Préparer un stock de 1,5% (p / v) Azo-CMC qui est stocké à la température ambiante, et une solution de précipitation contenant de l&#39;acétate 18 mM de zinc, 0,5 M d&#39;acétate de sodium, pH 5 et 80% d&#39;éthanol (v / v), entreposer à manger température. </li><li> Immédiatement avant le dosage, préparer une solution de CMC Azo-2x travail, composé de 1% (p / v) Azo-CMC (dans H 2 O) et de 60 mM d&#39;acétate de sodium, pH 4,8. </li><li> Moissonneuse 50 ul d&#39;échantillon et 50 ul de travailsolution durable en tubes de 1,5 ml. </li><li> Les échantillons d&#39;essai contenant 50 ul de protéine de feuilles (avec ou sans TrCel5A exprimé de manière transitoire); 100 pl d&#39;un mélange de cellulases disponibles dans le commerce à partir de T. reesei dilué 1:1000; et pur H 2 O. Échantillons et des normes en triple. </li><li> Incuber les échantillons pendant 20 min à 50 ° C. Arrêter la réaction en ajoutant 250 ul de solution de précipitation. Vortex chaque échantillon vigoureusement pendant 10 secondes pour assurer des solutions ont été complètement combinés. </li><li> Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 min, puis à nouveau vortex. Centrifuger les échantillons à 1000 g pendant 10 min. Prélever 200 ul de chaque échantillon surnageant à une plaque de 96 puits, en prenant soin de ne pas perturber le culot. </li><li> Dosage par spectroscopie d&#39;absorbance à une longueur d&#39;onde de 590 nm. </li></ol> 8. PAHBAH Dosage de TrCel5A <ol><li> Utilisez un poinçon à découper un cercle (~ de 5,5 mm de diamètre) de papier filtre. Ajouter 100 ul de 60 mM NaAc, pH 4,8, et 100 pi d&#39;échantillons, soit contenant des protéines de feuille (avec ou sans TrCel5A exprimée de manière inductible) ou un T. commerciale mélange de cellulases reesei, dilué 1:1000, et incuber avec des cercles de papier filtre pendant 20 heures à 50 ° C avec 300 tours en secouant. Pour chaque échantillon incubé avec du papier filtre, incuber également une solution double sans papier filtre comme échantillon-commandes individuelles. </li><li> Préparer un 330 mM p-hydroxy hydrazide de l&#39;acide benzoïque (PAHBAH) solution A en dissolvant PAHBAH en H 2 O avec l&#39;ajout de 5 ml de HCl concentré pour un total de 100 ml de solution, et conserver à la température ambiante. Nota: Les meilleurs résultats sont obtenus en ajoutant le HCl à un plus petit volume de PAHBAH suspension, c&#39;est à dire 30 ml, que l&#39;on agite à une température d&#39;aider la dissolution avant d&#39;effectuer le volume à 100 ml avec de l&#39;H 2 O. </li><li> Préparer PAHBAH solution B, contenant du citrate de sodium 50 mM, 10 mM de chlorure de calcium, et du NaOH 500 mM et stocker à température ambiante. </li><li> Immediately avant le dosage, préparer une solution de travail de 1,5 x 1 ml de réactif PAHBAH à 9 ml de solution tampon, stocker sur de la glace jusqu&#39;à utilisation (pour être utilisé dans les 4 heures). </li><li> Préparer les échantillons en thermostables 0,2 ou 0,5 ml tubes. Moissonneuse 5 pi de chaque solution incubée avec un papier filtre (étape 8.1), 45 ul de H 2 O et 100 ul de solution de travail PAHBAH. contrôles d&#39;échantillons (échantillons incubés sans papier filtre) doivent être exécutés dans les mêmes concentrations (5 échantillons de pi, 45 pi H 2 O, solution de travail de 100 pi de PAHBAH). Tester également des normes 5 (5 ul) contenant entre 0 et 0,2 g / L de glucose pur et H 2 O. Échantillons et des normes en triple. </li><li> Incuber les échantillons pour exactement 10 min à 100 ° C, puis refroidir à température ambiante pendant exactement 10 min. solutions de pipette dans une plaque de 96 puits et le dosage par spectroscopie à une longueur d&#39;onde de 410 nm. Soustraire échantillons-contrôles individuels (incubées sans papier filtre) à partir d&#39;échantillons d&#39;obtenir finalevaleurs. </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+sensitive+method+for+detection+of+alkaline+phosphatase-conjugated+anti-antibody+on+Western+blots.">A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots.</a> Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).</li><li>Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+&#946;-cyclodextrin+on+the+renaturation+of+enzymes+after+sodium+dodecyl+sulfate&#8211;polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Effect of &#946;-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate&#8211;polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).</li><li>Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+molecular+farming+in+the+future:+transient+protein+expression+in+plants.">Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).</li><li>Sammond, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+linkers+are+optimized+based+on+domain+type+and+function:+Insights+from+sequence+analysis,+biophysical+measurements,+and+molecular+simulation.">Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+heterologous+expression+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+II+and+cellobiohydrolase+II+in+the+yeasts+Pichia+pastoris+and+Yarrowia+lipolytica.">Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica.</a> Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

