This work was supported by NIH grant F32DK091998 to CNK; NIH grant RO1DK041071 and Harvard Stem Cell Institute grant D001229 to IAD. The authors thank Neil Hukriede for the lhx1ain situ probe.

Déclaration de l&#39;éthique: NOTE: Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux lignes directrices de l&#39;Hôpital général du Massachusetts pour l&#39;utilisation des animaux dans la recherche. 1. Préparation à l&#39;avance <ol><li> Déterminer combien de poisson zèbre adulte 6-12 mois de blesser. Régime de blesser 10-20% plus de poissons que sera nécessaire. Afin de minimiser la variabilité, l&#39;utilisation appariés pour l&#39;âge des poissons frère élevés ensemble dans le même réservoir de sorte qu&#39;ils sont à peu près la même taille et ont moins de variabilité génétique. Poissons femelles sont beaucoup plus faciles à injecter par rapport au poisson mâle, en raison de la plus grande capacité de l&#39;abdomen. Cependant, les mâles et les femelles donnent des résultats similaires. </li><li> Quand vous faites l&#39;expérience pour la première fois, tracer une courbe de dose pour déterminer le dosage approprié pour la gentamicine une souche spécifique de poissons. Testez chaque nouveau lot de gentamicine avant utilisation dans des expériences depuis la pureté de la gentamicine varie d&#39;un lot à. Un dosage correct devrait être déterminée en évaluant expressisur des marqueurs de préjudice tels que lhx1a. (Voir Figure 1A - D). </li><li> Préparer la solution de gentamicine. Solution stock gentamicine peut être stocké dans -20 ° C et décongelé pour un usage ultérieur. Par exemple, pour une dose de 80 mg / kg (80 mg de gentamicine / kg de poids corporel) dans un poisson pesant 0,5 g, préparer 2 mg / ml de gentamicine dans du sérum physiologique tamponné avec un phosphate en tant que solution de travail pratique. Ceci permet d&#39;obtenir une 20 ul de gentamicine pour injection intra-péritonéale dans le poisson. NOTE: En général, 80 à 120 mg / kg obtenir de bons résultats, mais des doses aussi faibles que 40 mg / kg peut être appropriée. Gentamicine peut également être acheté dans une solution pour minimiser l&#39;exposition dangereux pour le personnel de laboratoire. NOTE: gentamicine à fortes doses peut être toxique. Portez des gants et un masque lors de la pesée de poudre. </li><li> Préparez 100 ml de 0,016% d&#39;eau de tricaïne pour anesthésier les poissons. Préparer un 25x bilan de tricaïne (4 g / 1 L) dissous dans de l&#39;eau milliQ stérile ajuster le pH à 7 et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. Diluer 4 ml dans 100 ml d&#39;eau du poisson pour une concentration de travail de 0,016%. NOTE: tricaïne est un anesthésique et la peau irritant, porter des gants lors de la manipulation. </li><li> Faire un poisson évider d&#39;une pipette de transfert en plastique en coupant la poire en forme de cuillère et couper 2 fentes dans le fond pour drainer l&#39;eau. Seringues charge de 1 ml (avec 10 gradations pi) avec la solution de gentamicine prêts et attachent une aiguille 30½ G. Retirer les bulles d&#39;air. Twist l&#39;aiguille sur la seringue pour vous assurer que la pointe est inclinée sur l&#39;aiguille est confrontée suite et les graduations de la seringue sont tourné vers l&#39;avant et lisible. Pour les injections de contrôle, préparer une seringue et une aiguille avec du PBS stérile. </li><li> Préparer une échelle avec une surface propre ou peser bateau ainsi que des serviettes en papier pour sécher le poisson et pour la tenue de poissons pour l&#39;injection. </li><li> Préparer des petits contenants individuels demi-litre avec des couvercles pour la