Nous remercions Dick Foley et Leigh Kimball pour leur rôle clé dans le tournage et la production vidéo.

1. Sang périphérique de cellules mononucléaires (PBMC) isolement <ol><li> Obtenir un échantillon de sang - le sang doit être recueilli dans des seringues ou des tubes de sang et d&#39;anti-coagulant par l&#39;héparine (1:50 ratio) pour empêcher la coagulation. Attendez-vous à un rendement d&#39;environ 1 × 10 6 PBMC par ml de sang - environ 40% de ce qui sera CD4 positifs (CD4 +) des cellules T. </li><li> Aliquoter le sang dans 50 ml tubes coniques, 25 ml par tube. Si le sang a séparé, mélanger délicatement avant d&#39;aliquotage de distribuer le plasma </li><li> Ajouter PBS, portant le volume total à 40 ml et sous-couche en dressant 11 ml de Ficoll, en insérant dans le tube de sang, et en enlevant soigneusement la pipette aide de la pipette. Le Ficoll va s&#39;écouler lentement dans le fond du tube. Une fois le niveau a égalisé, lentement retirer la pipette du tube de sang et le jeter. </li><li> Boucher les tubes de sang et se déplacer dans les bidons Aerosolve. Refermez les bidons et centrifuger à 900 g pendant 20 minutes - sans frein. Il est essentiel qu&#39;aucun frein est appliqué à la fin de ce spin comme la force de freinage va perturber la couche de cellules. </li><li> Après le spin, les PBMC devrait former une couche distincte blanc entre le plasma jaune (dessus) et ficoll transparent (ci-dessous). Doucement écumer blanche couche de cellules de sang en utilisant une pipette de transfert et le transfert dans un nouveau tube. Certains plasma et Ficoll peut être établi avec les PBMC, mais il faut éviter l&#39;élaboration de toute la couche de globules rouges. Typiquement deux tubes de sang peuvent être combinés en un seul tube de cellule à cette étape pour augmenter la taille de granules. </li><li> Ajouter PBS, portant le volume total de 50 ml et centrifuger à 500 xg pendant 15 minutes - frein faible en bonbonnes aerosolve. </li><li> Aspirer le liquide à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur, en prenant soin de ne pas perturber le culot </li><li> Traiter avec le tampon hémolytique en ajoutant 5-6 ml dans chaque tube et mélanger délicatement pour enlever les grumeaux. Incuber pendant pas plus de 5 minutes. </li><li> Ajouter PBS, portant le volume total de 50 ml et centrifuger à 230 xg pendant 10 minutes - frein faible. Bonbonnes Aerosolve ne sont plus nécessaires pour ces rotations plus lentes. </li><li> Laver deux fois: liquide Aspirer à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur, remplir le tube avec du PBS et centrifuger à 230 g pendant 10 minutes. </li><li> Préalablement à l&#39;étape de lavage final, retirer une partie aliquote de remise en suspension des cellules, diluer avec du bleu trypan, et compter à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre. Ce nombre de cellules va dicter les volumes de réactifs utilisés dans l&#39;étape de séparation des cellules T. </li></ol> 2. CD4 + T * la séparation des cellules <ol><li> Aspirer le liquide et ajouter de tampon cours d&#39;exécution pour porter le volume total de 40 ul par 10 millions de cellules. Habituellement, cela nécessite 30 uL de tampon plus le volume résiduel de granules. </li><li> Transférer ce volume à un tube de 15 ml conique. </li><li> Ajouter cocktail d&#39;anticorps à partir du kit d&#39;isolation CD4 - 10 ul par 10 millions de cellules, le tube de la PAC, et le placer sur la glace pendant 10 minutes </li><li> Retirer le tube de la glace, enlever le bouchon, et ajouter 30 uL de courir tampon par 10 millions de cellules </li><li> Ajouter les billes magnétiques à partir du kit d&#39;isolation CD4 - 20 ul par 10 millions de cellules, le tube de la PAC, et le placer sur la glace pendant 15 minutes </li><li> Ajouter dix volumes de tampon de courir pour se laver et centrifuger à 230 g pendant 10 minutes. </li><li> Pendant la rotation, mis en place l&#39;aimant et 5 ml tube en polypropylène dans votre espace de travail </li><li> Aspirer le liquide du culot cellulaire, ajouter 2 mL de tampon course et enlever les amas en utilisant une pipette de transfert </li><li> Utilisation de la pipette de transfert même, le transfert des cellules dans le tube de 5 ml et incuber dans l&#39;aimant pendant 15 minutes </li><li> Décanter avec précaution le CD4 + fraction de cellules dans un tube de 15 ml marqués par l&#39;inversion de l&#39;aimant et la vidange tous sauf la dernière goutte </li><li> Ajouter encore 2 ml de tampon de course au tube de 5 ml et retirer de l&#39;aimant </li><li> Rincer délicatement les cellules CD4 sur les côtés du tube et transférer dans un tube de 15 ml a marqué </li><li> Ajouter 2 mL de milieu de cellules T dans chaque tube, enlever aliquotes pour le comptage des cellules et centrifuger à 230 g pendant 10 minutes. </li><li> Diluer aliquotes de cellules au bleu trypan et compter à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre. Ces globules dictera le nombre de puits utilisés pour l&#39;étape de culture d&#39;expansion. </li></ol> * Alternativement, des colonnes et des perles de MACS (Miltenyi Biotec), le séparateur de cellules Automacs (Miltenyi Biotec), ou séparateur de cellules Robosep (technologies de cellules souches) peuvent être utilisés selon les instructions du fabricant en place d&#39;étapes de 02.02 à 02.11. 