L&#39;expression recombinante de cellulases est un domaine de grand intérêt, en raison de la volonté de plus efficaces les systèmes de production de biocarburants 1. Plantes offrent de nombreuses possibilités pour la réussite de la production de cellulases, avec des fonctionnalités telles que les techniques de récolte économique et les méthodes de autohydrolyse étant des propriétés très souhaitables pour la production de biocarburants à grande échelle. En outre, l&#39;utilisation de différent...

<html> La dégradation de la biomasse lignocellulosique et sa transformation en combustible liquide a été envisagée comme une méthode pour réduire la dépendance aux combustibles fossiles. Un obstacle important dans l&#39;établissement de systèmes économiquement viables de transformation de la biomasse est dans la dégradation enzymatique de la cellulose et de l&#39;hémicellulose 1. systèmes d&#39;expression de plantes montrent un grand potentiel pour la production d&#39;enzymes à l&#39;échelle industrielle. Les systèmes agricoles à récolter des plantes économiquement et de volume sont déjà établis, comme ils l&#39;ont été pendant des milliers d&#39;années. La production de cellulases dans des plantes est souhaitable en raison de facteurs tels que la facilité d&#39;auto-hydrolyse 2, et la possibilité d&#39;optimiser l&#39;utilisation des taux d&#39;enzymes plus faibles en augmentant la digestibilité des parois cellulaires végétales 1. Enfin, les systèmes de plantes permettent le ciblage des protéines recombinantes à des zones spécifiques des cellules végétales et sont capables de modifier post-traductionnelle des enzymes le cas échéant 3. ve_content &quot;&gt; Nicotiana tabacum (tabac) est très couramment utilisé comme organisme modèle pour les études d&#39;expression de protéines hétérologues dans les plantes, en raison de ses fonctions rapides d&#39;accumulation croissance et la biomasse 4. L&#39;expression transitoire de protéines recombinantes est une technique qui permet la production de protéines dans de courtes périodes de temps 5, tout en conservant une flexibilité quant à la localisation, et donc des modifications post-traductionnelles des protéines choisies à savoir, les cellulases. Cela permet la production de la cellulase (s) pour l&#39;analyse de base, tout en jetant les bases de nouvelles stratégies d&#39;expression dans les plantes. En utilisant cette stratégie d&#39;expression transitoire, une endoglucanase à partir de la famille glycosyl hydrolase 5, Cel5A, dérivée de l&#39;hôte fongique Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) 6 est produit (ci-après dénommé TrCel5A). TrCel5A est une protéine de 42 kDa qui est nativement glycosylée et est très actif dans hydroylzing chaînes de cellulose 7. La technique d&#39;expression transitoire décrit ici est basé sur un système relativement couramment utilisés, infiltrant les feuilles de la plante avec des agrobactéries portant le gène d&#39;intérêt dans un vecteur d&#39;expression approprié. Afin de permettre une analyse rapide de la réussite de l&#39;expression in planta, TrCel5A peut également être exprimée en tant que protéine de fusion avec mCherry, une protéine fluorescente monomère initialement extraite de Discosoma sp. Protéine DsRed 8, avec un six résidus histidine supplémentaires (His-tag) fusionné à l&#39;extrémité C-terminale (TrCel5A-mCherry). L&#39;expression de la protéine de fusion hétérologue, TrCel5A-mCherry, peut donc être contrôlée dans la plante en croissance en utilisant la lumière verte à examiner mCherry dispersion. Si on le désire, des coupes minces de la matière végétale peut être examinée au microscope sous une lumière verte pour établir la localisation spécifique de la protéine. Pour ce travail, le signal et trans&#39;asseoir peptides ont été incorporés dans la construction, pour localiser l&#39;exportation de protéines hétérologues à le réticulum endoplasmique 9. Pour analyser l&#39;activité des cellulases végétaux exprimés, y compris TrCel5A, un certain nombre de tests d&#39;activité de cellulase peut être exécuté. Après l&#39;extraction des protéines totales solubles dans des plantes, TrCel5A peut être purifié en partie en utilisant une technique d&#39;incubation thermique. la taille de la protéine est établi en utilisant SDS-PAGE suivi d&#39;un Western blot. Zymographie peut être utilisée pour analyser l&#39;activité contre les substrats, par exemple la cellulose qui a été carboxy-méthylé (fabrication de la carboxyméthylcellulose CMC): pour la solubilité 10. Cellulase et glucosidase peut être contrôlée en utilisant le fluorophore 4 méthylumbelliféryl (4-MU) associé à β-D-cellobioside (combiné: 4-MUC). Un autre procédé pour évaluer l&#39;activité d&#39;endoglucanase comprend l&#39;analyse par spectrométrie de CMC qui a été associée à un azo-dvous (Remazolbrilliant Blue R) 11. En outre, l&#39;activité des protéines de deux endoglucanases et une gamme de cellulases peut être contrôlée par l&#39;utilisation d&#39;un test d&#39;analyse de sucre, tel que l&#39;hydrazide de p-hydroxy benzoïque (PAHBAH) dosage 12. Ces techniques peuvent être utilisées pour élucider et de quantifier l&#39;activité de la cellulase d&#39;intérêt exprimée.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:308px;">4-methylumbelliferyl &#946;-D-cellobioside</td>
			<td style="width:127px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:156px;">M6018</td>
			<td style="width:232px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetosyringon (concentrated)</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - kanamycin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - rifampicin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>4163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic - carbenicillin</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibody - rabbit anti His(6) pAb</td>
			<td>ROCKLAND</td>
			<td>600-401-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibody - goat anti rabbit AP, FC pAb</td>
			<td>DIANOVA</td>
			<td>111-055-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Azo-carboxymethyl cellulose</td>
			<td>MEGAZYME</td>
			<td>S-ACMC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C4805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carboxymethyl cellulose</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3333.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C2730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Congo red</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>75768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coomasie brilliant blue G 250</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>9598.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D(+)-glucose</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>8337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>K928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter paper - Rotilabo blotting paper</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>CL67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NBT/BCIP</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>72091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES buffer</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>4256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>8388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium citrate</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>20765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Soil, Einheitserde classic&#160;</td>
			<td>PATZER GMBH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrometer - Infinite M200</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S-5390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Hydroxy benzhydrazide&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H9882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>1058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV light source - BLAK RAY</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibratome - VT1000S</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of recombinant cellulase cel5a from trichoderma reesei in tobacco plants

