L’objectif global de cette procédure, est expliqué l’utilisation du cisplatine comme agent néphroxique chez les poissons zèbres adultes, l’analyse de l’inflammation, et la mort cellulaire dans le tissu rénal. Pour ce faire, le poisson zèbre adulte est anesthésié et pesé pour injecter une dose spécifique de cisplatine dans la cavité péritonéale. Après surveillance de la mortalité, le rein est disséqué et les cellules sont isolées pour la cytométrie du débit ou fixes et disséquées pour être analysées par analyse fluorescente TUNEL.
Les procédures suivantes peuvent aider à répondre aux questions clés dans le domaine rénal en utilisant les effets néphroxiques du cisplatine comme un outil pour développer un modèle aigu de lésion rénale et de poisson zèbre adulte. Ce modèle peut être utilisé pour l’exploration de nouvelles cibles thérapeutiques dans la protection rénale, ainsi que d’élucider le mécanisme de régénération dans le rein du poisson zèbre. Le cisplatine est un agent chimiothérapiothérapiothéraptique utilisé pour traiter une variété de cancer.
Cependant, peut facilement s’accumuler dans le rein, générant la mort cellulaire, l’inflammation, et diminuer la fonction rénale. L’effet du cisplatine dépend de la dose, de sorte que vous pouvez réduire notre augmentation du dosage dépendent de vos objectifs. Les techniques utilisées ici pour analyser l’inflammation et la mort cellulaire ne sont pas exclusivement pour la diffusion du modèle de la maladie.
La cytométrie d’écoulement chez les poissons zèbres peut aider à élucider les états inflammatoires de l’animal d’une manière quantitative, tandis qu’à TUNEL nous disons peut clarifier la présence des cellules poptosed dans les contextes physiologiques et pathologiques. Avant de commencer l’expérience, préparer la solution de travail cisplatine en diluant la solution de stock à 820 microgrammes par mil en chlorure de sodium à 0,9 %. Ensuite, anesthésier un autre poisson zèbre et sécher l’excès d’eau sur des serviettes en papier.
Pesez le poisson en le plaçant sur une balance, en prenant note du poids. Faites les calculs pour connaître le volume exact à injecter. Pour obtenir la dose de 120 microgrammes par gramme de poids, utilisez la formule suivante.
Divisez la dose finale par la dose de la solution de travail et convertissez ce nombre en microlitres, en multipliant pendant 1000 pour obtenir le volume de 120 microgrammes de cisplatine. Ensuite, multipliez ce nombre par le poids du poisson pour obtenir le volume final à injecter. Déposer un poisson sur une éponge humide, avec une petite tasse pour le tenir.
Avec le côté ventral vers le haut et remplir une seringue d’insuline avec un volume calculé de cisplatine. Insérez l’aiguille sur la ligne médiane ventrale dans un angle peu profond, en tirant doucement la paroi ventrale vers le haut pour éviter de percer les organes internes. Et puis injecter la solution.
Après l’injection, placez un poisson dans un réservoir pour récupérer de l’anesthésie, et attendez les signes de rétablissement tels que la natation et les mouvements appropriés. Surveillez les poissons deux fois par jour pendant les prochains jours. À cette dose, le cisplatine induit environ 30% de mortalité sur les premières 24 heures.
Euthanasier le poisson et sécher l’excès d’eau dans une serviette en papier. Après avoir enlevé la tête et les organes internes, utilisez des aiguilles de dissection pour épingler les parois du corps. Localiser le rein dans la paroi dorsale du poisson, et utiliser des forceps pour détacher le rein.
Placez le rein dans une assiette de six puits avec une solution fraîche d’un 1X PBS, 2%FBS et garder sur la glace. Ensuite, ramasser le tissu avec un peu de liquide et le passer à travers une passoire cellulaire de 40 microns, et macérer doucement le tissu avec un piston seringue. Lavez-le deux fois avec un 1X PBS, 2%FBS.
Et recueillir les cellules dans un tube de faucon de 50 mils. Puis centrifugeuse pendant cinq minutes à 400 G.Attention ramasser le supernatant avec une pipette et le jeter. Ajouter 500 microlitres de 1X PBS froid pour re-suspendre les cellules et les placer dans un tube de cytométrie d’écoulement de cinq mils.
Gardez-les sur la glace. Prenez 10 microlitres de l’échantillon et mélangez-le avec 90 microlitres de bleu trypan dans un tube d’Eppendorf. Ajouter 10 microlitres du mélange dans une chambre Neobauer et compter les cellules au microscope.
Prenez les cellules pour être lues par un cytomètre, puis analyser les résultats en sélectionnant la population de vos intérêts. Pour cette procédure, euthanasier un poisson et enlever les organes internes laissant le rein attaché au corps. Ensuite, épinglez les parois du corps sur une surface de liège et placez-la progressivement vers le bas sur la solution de fixation.