3. Dans la culture in vitro d&#39;extension <ol><li> Aspirer le liquide de la CD4 + et de cellules CD4 granulés et, sur la base des numérations cellulaires, ajouter les milieux de culture (généralement 3.000.000 cellules CD4 + par ml et 10 millions de CD4 des cellules par mL fonctionne bien pour la mise en place de la culture). La culture d&#39;expansion nécessite 3 à 5.000.000 de CD4 des cellules par puits et de 2 à 3.000.000 cellules CD4 + par puits dans un volume total de 1 ml de milieux de culture dans une plaque 48 puits de culture. Typiquement, les cellules CD4 + sont la population en limitant </li><li> Si désiré, irradier les cellules CD4 (5000 Rad<html> s). Aliquoter CD4 des cellules dans le nombre approprié de puits sur une plaque 48 puits en ajoutant 300 à 500 uL de chacun. Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 heure. Les adhérents de CD4 des cellules serviront cellules présentatrices d&#39;antigènes dans la culture d&#39;expansion. </li><li> Retirer la plaque de l&#39;incubateur. </li><li> Laver les puits en ajoutant 500 ul de milieux frais et délicatement aspiration et refoulement de 12 à 20 fois en utilisant une pipette de transfert et la suppression de tous les liquides. Ce lavage laissera derrière une couche de cellules antigène présentant adhérente. </li><li> Quand le lavage est terminé, ajoutez les médias juste assez pour mouiller le fond de chaque puits (environ 100 uL) - sinon, les cellules adhérentes se dessèchent </li><li> Ajouter 2 à 3.000.000 cellules CD4 + à chaque puits. Si nécessaire, ajouter des supports supplémentaires pour porter le volume total dans chaque puits jusqu&#39;à 1 ml. </li><li> Ajouter le peptide désiré à chaque puits. La concentration typique pour la stimulation est de 10 ug / ml final. </li><li> Placez la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 7 jours. </li><li> Après 7 jours, ajouter 50 ul de Hemogen IL-2 (ou équivalent, tels que IL-2 recombinante, 10 UI / mL) dans chaque puits. </li><li> Sur chaque journée subséquente, de surveiller la croissance des cellules à l&#39;aide d&#39;un microscope. Flux des puits qui ne sont pas encore confluentes en supprimant la moitié des médias, en ajoutant des milieux frais et 50 uL d&#39;IL-2. Fractionner puits confluentes par remise en suspension des cellules, le déplacement de la moitié des cellules d&#39;un puits vide, en ajoutant des milieux frais et 50 uL d&#39;IL-2. Retour aux cellules de l&#39;incubateur. </li><li> Les cellules en expansion sera prête pour tétramère, après 13-15 jours de culture. </li></ol> 4. Visualisation des cellules T par coloration tétramère <ol><li> Achat ou assembler tétramères pour correspondre à la combinaison de peptides / CMH qui correspondent aux cellules CD4 + stimulés cellules T (voir la discussion des sources de réactifs tétramère). Tétramères devrait être ~ 0,5 mg / ml solution. </li><li> Retirer la plaque de l&#39;incubateur </li><li> Soigneusement prélever la moitié des médias de chaque puits </li><li> Transférer une aliquote de cellules de chaque puits - typiquement 75 uL, soit environ 50 000 cellules - dans un tube de 5 ml en polystyrène FACS </li><li> Ajouter tétramère - typiquement une ul par 50 uL volume total - et les placer dans 37 ° C incubateur pour 1-2 heures. Il est également conseillé de colorer une seconde portion aliquote de cellules de chaque puits avec un tétramère dépareillés comme contrôle négatif. </li><li> Marquer les cellules avec des anti-CD3, anti-CD4, et des anticorps anti-CD25 en ajoutant 30 à 10 uL de chaque anticorps. Marqueurs d&#39;anticorps supplémentaires ou alternatives peuvent être utilisées. Toutefois, ne pas utiliser des anticorps PE labellisés depuis ce canal doit être réservé pour les tétramères. A cette époque, aussi seule étiquette de couleur ou de contrôle isotype utilisant des cellules supplémentaires. </li><li> Incuber les cellules d&#39;anticorps marqués pendant 15-30 minutes sur la glace ou à 4 ° C. </li><li> Laver chaque tube avec 0,5 à 2 ml de tampon courir et centrifuger à 230 g pendant 10 minutes. </li><li> Soigneusement liquide décanter à partir des tubes FACS. Stockez tous les tubes dans un récipient couvert (de préférence sur la