Enzymes cellulose dégradantes, des cellulases, sont des cibles de la recherche et les intérêts industriels. La prépondérance de ces enzymes dans les organismes difficiles-à la culture, tels que les champignons de renforcement des hyphes et des bactéries anaérobies, a accéléré l&#39;utilisation des technologies recombinantes dans ce domaine. Modes d&#39;expression de plantes sont souhaitables pour un système de production à grande échelle d&#39;enzymes et d&#39;autres protéines utiles industriellement. Le présent mémoire, des procédés pour l&#39;expression transitoire d&#39;une endoglucanase fongique Trichoderma reesei Cel5A, dans Nicotiana tabacum sont démontrées. Expression de la protéine réussie est signalée, surveillée par fluorescence en utilisant une protéine de fusion mCherry-enzyme. En outre, un ensemble de tests de base sont utilisés pour examiner l&#39;activité de T. transitoirement exprimé Cel5A reesei, y compris SDS-PAGE, Western blot, zymographie, ainsi que les dosages de fluorescence et de substrats de dégradation à base de colorant. Le système décrit ici peut être utilisé pour produire une cellule activeULASE dans une courte période de temps, afin d&#39;évaluer le potentiel de production dans les usines à travers des systèmes d&#39;expression constitutifs ou inductibles.