tenue de poissons pour l&#39;injection du poste d&#39;observation pendant la nuit. Les petites cages transparentes en matière plastique d&#39;accouplement sont utiles à cet effet. Cesrécipients ne doit pas être blanc - idéalement, ils devraient être claires afin que les moulages blancs épithéliales versées par les poissons peuvent être observés sur une paillasse noire. Remplir chaque récipient avec de l&#39;eau de poissons suffisant pour le poisson à nager confortablement. </li></ol> 2. injection intrapéritonéale de gentamicine <ol><li> Anesthésier le poisson dans une solution de tricaïne 0,016% dans l&#39;eau du poisson. Attendez que le taux de ventilation des branchies à ralentir et que le poisson ne plus répondre au toucher. </li><li> Ramasser le poisson en utilisant le scoop de poisson, le déplacement de la tête vers la queue afin d&#39;éviter de blesser les branchies ou les nageoires. Placez le poisson sur des serviettes en papier pour absorber l&#39;excès d&#39;eau en tournant le poisson doucement sur le côté et secouer l&#39;excès d&#39;eau scoop. </li><li> Ramasser le poisson à nouveau et le placer dans le bateau peser sur l&#39;échelle mise à zéro et peser le poisson. Ronde à l&#39;0,25 g près, et de calculer la quantité appropriée de la gentamicine à injecter. NOTE: Pour un poisson de 0,5 g utiliser une injection de 20 pi à 80 mg / kg dose. </li><li> Ramasser le poisson à nouveau et le placer sur une serviette en papier pliée sec. Si l&#39;injection de la main droite, maintenez la serviette en papier dans la main gauche et placez la tête du poisson pointant vers la gauche, avec le ventre facilement accessible. </li><li> Tenez la seringue avec l&#39;aiguille à un angle à la peau du ventre, antérieure à l&#39;cloaque 45 °. Enfoncez l&#39;aiguille juste sous la peau, puis diminuer l&#39;angle et faites glisser l&#39;aiguille de l&#39;avant sous la peau, en évitant les organes internes. Appuyez sur le piston de la quantité appropriée, une pause pour faire en sorte qu&#39;aucun liquide ne sort autour de l&#39;aiguille, puis retirer l&#39;aiguille. Si la tenue régulière le poisson est un problème, bretelles coudes contre votre buste pour les stabiliser. NOTE: Porter des gants lors de la manipulation solution de gentamicine. </li><li> Déposez chaque poisson dans un conteneur individuel. Observer les poissons et assurer sa récupération de l&#39;anesthésie. Gardez poissons à 28,5 ° C pendant la nuit. NOTE: Si le poisson ne rétablit pas immédiatement, utiliser un plastique transfer pipette pour irriguer l&#39;eau à travers ses branchies pour la faire revivre. </li><li> Utilisez la même seringue et l&#39;aiguille lors de l&#39;injection multiple poisson avec la même dose de gentamicine. Jetez la seringue et l&#39;aiguille dans le container approprié approprié. </li></ol> 3. Poster Injection Observation des blessures <ol><li> Le lendemain (blessure de poste 1 jour), placer le poisson injecté dans son conteneur sur une surface sombre. Moulages blancs de morts tissu épithélial excrété par les poissons blessés doivent être visibles. (Voir la figure 1E - H). Si il n&#39;y a pas des moulages, soit le poisson n&#39;a pas été blessé par l&#39;injection de gentamicine (soit la dose était trop faible, ou une partie de la gentamicine fuite pendant le processus d&#39;injection) ou le poisson a été grièvement blessé entraînant un blocage complet des uretères et cloaque avec le tissu muées. NOTE: Si le poisson est incapable de dégager les moulages de son corps, il meurent habituellement dans les 2-3 jours et est donc inutilisable pour plusdosages. Si aucun moulages sont visibles, euthanasier les