glace) pour l&#39;analyse FACS ultérieures. </li></ol> 5. Acquisition cytomètre de flux et d&#39;analyse <ol><li> Calibrer le cytomètre en flux utilisant des billes de référence. </li><li> Vérifiez les paramètres de l&#39;instrument: <ol><li> En utilisant des cellules de contrôle non coloré ou contrôle isotype, d&#39;ajuster l&#39;emplacement de la porte de lymphocytes viables (FSC vs SSC). Retirez l&#39;auto-fluorescence de tous les canaux en centrant la population (en changeant les réglages de gain) en dessous de la première décennie sur chaque axe. </li><li> L&#39;utilisation seule des tubes de contrôle des couleurs, des événements au sein du centre de quadrants correcte pour chaque couleur (en changeant les paramètres de compensation). </li><li> Faites un réglage fin des paramètres de l&#39;instrument en utilisant un tube coloré avec une tétramère pertinent. Dans des contextes particuliers pour le canal PE peut nécessiter un ajustement parce tétramères souvent tache plus lumineuse que le contrôle des anticorps. Le tétramère non pertinents doivent tacher &lt;0,5% de la cellules CD4 +. </li></ol></li><li> Acquérir des données pour chaque tube <ol><li> Collecter des événements pour chaque tube d&#39;échantillon et de contrôle négatif </li><li> Acquérir et d&#39;économiser au moins 20 000 événements pour Analysys </li></ol></li><li> Analyser les données <ol><li> Importer des données des fichiers dans des logiciels d&#39;analyse FACS (par exemple CellQuest logiciels, WinMDI ou FlowJo). Commencez votre analyse en utilisant un tube de teint en utilisant un tétramère pertinent. </li><li> Terrain FSC vs SSC et dessiner une porte dans les lymphocytes vivants (figure 1, en haut à gauche). </li><li> Terrain vs CD4 CD3 (gated pour montrer les lymphocytes vivants seulement) et en tirer des barrières autour du CD3 + CD4 + et les populations (figure 1 panneau en haut à droite). </li><li> CD4 Terrain vs tétramère (gated pour montrer lymphocytes CD3 + uniquement) et fixer les limites du quadrant afin que les cellules CD4 + + tétramère population est inférieure à 0,5% (Figure 1 panneau inférieur gauche). </li><li> Plot CD25 vs tétramère (gated pour montrer que les lymphocytes CD4 +) et fixer les limites du quadrant afin que les CD25 + + tétramère population est inférieure à 0,5% (Figure 1 panneau du bas à droite). </li><li> Analyser l&#39;ensemble des tubes d&#39;échantillon sans changer les portes. </li></ol></li></ol>1167/JOVE 20FIGURE%% 201.png &quot;alt =&quot; Figure 1 &quot;width =&quot; 600 &quot;height =&quot; 342 &quot;/&gt; Figure 1. Représentant des résultats négatifs de contrôle tétramère coloration. Le panneau supérieur gauche montre avant diffusion latérale dispersent versets et la porte la taille des lymphocytes (R1). Le panneau supérieur droit est fermé pour la R1 et montre ant-CD4 par rapport aux anti-CD3 et le CD3 + (R2) et CD4 + (R3) portes. Le panneau inférieur gauche est fermée pour R2 et montre anti-CD4 par rapport tétramère. Le panneau en bas à droite est fermée pour R3 et montre anti-CD25 par rapport tétramère. Les quadrants pour les deux parcelles tétramère ont été fixés à 0,5%. 6. Les résultats représentatifs <ol><li> Les cellules tétramère positifs devraient être une population distincte parmi les CD4 + élargi cellules (figure 2). </li><li> Cellules tétramère positifs sont généralement CD25 + CD4 et souvent élevé. </li><li> Dans certains cas, une combinaison du CMH / peptide peut donner une coloration de fond (souvent causée par un peptide à faible solubilité). Coloration de fond peuvent être différenciés à partir d&#39;un vrai positif parce que les «faux positifs» les cellules ne sont pas une seule population distincte soit sur le CD4 vs tétramère ou le CD25 vs parcelles tétramère (figure 3). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%202.png" alt="" width="600" height="362" /> Figure 2. Représentant des résultats positifs coloration tétramère. L&#39;agencement du panneau et la stratégie de gating sont identiques à la figure 1. Les cellules positives tétramère apparaissent comme une population distincte de CD4 élevé sur l&#39;anti-CD4 par rapport aux panneaux et un tétramère distinctes CD25 + de la population sur l&#39;anti-CD25 par rapport panneau de tétramère. <img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%203.png" alt="Figure 3" width="600" height="336" /> Figure 3. Représentant &quot;faux positifs&quot; coloration tétramère. L&#39;agencement du panneau et la stratégie de gating sont identiques à la figure 1. Les anti-CD4 par rapport aux panneaux tétramère montre une indistincte &quot;monticule&quot; coloration. L&#39;anti-CD25 par rapport tétramère montre également un &quot;monticule&quot; coloration, sans tendance claire vers l&#39;être CD25 +.