Gardez-le à quatre degrés pendant la nuit. Le lendemain, disséquer le rein avec forcep fine. Essayez de ne pas le perturber.
Placez-le dans une petite boîte de Pétri ou un tube Eppendorf avec 1X PBS à rincer. Changer le PBS et préparer 2% agarose pour générer une matrice de soutien pour le rein avant qu’ils ne se produisent solidement. Jeter tous les PBS restants et verser l’agarose lentement.
Ensuite, placez le rein avec des forceps fins pour l’empêcher de se coucher. Laisser l’agarose se solidifier à température ambiante. Après solidification agarose, utiliser un scalpel pour couper Agarose autour des reins formant un petit cubes.
Placez les cubes d’agarose à l’intérieur d’une cassette histologique et envoyez-le pour le traitement histologique pour intégrer le tissu dans la paraffine. Les blocs de paraffine, nous allons ensuite couper en cinq sections d’épaisseur microns. De-wax glisse et les garder dans de l’eau distillée.
Préparer une chambre d’incubateur sombre, en mettant des serviettes en papier humide au fond. Placez les glissières dans la chambre noire et ajoutez proteinase K pour la perméabilisation du tissu. Incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.
Pendant que les échantillons sont incubés, préparer le mélange de réaction TUNEL, en ajoutant 50 microlitres de solution enzymatique sur 450 microlitres de solution d’étiquette. Et protégez-vous de la lumière. Ramasser la chambre noire et laver la tranche deux fois avec un 1X PBS.
Ensuite, séchez les glissières et sur le mélange de réaction TUNEL. Et incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Après l’incubation, lavez à nouveau ces diapositives avec un 1X PBS.
Et ajouter DAPI pour les taches compteur de noyaux. Incubation à température ambiante pendant cinq minutes, à l’abri de la lumière. Rincer trois fois avec un 1X PBS.
Et puis, mouler les diapositives avec un milieu hydrophilique anti-fondu. Placez un bordereau de couverture. Et sceller avec du vernis à ongles.
Visualisez les échantillons au microscope fluorescent. Dans ce graphique, il est possible de voir que le cisplatine a un effet de réponse de dose sur la survie des poissons, comparé à un contrôle injecté seulement avec 0,9% de chlorure de sodium. La ligne rouge de ce graphique représente une dose de 120 microgrammes par gramme utilisé dans cette vidéo.
Ces doses peuvent être appliquées aux mâles et aux femelles, car aucune différence statistique n’a été trouvée entre eux. La cytométrie d’écoulement permet de quantifier les différentes cellules présentes dans un tissu. Les populations de cellules hématopoïétiques sont identifiées dans le rein de plusieurs poissons par la taille ou la dispersion vers l’avant et la granularité ou la dispersion de taille.
De cette façon, il est possible de séparer les populations dans les érythrocytes, les lymphocytes, les granulocytes et les précurseurs hématopoïétiques. Ici, la stratégie actuelle de sélection des granulocytes, des singlets et des cellules positives MPO permet de trouver la population des neutrophiles dans le rein marquée par l’expression de fluorescence de la myeloperoxidase. Dans ce cas, l’injection de cisplatine a induit l’augmentation du pourcentage de neutrophiles présents dans le rein.
L’analyse TUNEL permet de détecter les cellules apoptotiques dans un tissu en observant la glissade tissulaire du rein par un microscope à fluorescence, il est possible de voir le signal apoptotique à l’intérieur des noyaux de certaines cellules, ici en rouge. Contrasté par une tache nucléaire dans un tel DAPI ici en bleu. L’injection de cisplatine a augmenté la présence de cellules apoptotiques dans le rein, qui sont possibles de quantifier manuellement ou à l’aide d’un logiciel d’image.
À la fin de cette vidéo, vous devriez être en mesure de savoir comment injecter et ajuster la dose de cisplatine pour induire des lésions rénales aiguës chez les poissons zèbres adultes. Et comment disséquer le rein à des fins différentes. La cytométrie du flux est un excellent outil qui vous aidera à comprendre le profil des différents types de cellules dépendant de la disponibilité des lignées tragenclaves dans votre laboratoire.
N’oubliez pas de considérer la couleur des lignes de transporteurs si vous voulez utiliser des anticorps pour étiqueter tous leurs types de cellules. L’analyse TUNEL est un outil simple qui nous permet de détecter les cellules et les tissus apoptotiques, et peut être analysé non seulement par microscopie, mais aussi par cytométrie de flux. N’oubliez pas, toujours utiliser de l’équipement de protection individuelle pendant toute la procédure.