poissons dans l&#39;eau de tricaïne par immersion pendant au moins 10 min après le mouvement des branchies arrête. </li><li> Si moulages de tissus blancs sont visibles, mis le poisson de côté et continuer à vérifier les autres poissons. Une dose appropriée de la gentamicine se traduira par 80-90% des poissons étant utilisable. Mutualiser les poissons blessés et ensuite les diviser en différents groupes de traitement, si désiré. </li></ol> 4. Soins de poisson Récupération <ol><li> Gardez le poisson dans l&#39;eau propre et l&#39;environnement peu fréquentée. L&#39;eau sale et le surpeuplement vont conduire à des infections et de décès non intentionnel. Essayez de garder pas plus de 6 poissons / 500 ml d&#39;eau de poissons et de changer l&#39;eau tous les jours si possible. NOTE: Ceci est un volume minimal pour la conservation de l&#39;espace ou si l&#39;enquêteur souhaite réaliser des expériences à l&#39;aide de traitements médicamenteux coûteux. </li><li> Ne pas nourrir le poisson jusqu&#39;à 3 jours après la blessure. Récupération poissons ne mangent pas au premier abord, et de toute la nourriture dans le réservoir se décomposent et promouvoir bactéries growth. À partir de 3 jours après la lésion, nourrir une petite quantité une fois par jour. </li></ol> 5. Analyse des blessés reins <ol><li> Pour l&#39;hybridation in situ pour l&#39;expression de l&#39;ARNm lhx1a, les reins peuvent être récoltées à partir de poissons à timepoints souhaités. Euthanasier les poissons dans l&#39;eau tricaïne sur la glace au moins 10 min jusqu&#39;à ce que le mouvement des branchies arrête, puis retirez la tête avec une lame de rasoir et d&#39;ouvrir la cavité du corps et enlever les organes internes avec une pince. </li><li> Laissez le rein en place (orgue pigmentée fixé à la paroi dorsale du corps) et fixer le poisson dans 4% de paraformaldehyde dans PBS pendant une nuit. Disséquer le rein 15 et continuer avec la norme hybridation in situ. <ol><li> En bref, les reins laver dans du PBST (tampon phosphate salin à 0,5% de Tween 20), perméabilisées avec de la proteinase K dans du PBST (10 ug / ml) pendant 1 heure à température ambiante. Post-fixer avec 4% de paraformaldehyde, et lavé de nouveau avec du PBST. </li><li> Ensuite pré-hybrider les reins jusqu&#39;au lendemain à 68; ° C dans du tampon d&#39;hybridation (50% formamide, 5x SSC, 50 pg / ml d&#39;héparine, 500 ug / ml d&#39;ARNt, 0,1% de Tween 20, pH 6,0). </li><li> Incuber les échantillons avec de la digoxigénine marqué la sonde dans un tampon d&#39;hybridation, puis laver pendant 5-10 min chacun avec 100%, 75%, 50%, tampon d&#39;hybridation de 25% à 68 ° C, puis transféré à la température ambiante et laver deux fois pendant 30 min avec 2x SSC avec 0,1% de Tween 20, et laver deux fois pendant 30 min avec 0,2x SSC avec 0,1% de Tween 20. </li><li> Équilibrer l&#39;échantillon 3x 5 min dans MAB (0,1 M d&#39;acide maléique, 0,15 M de NaCl, pH 7,5) et bloquées pendant une nuit à 4 ° C dans du MAB avec du sérum de chèvre à 10%. Puis incuber pendant la nuit dans des échantillons anti-digoxigénine-AP Fab 1: 5000 dans MAB. </li><li> Laver l&#39;échantillon 5x pendant 1 heure dans MAB, 3x et équilibrer pendant 15 minutes dans NTMT (0,1 M de Tris pH 9,5, 0,05 M de MgCl2, 0,01 M de NaCl, 50 pi de Tween 20). </li><li> Traitez ensuite les reins avec NBT / BCIP pour détecter le signal. Fixer les reins, avec 4% de paraformaldehyde et incubé dans le diméthylformamide à Remove excès de NBT / BCIP, blanchie pendant la nuit dans de l&#39;eau déminéralisée. Laver les reins, puis photographier en PBS avec 50% de glycérol sous une lamelle. </li></ol></li></ol>