<ol>
	<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+Class+II+tetramers+permit+detection+and+characterization+of+peptide-specific+human+CD4++T+cells+proliferating+to+influenza+A+antigen.">MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen.</a> J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).</li><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetramer-guided+epitope+mapping:+rapid+identification+and+characterization+of+immunodominant+CD4++T+cell+epitopes+from+complex+antigens.">Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens.</a> J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).</li></ol>

Comprendre le rôle des cellules T CD4 + dans l&#39;immunité est fondamentalement important. Toutefois, CD4 + spécifiques de l&#39;antigène des cellules T peut être difficile à détecter et d&#39;isoler à l&#39;aide des méthodes traditionnelles. En revanche, CMH de classe II tétramères permettent la visualisation directe des cellules T CD4 + à la spécificité de l&#39;antigène désiré. Cette vidéo montre l&#39;isolement, la purification et l&#39;amplification in vitro des cellules T CD4 + et leur visualisa...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Class 2 Laminar flow biosafety cabinet</td>
<td>equipment</td>
<td>Thermo Forma</td>
<td>1200</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>50 mL conical Tube</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>47747-182</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>1X PBS (Ca/Mg free)</td>
<td>Reagent</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH30028.02</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Ficoll-paque PLUS</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1440-03</td>
<td>foil wrapped to protect from light</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipet Aid XP</td>
<td>equipment</td>
<td>Drummond</td>
<td>4-000-101</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>10 mL pipet</td>
<td>equipment</td>
<td>Corning/Costar</td>
<td>CLS4492</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Aerosolve Canisters</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>359481</td>
<td>with 50 mL inserts</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>GS-6R</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipets </td>
<td>equipment</td>
<td>Samco</td>
<td>202-20S</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipets</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>14672-200</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Hemolytic Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypan blue</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T6146</td>
<td>0.2% in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Hemocytometer</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR </td>
<td>15170-208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL conical tube</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>05-527-90</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Running Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II</td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-155</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>EasySep&reg; Magnet</td>
<td>equipment</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>18000</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL polypropylene tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Falcon</td>
<td>352063</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>Reagent</td>
<td> Invitrogen</td>
<td>22400-089</td>
<td>with 25 mM HEPES</td>
</tr>
<tr>
<td>Pooled human serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen Strep</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>1570-063</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>500mL 0.22 micron bottle top filter</td>
<td>equipment</td>
<td>Nalgene</td>
<td>595-3320</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>48-well plate</td>
<td>equipment</td>
<td>Costar</td>
<td>3548</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>37&deg;C CO2 incubator</td>
<td>equipment</td>
<td>Sanyo Scientific</td>
<td>MCO-18AIC</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>20 mg/mL synthetic peptide</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>Custom synthesis from any peptide vendor</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL FACS tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Falcon</td>
<td>352008</td>
<td>Polystyrene</td>
</tr>
<tr>
<td>Peptide loaded class II tetramer (as described)</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>Prepared by the BRI tetramer core</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD3</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD pharmingen</td>
<td>347344</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD4</td>
<td>Reagent</td>
<td>eBioscience</td>
<td>17-0049-73</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD25</td>
<td>Reagent</td>
<td>eBioscience</td>
<td>11-0259-73</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Facs Calibur Flow Cytometer</td>
<td>equipment</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>342975</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualizing antigen specific cd4+ t cells using mhc class ii tetramers