TrCel5A et TrCel5A-mCherry ont été exprimés avec succès dans des plants de tabac en utilisant le système d&#39;expression transitoire (figures 1A et 1B). L&#39;examen du profil d&#39;expression de la protéine de fusion TrCel5A-mCherry révélé feuilles saines (figure 1C), qui a montré l&#39;expression de protéines sous une lumière verte généralisée (figure 1D). Extraction des protéines solubles totales a été ...

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Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Des plants de tabac ont été utilisés pour produire une cellulase fongique, TrCel5A, par l&#39;intermédiaire d&#39;un système d&#39;expression transitoire. L&#39;expression peut être contrôlée en utilisant une protéine de fusion fluorescente, et l&#39;activité de la protéine a été caractérisée post-expression.

Expression de recombinant cellulase Cel5A de<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Dans les usines de tabac

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

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Research

JoVE Journal

Environment

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

12.7K vues.  RWTH Aachen University.  Des plants de tabac ont été utilisés pour produire une cellulase fongique, TrCel5A, par l'intermédiaire d'un système d'expression transitoire. L'expression peut être contrôlée en utilisant une protéine de fusion fluorescente, et l'activité de la protéine a été caractérisée post-expression. 

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Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Transient expression des gènes dans le tabac en utilisant Assemblée Gibson et le Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Recherche

Environnement

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the exploration of renewable resources are necessary to overcome these challenges. Within the multinational framework MultiBioPro we are developing biorefinery pipelines to maximize the use of plant biomass. More specifically, we use poplar and tobacco tree (Nicotiana glauca) as target crop species for improving saccharification, isoprenoid, long chain hydrocarbon contents, fiber quality, and suberin and lignin contents. The methods used to obtain these outputs include GC-MS, LC-MS and RNA sequencing platforms. The metabolite pipelines are well established tools to generate these types of data, but also have the limitations in that only well characterized metabolites can be used. The deep sequencing will allow us to include all transcripts present during the developmental stages of the tobacco tree leaf, but has to be mapped back to the sequence of Nicotiana tabacum. With these set-ups, we aim at a basic understanding for underlying processes and at establishing an industrial framework to exploit the outcomes. In a more long term perspective, we believe that data generated here will provide means for a sustainable biorefinery process using poplar and tobacco tree as raw material. To date the basal level of metabolites in the samples have been analyzed and the protocols utilized are provided in this article.

Plant biomass offers a renewable resource for multiple products, including fuel, feed, food, and a variety of materials. In this paper we investigate the properties of tobacco tree (Nicotiana glauca) and poplar as suitable sources for a biorefinery pipeline.

Transcription et profilage des métabolites pour l&#39;évaluation des arbres tabac et le peuplier comme matière première pour l&#39;industrie de la bioéconomie

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Mesurer les flux d&#39;éléments nutritifs et des substances toxiques minéraux dans les usines avec Traceurs radioactifs

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

L&#39;utilisation de la haute résolution thermographie infrarouge (HRIT) pour l&#39;étude de la glace et de la glace nucléation Propagation dans les plantes

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That represents 100 million tons of food being destroyed or diverted to non-human consumption each year. Aflatoxins are powerful carcinogens normally accumulated by the fungi Aspergillus flavus and A. parasiticus in cereals, nuts, root crops and other agricultural products. Silencing of five aflatoxin-synthesis genes by RNA interference (RNAi) in peanut plants was used to control aflatoxin accumulation following inoculation with A. flavus. Previously, no method existed to analyze the effectiveness of RNAi in individual peanut transgenic events, as these usually produce few seeds, and traditional methods of large field experiments under aflatoxin-conducive conditions were not an option. In the field, the probability of finding naturally contaminated seeds is often 1/100 to 1/1,000. In addition, aflatoxin contamination is not uniformly distributed. Our method uses few seeds per transgenic event, with small pieces processed for real-time PCR (RT-PCR) or small RNA sequencing, and for analysis of aflatoxin accumulation by ultra-performance liquid chromatography (UPLC). RNAi-expressing peanut lines 288-72 and 288-74, showed up to 100% reduction (p&#8804;0.01) in aflatoxin B1 and B2 compared to the control that accumulated up to 14,000 ng.g-1 of aflatoxin B1 when inoculated with aflatoxigenic A. flavus. As reference, the maximum total of aflatoxins allowable for human consumption in the United States is 20 ng.g-1. This protocol describes the application of RNAi-mediated control of aflatoxins in transgenic peanut seeds and methods for its evaluation. We believe that its application in breeding of peanut and other crops will bring rapid advancement in this important area of science, medicine and human nutrition, and will significantly contribute to the international effort to control aflatoxins, and potentially other mycotoxins in major food crops.