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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470, 95-100 (2011).</li><li>Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+mechanism+of+aminoglycoside+nephrotoxicity:+an+integrative+point+of+view.">New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view.</a> Kidney Int. 79, 33-45 (2011).</li><li>Hentschel, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+in+zebrafish:+a+novel+system+to+study+a+complex+disease.">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288, F923-F929 (2005).</li><li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+adult+zebrafish+kidney.">Dissection of the adult zebrafish kidney.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Fogazzi, G. B., Cameron, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+microscopy+from+the+seventeenth+century+to+the+present+day.">Urinary microscopy from the seventeenth century to the present day.</a> Kidney Int. 50, 1058-1068 (1996).</li><li>Nachtrab, G., Czerwinski, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexually+dimorphic+fin+regeneration+in+zebrafish+controlled+by+androgen/GSK3+signaling.">Sexually dimorphic fin regeneration in zebrafish controlled by androgen/GSK3 signaling.</a> Curr Biol. 21, 1912-1917 (2011).</li><li>Zhou, W., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+podocyte+injury+and+proteinuria+in+transgenic+zebrafish.">Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 23, 1039-1047 (2012).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+model+of+conditional+targeted+podocyte+ablation+and+regeneration.">A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration.</a> Kidney Int. 83, 1193-1200 (2013).</li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