Complexe majeur d&#39;histocompatibilité (CMH) de classe II tétramères permettent la visualisation directe des cellules CD4 + spécifiques de l&#39;antigène des cellules T par cytométrie en flux. Cette méthode repose sur l&#39;interaction entre le peptide hautement spécifique chargée du CMH et les correspondants récepteur des cellules T. Alors que l&#39;affinité d&#39;un seul CMH / peptide molécule est faible, la réticulation des complexes CMH / peptide avec la streptavidine augmente l&#39;avidité de l&#39;interaction, permettant leur utilisation comme réactifs coloration. En raison de la fréquence relativement faible des lymphocytes T CD4 + (~ 1 300 000 en une seule spécificité) ce test utilise une étape de l&#39;amplification in vitro d&#39;augmenter son seuil de détection. Des cellules mononucléaires sont purifiés à partir du sang périphérique par la sous-couche de Ficoll. Cellules CD4 + sont ensuite séparés par une sélection négative utilisant un cocktail d&#39;anticorps biotinylé et d&#39;anti-biotine billes magnétiques. En utilisant des cellules adhérentes de la fraction de cellules CD4 que cellules présentatrices d&#39;antigènes, cellules T CD4 + sont développées dans les médias par l&#39;ajout d&#39;un peptide antigénique et de l&#39;IL-2. Les cellules sont colorées avec élargi correspondant de classe II tétramère en incubant à 37 ° C pendant une heure et ensuite colorées à l&#39;aide d&#39;anticorps de surface tels que l&#39;anti-CD4, anti-CD3 et anti-CD25. Après marquage, les cellules peuvent être directement analysées par cytométrie en flux. Les cellules positives tétramère se forment généralement une population distincte parmi les CD4 + cellules élargi. Cellules tétramère positifs sont généralement CD25 + CD4 et souvent élevé. Parce que le niveau de coloration tétramère de fond peut varier, les résultats coloration positive doit toujours être comparée à la coloration des cellules mêmes avec un tétramère pertinent. Multiples variantes de ce test de base sont possibles. Cellules tétramère positifs peuvent être triées pour l&#39;analyse phénotypique d&#39;autres, l&#39;inclusion dans ELISPOT ou de tests de prolifération, ou d&#39;autres épreuves du secondaire. Plusieurs groupes ont également démontré la co-marquage utilisant des tétramères et soit anti-cytokine et anti-FoxP3 anticorps.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers at JoVE.com

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Cette procédure montre la purification et l&#39;expansion in vitro des cellules CD4 + spécifiques de l&#39;antigène des cellules T du sang périphérique entier et leur visualisation en utilisant des tétramères CMH de classe II. Tétramères permettent la visualisation directe des cellules T avec une spécificité antigénique unique et défini CMH de classe II restriction.