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

We demonstrate a method for the analysis of aflatoxins and transgene expression in peanut seeds that contain RNA-interference signals for silencing aflatoxin-synthesis genes in the fungus Aspergillus flavus. RNAi-mediated control of mycotoxins in plants has not been reported previously.

Contrôle des aflatoxines dans les arachides ARNi médiée: méthode pour analyser la production de mycotoxines et Transgene expression dans la Peanut /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystème

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

Enhancement of the Initial Growth Rate of Agricultural Plants by Using Static Magnetic Fields

Electronic devices and high-voltage wires induce magnetic fields. A magnetic field of 1,300-2,500 Gauss (0.2 Tesla) was applied to Petri dishes containing seeds of Garden Balsam (Impatiens balsamina), Mizuna (Brassica rapa var. japonica), Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis), and Mescluns (Lepidium sativum). We applied magnets under the culture dish. During the 4 days of application, we observed that the stem and root length increased. The group subjected to magnetic field treatment (n = 10) showed a 1.4 times faster rate of growth compared with the control group (n = 11) in a total of 8 days (p &#60;0.0005). This rate is 20% higher than that reported in previous studies. The tubulin complex lines did not have connecting points, but connecting points occur upon the application of magnets. This shows complete difference from the control, which means abnormal arrangements. However, the exact cause remains unclear. These results of growth enhancement of applying magnets suggest that it is possible to enhance the growth rate, increase productivity, or control the speed of germination of plants by applying static magnetic fields. Also, magnetic fields can cause physiological changes in plant cells and can induce growth. Therefore, stimulation with a magnetic field can have possible effects that are similar to those of chemical fertilizers, which means that the use of fertilizers can be avoided.

The goal of this protocol is to demonstrate the acceleration of the initial growth rate of plants by applying static magnetic fields with no external energy.

Amélioration du taux de croissance initiale des plantes agricoles à l&#39;aide de champs magnétiques statiques

Electronic devices and high-voltage wires induce magnetic fields. A magnetic field of 1,300-2,500 Gauss (0.2 Tesla) was applied to Petri dishes containing ...

Assessment of Methane and Nitrous Oxide Fluxes from Paddy Field by Means of Static Closed Chambers Maintaining Plants Within Headspace

This protocol describes the measurement of greenhouse gas (GHG) emissions from paddy soils using the static closed chamber technique. This method is based on the diffusion theory. A known volume of air overlaying a defined soil area is enclosed within a parallelepiped cover (named &#34;chamber&#34;), for a defined period of time. During this enclosure period, gases (methane (CH4) and nitrous oxide (N2O)) move from soil pore air near their microbial source (i.e., methanogens, nitrifiers, denitrifiers) to the chamber headspace, following a natural concentration gradient. Fluxes are then estimated from chamber headspace concentration variations sampled at regular intervals throughout the enclosure and then analyzed with gas chromatography. Among the techniques available for GHG measurement, the static closed chamber method is suitable for plot experiments, as it does not require large homogenously treated soil areas. Furthermore, it is manageable with limited resources and can identify relationships among ecosystem properties, processes, and fluxes, especially when combined with GHG driving force measurements. Nevertheless, with respect to the micrometeorological method, it causes a minimal but still unavoidable soil disturbance, and allows a minor temporal resolution. Several phases are key to the method implementation: i) chamber design and deployment, ii) sample handling and analyses, and iii) flux estimation. Technique implementation success in paddy fields demands adjustments for field flooding during much of the cropping cycle, and for rice plant maintenance within the chamber headspace during measurements. Therefore, the additional elements to be considered with respect to the usual application of non-flooded agricultural soils consist of devices for: i) avoiding any unintended water disturbance that could overestimate fluxes, and ii) including rice plants within the chamber headspace to fully consider gases emitted through aerenchyma transportation.

The overall goal of this protocol is to measure greenhouse gas emissions from paddy fields using the static closed chamber technique. The measurement system needs specific adjustments due to the presence of both a permanent water layer in the field and of the plants within the chamber headspace.

Évaluation de méthane et de protoxyde d’azote flux de rizière au moyen de la statique fermé Chambers maintenir les plantes dans l’espace de tête

This protocol describes the measurement of greenhouse gas (GHG) emissions from paddy soils using the static closed chamber technique. This method is based ...

Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast make 2-dimensions (2D) infrared images somewhat difficult to interpret. Viewing an IR image or the video of plants freezing in 3 dimensions (3D) would allow a more accurate identification of sites for ice nucleation as well as the progression of freezing. In this paper, we demonstrate a relatively simple means to produce a 3D infrared video of a strawberry plant freezing. Strawberry is an economically important crop that is subjected to unexpected spring freeze events in many areas of the world. An accurate understanding of the freezing in strawberry will provide both breeders and growers with more economical ways to prevent any damage to plants during freezing conditions.
The technique involves a positioning of two IR cameras at slightly different angles to film the strawberry freezing. The two video streams will be precisely synchronized using a screen capture software that records both cameras simultaneously. The recordings will then be imported into the imaging software and processed using an anaglyph technique. Using red-blue glasses, the 3D video will make it easier to determine the precise site of ice nucleation on leaf surfaces.

Here, we present a protocol to image a strawberry plant freezing in 3 dimensions. Two infrared cameras positioned at slightly different angles are used to produce a red-blue anaglyph video to observe the freezing of the plant in 3 dimensions.

Protocole de fabrication en trois dimensions vidéo infrarouge de gel dans les plantes

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many countries around the world. Severe yield losses are caused by direct feeding, and even more importantly, also by the transmission of more than 100 harmful plant pathogenic viruses. As for other invasive pests, increased international trade facilitates the dispersal of B. tabaci to areas beyond its native range. Inspections of plant import products at points of entry such as seaports and airports are, therefore, seen as an important prevention measure. However, this last line of defense against pest invasions is only effective if rapid identification methods for suspicious insect specimens are readily available. Because the morphological differentiation between the regulated B. tabaci and close relatives without quarantine status is difficult for non-taxonomists, a rapid molecular identification assay based on the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology has been developed. This publication reports the detailed protocol of the novel assay describing rapid DNA extraction, set-up of the LAMP reaction, as well as interpretation of its read-out, which allows identifying B. tabaci specimens within one hour. Compared to existing protocols for the detection of specific B. tabaci biotypes, the developed method targets the whole B. tabaci species complex in one assay. Moreover the assay is designed to be applied on-site by plant health inspectors with minimal laboratory training directly at points of entry. Thorough validation performed under laboratory and on-site conditions demonstrates that the reported LAMP assay is a rapid and reliable identification tool, improving the management of B. tabaci.

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

This paper reports the protocol for a rapid identification assay for Bemisia tabaci based on loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology. The protocol requires minimal laboratory training and can, therefore, be implemented on-site at points of entry for plant imports such as seaports and airports.

Un test d’Amplification isotherme (lampe) médiée par la boucle pour une Identification rapide de Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more streamlined herbivory protocols. Perturbations of chewing insects are usually studied in whole plant systems. While this whole organism strategy is popular, it is not necessary if similar observations can be replicated in a single detached leaf. The assumption is that basic elements required for signal transduction are present within the leaf itself. In the case of early events in signal transduction, cells need only to receive the signal from the perturbation and transmit that signal to neighboring cells which are assayed for gene expression.
The proposed method simply changes the timing of the detachment. In whole plant experiments, larvae are confined to a single leaf which is eventually detached from the plant and assayed for gene expression. If the order of excision is reversed, from last in whole plant studies, to first in the detached study, the feeding experiment is simplified.
Solanum tuberosum var. Kennebec is propagated by nodal transfer in a simple tissue culture medium and transferred to soil for further growth if desired. Leaves are excised from the parent plant and relocated to Petri dishes where the feeding assay is conducted with the larval stages of M. sexta. Damaged leaf tissue is assayed for the expression of relatively early events in signal transduction. Gene expression analysis identified infestation-specific Cys2-His2 (C2H2) transcription factors, confirming the success of using detached leaves in early response studies. The method is easier to perform than whole plant infestations and uses less space.

The presented method creates natural herbivore damaged plant tissue through the application of Manduca sexta larvae to detached leaves of potato. The plant tissue is assayed for expression of six transcription factor homologs involved in early responses to insect herbivory.

Des essais de feuilles détachées pour simplifier les études sur l'expression génique de la pomme de terre pendant l'infestation par l'insecte à mâcher Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...