Le poisson zèbre est idéal pour étudier la régénération des organes adultes, y compris l&#39;adulte rénale mésonéphrique 6. Des études récentes ont profité de marqueurs moléculaires et de nouvelles lignes rapporteurs transgénique afin de mieux caractériser les étapes qui se produisent pendant néphrons régénération et ce que les cellules pourraient être responsables 7,12. Observation des cylindres urinaires a été utilisé pendant plus d&#39;un siècle pour diagnostiquer les ma...

Le rein est essentiel pour l&#39;homéostasie du fluide, la régulation de la pression artérielle et la filtration des déchets de l&#39;organisme. Bien que les mammifères sont capables de réparer néphrons existantes après une blessure en utilisant des cellules épithéliales différenciées 1-4, ils semblent manquer d&#39;un pool de cellules souches réservés 5 et sont incapables de former de nouveaux néphrons de novo. Contrairement aux mammifères, les poissons adultes sont capables de former de nouveaux néphrons long de la vie adulte pour soutenir la croissance des poissons et en réponse à une blessure 6,7. Le poisson zèbre, Danio rerio, est un organisme modèle inestimable pour l&#39;étude de la régénération d&#39;organes 8-10 et a le potentiel de fournir un aperçu puissants dans les applications pour l&#39;ingénierie de la réparation des reins humains. La Tg (Lhx1a: EGFP) 11 transgène a été montré pour étiqueter un pool de cellules progénitrices néphron dans le rein adulte de poisson zèbre 12, cependant mécanismes contrôlant la réponse des cellules à lhx1a + r blessureEmain claire. La gentamicine est un antibiotique aminoglycoside largement utilisé avec des effets néphrotoxiques et ototoxiques connus chez l&#39;homme 13. L&#39;injection intrapéritonéale de la gentamicine est une méthode établie d&#39;induire lésion rénale aiguë chez les poissons 6. Cette blessure dans les synoptiques de poissons de la perte de l&#39;épithélium tubulaire et la cicatrisation des glomérules qui se produit chez l&#39;homme après la gentamicine 14 surdosage. Induire des blessures chez le poisson zèbre par injection de gentamicine est un moyen pratique d&#39;induire une réponse forte de régénération, synchrone, avec de nombreux nouveaux produits et néphrons procéder simultanément à travers les étapes de la formation, de la prolifération et de la différenciation. Ce protocole détaille notre méthode de blessure robuste et reproductible chez l&#39;adulte poisson zèbre rein en utilisant un processus visuel non invasif de dépistage pour réduire au minimum les valeurs aberrantes. Nous profitons du fait que des blessures avec la gentamicine conduit à la mort du tissu rénal épithéliale et le formation de moulages tubulaires rénales, qui accumulent alors en masses dans les conduits et mésonéphriques cloaque. Ceux-ci sont transmises par les poissons et peuvent être observés visuellement dans l&#39;eau. Cela nous permet de l&#39;écran pour le poisson avec une forte blessure non mortelle, qui peut ensuite être mis en commun pour plus d&#39;expérimentation. Minimiser le nombre de poissons indemne ou poissons qui meurent avant d&#39;atteindre le critère d&#39;évaluation de l&#39;expérience conduit à plus uniforme et la collecte de données et une analyse efficaces. En outre, aucun des dispositifs spéciaux ou de réactifs sont nécessaires, ce qui rend cette méthode rentable et appropriée pour une utilisation dans un cadre universitaire ou de l&#39;enseignement. Grâce à notre méthode, nous montrons ici les effets croissants de dose de gentamicine sur régénération rénale ainsi que l&#39;effet de l&#39;augmentation de la température.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:101px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:291px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gentamicin sodium sulfate</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1264</td>
			<td>TOXIC, purity varies from batch to batch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">plastic transfer pipets</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1 ml Norm-Ject syringes</td>
			<td style="width:101px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">72520</td>
			<td>green plastic syringes, ordinary 1ml syringes are OK, but harder to read accurately</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">30G1/2 needles</td>
			<td style="width:101px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5040</td>
			<td>IRRITANT</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:101px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15710</td>
			<td>Make 4% in 1xPBS for working solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kidney regeneration in adult zebrafish by gentamicin induced injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Blessures gentamicine peut être confirmé visuellement par l&#39;observation des moulages épithéliales rénales dans l&#39;eau (Figure 1). Différentes doses de gentamicine ont été utilisés pour blesser adultes de type sauvage TuAB poisson zèbre, résultant du nombre de lhx1a + agrégats cellulaires dans le rein régénérant (Figure 1A - D) augmentant. Moulages blancs peuvent facilement être vu dans l&#39;eau un jour après une blessure (figure...

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Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Régénération rénale à l&#39;âge adulte poisson zèbre par gentamicine blessures induites

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K vues.  Massachusetts General Hospital. Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons. 

Vidéo: Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Blessure mécanique des bateaux dans embryons de poissons zèbres

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

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Biologie du développement

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or biliary-driven liver regeneration. In hepatocyte-driven liver regeneration, regenerating hepatocytes are derived from preexisting hepatocytes, whereas, in biliary-driven regeneration, regenerating hepatocytes are derived from biliary epithelial cells (BECs). For hepatocyte-driven liver regeneration, there are excellent rodent models that have significantly contributed to the current understanding of liver regeneration. However, no such rodent model exists for biliary-driven liver regeneration. We recently reported on a zebrafish liver injury model in which BECs extensively give rise to hepatocytes upon severe hepatocyte loss. In this model, hepatocytes are specifically ablated by a pharmacogenetic means. Here we present in detail the methods to ablate hepatocytes and to analyze the BEC-driven liver regeneration process. This hepatocyte-specific ablation model can be further used to discover the underlying molecular and cellular mechanisms of biliary-driven liver regeneration. Moreover, these methods can be applied to chemical screens to identify small molecules that augment or suppress liver regeneration.