Antigène spécifique de CD4 + Visualisation cellules T à l&#39;aide du CMH de classe II tétramères

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

visualizing-antigen-specific-cd4-t-cells-using-mhc-class-ii-tetramers

Research

JoVE Journal

Biology

21.6K vues.  Benaroya Research Institute. Cette procédure montre la purification et l'expansion in vitro des cellules CD4 + spécifiques de l'antigène des cellules T du sang périphérique entier et leur visualisation en utilisant des tétramères CMH de classe II. Tétramères permettent la visualisation directe des cellules T avec une spécificité antigénique unique et défini CMH de classe II restriction.

Vidéo: Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

T CD4 + des lymphocytes capturer en utilisant une puce jetable microfluidiques pour le VIH

Recherche

Biologie

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolement des cellules T CD4 + des ganglions lymphatiques de souris en utilisant Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

Une technique pour visualiser simultanément spécifiques du virus de cellules CD8 + T et les cellules infectées In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Analyse cellulaire spécifique de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Feuilles en utilisant la fluorescence par tri cellulaire activé

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Visualisation des bactéries dans nématodes en utilisant la microscopie à fluorescence

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Un essai de liaison à haut débit CMH II pour l&#39;analyse quantitative du peptide épitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Détection de intracellulaire Gene Expression dans des cellules vivantes de murin, humain et porcin Origine utilisant des nanoparticules marquées par fluorescence

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Suivi et quantification des processus de développement des<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilisation des outils open-source

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the lymph node microenvironment in B-cell non-Hodgkin&#39;s lymphoma is analyzed. Subsets of circulating T-follicular helper cells (cTfh), the circulating memory compartment of Tfh cells in the blood, are also perturbed in disease and therefore represent potential novel predictive biomarkers. Peripheral blood-based testing is advantageous because it is relatively non-invasive and allows simple serial monitoring.This article describes a method for isolating CD4+ T-cells from human blood, and further analysis by flow-cytometry to enumerate cTfh cells and the proportions of their various subsets (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 and cTfh1/17). The level of these subsets was then compared between normal subjects and patients with lymphoma. We found that the method was robust enough to obtain reliable results from routinely collected patient material. The technique we describe for the analysis can be easily adapted to cell sorting and downstream applications such as RT-PCR.

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Here, a protocol for the isolation and characterization of CD4+ T-cell subsets from human peripheral blood is described. Purified CD4+ T-cells are analyzed by flow cytometry to determine proportions of T-follicular helper cell subsets.

Isolement des CD4+ T-cellules et analyse de circulation folliculaire T Helper (cTfh) des sous-ensembles de cellules de sang périphérique à l’aide 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is essential in revealing cellular events associated with the recruitment and assembly of DNA repair complexes at the site of DNA damage. In the last few years, several powerful tools have been developed to induce site-specific DNA damage. Moreover, novel seminal techniques allow us to study these processes at the single-cell resolution level using both fixed and living cells. Although these techniques have been used to study various biological processes, herein we present the most widely used protocols in the field of DNA repair, Fluorescence Immunostaining (IF) and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), which in combination with endonuclease-based site-specific DNA damage make it possible to visualize and quantify the genomic occupancy of DNA repair factors in a directed and regulated fashion, respectively. These techniques provide powerful tools for the researchers to identify novel proteins bound to the damaged genomic locus as well as their post-translational modifications necessary for their fine-tune regulation during DNA repair.

This article introduces essential steps of immunostaining and chromatin immunoprecipitation. These protocols are commonly used to study DNA damage-related cellular processes and to visualize and quantify the recruitment of proteins implicated in DNA repair.

Visualisation et quantification des dommages à l’ADN spécifiques au site à base d’endonucléase

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is ...