En vidéo, nous présentons un protocole de congélation-fracturation des vésicules extracellulaires provenant de cellules cancéreuses de la vessie in vitro. Les vésicules extracellulaires sont des vésicules limitées par la membrane qui dérivées de cellules sont libérées dans l’espace extracellulaire et jouent un rôle dans la communication intercellulaire. Au sein des vésicules extracellulaires, nous discriminons trois populations, les exosomes, les microvésicules et les corps apoptotiques, qui diffèrent par leur origine, leur taille et leur composition moléculaire.
La composition moléculaire des vésicules extracellulaires reflète le profil moléculaire de la cellule donneuse et interfère avec les processus biologiques dans la cellule receveuse. Cependant, la composition de la membrane limitante des vésicules cellulaires est cruciale pour l’interaction avec la membrane cellulaire réceptrice. Pour analyser l’organisation de la membrane limitante, les vésicules extracellulaires doivent d’abord être isolées, puis approchées pour la technique de gel-fracture.
La freeze-fracture est une technique de microscopie électronique dédiée à l’étude de l’organisation bidimensionnelle des membranes biologiques, y compris les vésicules. Les étapes de la fracturation par congélation sont la congélation rapide de l’échantillon, la fracturation de l’échantillon, la fabrication de la réplique de la surface gelée-fracturée et le nettoyage de la réplique pour éliminer les matières biologiques. Les répliques sont finalement visualisées au microscope électronique à transmission.
Notre objectif était d’utiliser la technique de la fracture par gel pour caractériser les microvésicules en termes de forme, de taille et de composition de la membrane. Commencez par la croissance des cellules dans l’incubateur cellulaire. Inspectez les cellules au microscope pour confirmer leur variabilité et leur confluence.
Recueillir les milieux de culture avec des microvésicules dans des tubes et centrifuger à des forces de 300 g pendant 10 minutes. Collecter le surnageant. Par la suite, centrifugez le surnageant à 2000 g de forces et 10 000 g de forces.
Après cela, observez l’extrémité du tube pour une pastille blanchâtre indiquant des microvésicules. Retirez soigneusement le surnageant. Ajouter 1,5 millilitre de PBS et suspendre à nouveau les microvésicules contenant des pastilles.
Puis centrifuger à 10 000 g-forces. Observez la présence de la pastille blanchâtre. Retirez le surnageant et ajoutez doucement un fixateur.
Laisser reposer 20 minutes à 4 degrés Celsius. Ensuite, retirez le fixateur et ajoutez un tampon de lavage pour rincer la pastille sans la suspendre à nouveau. Laisser reposer 10 minutes à 4 degrés Celsius.
Retirez le tampon de lavage et ajoutez 30% de glycérol aux granulés. Remettez les granulés en suspension homogène et incubez pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius. Préparez des supports de cuivre propres avec une fosse centrale et développez une fiole avec froncement de sourcils et azote liquide.
Au microscope, transférer l’échantillon dans la fosse centrale du support en cuivre. Mélanger le fréon solidifié pour qu’il se liquéfie. Prenez l’anneau extérieur du support avec une pince à épiler et immergez-le dans du fréon refroidi.
Après huit secondes, transférez rapidement le support dans une fiole de développement avec de l’azote liquide. Marquez cryo vile et refroidissez-le. Sous l’azote liquide, collectez les supports dans le vile, fermez-le et stockez-le dans le récipient d’azote liquide jusqu’à la fracturation par congélation.
Préparer l’unité de fraction de congélation conformément aux instructions d’utilisation du fabricant. Démarrez le système de vide et refroidissez la chambre de l’unité à moins 150 degrés Celsius. Transférer les supports de cuivre avec l’échantillon congelé dans l’unité de fractionnement de congélation.
Réglez la température du couteau à moins 100 degrés Celsius et attendez l’aspirateur. Commencez à sectionner l’échantillon en allumant le mouvement motorisé du couteau jusqu’à ce que la surface de l’échantillon soit lisse. Pour la fracturation, éteignez le mouvement motorisé du couteau et procédez à un contrôle manuel lent du couteau.
Procédez avec l’ombrage en platine à l’angle de 45 degrés. Allumez la haute tension et augmentez le courant vers le pistolet à platine. Des étincelles de platine devraient commencer à ombrer l’échantillon.
Supervisez la position du platine sur le moniteur d’épaisseur du cristal de quartz. L’épaisseur recommandée du platine est de 2,5 nanomètres. Éteignez le courant et la tension élevée.
Procédez à l’ombrage en carbone à un angle de 90 degrés. Allumez la haute tension et augmentez le courant jusqu’au pistolet en carbone. Des étincelles de carbone devraient commencer à ombrer l’échantillon.
Lorsque 2,5 nanomètres de carbone sont obtenus, éteignez le courant et la tension élevée. Transférez ces échantillons avec les répliques de l’unité de congélation-rupture sur une plaque de 12 soupapes remplie d’eau double distillée. Les répliques flotteront à la surface de l’eau pendant que les transporteurs coulent.
Transférez les répliques avec boucle métallique sur une plaque à 12 valves remplie d’hypoclorite de sodium et incubez pendant la nuit. Lavez les répliques dans de l’eau double distillée. Rassemblez-les sur une grille en cuivre TM et laissez-les sécher à l’air pendant deux heures.
Utilisez un microscope électronique à transmission pour imager des répliques et obtenir des micrographies. Pour une interprétation précise des répliques et des micrographies, suivez les directives pour l’orientation appropriée de la nomenclature. Les analyses de répliques ont montré que le milieu conditionné isolé contenait une fraction enrichie de vésicules.
Les vésicules isolées ont été soit rassemblées en grappes de trois ou plus, soit distribuées très individuellement. Les vésicules étaient de forme sphérique. Le diamètre des vésicules correspondait au diamètre des microvésicules.
La fracturation par congélation a également révélé une organisation bidimensionnelle de la membrane des microvésicules. La phase exoplasmique des microvésicules avait un aspect lisse et uniforme tandis que dans la phase des protoplastes, nous avons observé des particules intermembranaires. Des particules intermembranaires sont apparues sporadiquement, ce qui implique que les microvésicules isolées à partir de cellules cancéreuses ne contiennent qu’une faible quantité de protéines membranaires ou d’assemblages de protéines.
Pour résumer, la technique de congélation-fracture utilisée dans le protocole présenté s’avère être une technique optimale pour la caractérisation des vésicules extracellulaires et peut être utilisée pour l’évaluation d’autres populations de vésicules extracellulaires. Un avantage crucial de la technique de gel-fracture est son pouvoir de résoudre l’organisation interne de la membrane limitant les vésicules, qui détermine la fonction biologique des vésicules extracellulaires.