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Ablation spécifique des hépatocytes chez le poisson zèbre pour étudier conduit biliaire-Régénération hépatique

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Développement d&#39;un fibrotique du foie Modèle induite de l&#39;éthanol en Zebrafish pour étudier de cellules souches médiée hépatocytes Régénération

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

Culture des adultes Zebrafish Retinal explants Transgenic pour des cellules vivantes par imagerie multiphotonique Microscopie

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Approche précise de l&#39;ablation cellulaire pour la modélisation des lésions rénales aiguës dans le développement du poisson zèbre

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related morbidity and mortality and affects more than 2 million people in the United States. A better understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying alcohol-induced liver injury is crucial for developing effective treatment for ALD. Zebrafish larvae exhibit hepatic steatosis and fibrogenesis after just 24 h of exposure to 2% ethanol, making them useful for the study of acute alcoholic liver injury. This work describes the procedure for acute ethanol treatment in zebrafish larvae and shows that it causes steatosis and swelling of the hepatic blood vessels. A detailed protocol for Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) staining that is optimized for the histological analysis of the zebrafish larval liver, is also described. H&#38;E staining has several unique advantages over immunofluorescence, as it marks all liver cells and extracellular components simultaneously and can readily detect hepatic injury, such as steatosis and fibrosis. Given the increasing usage of zebrafish in modeling toxin and virus-induced liver injury, as well as inherited liver diseases, this protocol serves as a reference for the histological analyses performed in all these studies.

This protocol describes histological analyses of the livers from zebrafish larvae that have been treated with 2% ethanol for 24 h. Such acute ethanol treatment results in hepatic steatosis and swelling of the hepatic vasculature.

Analyses histologiques de lésions hépatiques alcooliques aiguës dans le poisson zébré

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Une méthode simple et efficace d’isoler des kératinocytes humains primaires provenant de tissus de la peau adulte

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart after apex resection or cryoinjury, making it an important model organism for heart regeneration study. However, the lack of loss-of-function methods for adult organs has restricted insights into the mechanisms underlying heart regeneration. RNA interference via different delivery systems is a powerful tool for silencing genes in mammalian cells and model organisms. We have previously reported that siRNA-encapsulated nanoparticles successfully enter cells and result in a remarkable gene-specific knockdown in the regenerating adult zebrafish heart. Here, we present a simple, rapid, and efficient protocol for the dendrimer-mediated siRNA delivery and gene-silencing in the regenerating adult zebrafish heart. This method provides an alternative approach for determining gene functions in adult organs in zebrafish and can be extended to other model organisms as well.

It remains a major challenge to develop conditional gene-knockout or effective gene-knockdown in adult zebrafish organs. Here we report a protocol for performing nanoparticle-mediated siRNA gene-silencing in adult zebrafish heart, thus providing a new loss-of-function method for studying adult organs in zebrafish and other model organisms.

SiRNA de nanoparticule-mediated Gene silencing coeur de poisson-zèbre adulte

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Modèles de lésion du poisson-zèbre adulte pour étudier les effets de la Prednisolone dans la régénération de tissu osseux

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its permeability, thereby allowing different molecules to be introduced to the cell. In this paper, electroporation is used to introduce plasmids to ependymoglial cells, which line the ventricular zone of the adult zebrafish telencephalon. A fraction of these cells shows stem cell properties and generates new neurons in the zebrafish brain; therefore, studying their behavior is essential to determine their roles in neurogenesis and regeneration. The introduction of plasmids via electroporation enables long-term labeling and tracking of a single ependymoglial cell. Furthermore, plasmids such as Cre recombinase or Cas9 can be delivered to single ependymoglial cells, which enables gene recombination or gene editing and provides a unique opportunity to assess the cell&#8217;s autonomous gene function in a controlled, natural environment. Finally, this detailed, step-by-step electroporation protocol is used to obtain successful introduction of plasmids into a large number of single ependymoglial cells.

Presented here is an electroporation method for plasmid DNA delivery and ependymoglial cell labeling in the adult zebrafish telencephalon. This protocol is a quick and efficient method to visualize and trace individual ependymoglial cells and opens up new possibilities to apply electroporation to a broad range of genetic manipulations.

Méthode d'électroporation pour la livraison in vivo de l'ADN de Plasmid dans le Telencephalon adulte de poisson zèbre

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...