We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.

Déclaration éthique: Les yeux utilisés dans cette étude ont été utilisés conformément à la Déclaration sur la transparence de la recherche animale: 1 Fabrication de PLGA biodégradables membranes Equipé micropoches <ol><li> Les échafaudages cycliques ont été créées par une combinaison de techniques Microstéréolithographie électrofilage et 31. En essence, le processus peut être résumé en 2 parties (i) la création de modèles PEGDA par microstéréolithographie et (ii) électrofilature sur les modèles pour la reproduction de la structure sous-jacente PEGDA (dans ce cas un anneau microfabriquée). Ces deux étapes sont décrites en détail ci-dessous (figures 1 et 2). <ol><li> Fabrication de modèles PEGDA par microstéréolithographie (microSL) <ol><li> Fabriquer les anneaux à l&#39;aide d&#39;un modèle de couche 2, avec la première couche (L1) étant la base de la structure et de la deuxième couche (L2) présentant des micro-poches 6 Morphologi fer à chevales dans une gamme de tailles 300-500 um. La fabrication d&#39;anneaux PEGDA a récemment été décrit par ce groupe 22. <ol><li> Créer L1 en dessinant un cercle de 1,2 cm noire en utilisant n&#39;importe quel logiciel de dessin approprié. </li><li> Créer L2 de la même manière mais inclure 8 des structures en forme de fer à cheval-blanc 0,5 x 0,35 mm. Distribuer les petites formes en fer à cheval blanc dans la structure de cercle noir. </li><li> Enregistrer L1 et L2 au format JPEG. </li></ol></li><li> Dans un flacon en verre foncé, mélanger le polyéthylène glycol diacrylate (PEGDA, Mn = 250 g / mol) avec 1% p / p Camphorquinone, un photo-initiateur, sur un agitateur magnétique pendant 20 min. </li><li> Développez le faisceau laser de la microstéréolithographie mis en place au moyen d&#39;un agencement de lentille télescopique et le projeter sur un dispositif de multimirror numérique programmable par ordinateur (kit de démarrage DMD permis aux UV). NOTE: La DMD reflète l&#39;image (dans ce cas un anneau) sur un miroir par une longueur focale lentille de tube de 10 cm. L&#39;image est alors dirigé par l&#39;argent-coated miroir dans un flacon contenant le polymère photodurcissable (PEGDA). </li><li> Réglez et nettoyez soigneusement l&#39;optique de l&#39;microstéréolithographie mis en place. </li><li> Mettre 300 ul du mélange PEGDA dans un puits d&#39;une plaque de culture tissulaire à 12 puits. Assurez-vous que les puits sont pré-enduites de téflon ou autre matériau anti-adhésif pour un retrait facile de la structure après cuisson. </li><li> Allumez le laser bleu (MBL-III 473 nm; 150 mW) et télécharger L1 dans le logiciel de ALP3-base antérieurement installés sur le PC. Irradier la première couche pendant 60 secondes. REMARQUE: ALP3-base est une interface USB qui assure la liaison entre le PC et le dispositif de micro-miroir numérique. </li><li> Ajouter au bien 250 pi plus de la PEGDA, télécharger L2 comme décrit ci-dessus et irradier L2 pendant 60 secondes. </li><li> Retirez le polymère non durci et laver l&#39;anneau avec de l&#39;isopropanol O / N. </li></ol></li><li> Fabrication de Biodégradable PLGA membranes utilisant électrofilature REMARQUE: Les anneaux PEGDA ont été utilisés comme modèles sur qui PLGA a été électrofilé avec le PLGA reproduire la topographie sous-jacente comme il est filé sur ces modèles. Après la filature, la feuille de polymère PLGA a été détachée de la collection. La membrane finale PLGA ne contient pas les anneaux PEGDA qui restaient attachés à la collecteur métallique. <ol><li> Distribuez les anneaux PEGDA sur une feuille d&#39;aluminium électrolytique (12 cm x 20 cm) pour créer un collecteur de électrofilature statique. </li><li> Fixez les anneaux avec du ruban de carbone conducteur. NOTE: Ces bagues, une fois formés peuvent être réutilisés en tant que modèles pour électrofilature. </li><li> Préparer la solution de polymère pour la filature. Dissoudre PLGA (50/50 DL-lactide (52% en moles): glycolide (48% mol), 44 kg / mol) dans du dichlorométhane (DCM) à 20% p / p de concentration. </li><li> Incorporer O / N avant utilisation. </li><li> Place 4 seringues d&#39;insuline (extrémités franches, des aiguilles de 0,8 cm de diamètre intérieur) sur une pompe à seringue. REMARQUE: Quatre seringues assuré électrofilature plus rapide que de travailler avec une seule seringue. </li><li> Chargez 2,5 ml de solution de PLGA dans chaque seringue. </li><li> Electrospin en utilisant un débit de 30 ul / min et des tensions allant de 12 à 15 kV. Laisser une distance entre les aiguilles et le collecteur de 15 cm. </li><li> Electrospin pendant 1 h et 30 min et enfin éplucher soigneusement la feuille électrofilé PLGA du collecteur soutenir les anneaux PEGDA. </li><li> Couper les échafaudages électrofilées dans 22 cercles mm de diamètre à l&#39;aide d&#39;un emporte-pièce circulaire et en laissant la structure du noyau placé au centre. </li></ol></li></ol></li></ol> Stockage 2 à long terme de PLGA microfabriqués membranes Remarque: Les anneaux de PLGA ont été fabriqués et stérilisés par des sociétés externes accrédités; échantillons ont été irradiés à une gamme de dose externe de 25-40 kGy. <ol><li> Monter la membrane dans un petit récipient (boîte de Pétri en plastique) et le placer dans un sac de qualité médicale. </li><li> Utilisez du papier filtre pour créer de petits sacs de filtre pour les desséchants. To créer les sacs, pliez le papier filtre (125 mm de diamètre) et couper le demi-cercle résultant de moitié; puis sceller les extrémités ensemble avec du ruban adhésif. <ol><li> Remplir trois sacs en papier de filtre avec 1 g de silice orange, cobalt (II), le chlorure, le sulfate de cuivre et (II), respectivement. </li><li> Mettre les trois sachets absorbeurs d&#39;humidité à l&#39;intérieur du sac de qualité médicale avec la membrane électrofilé. </li></ol></li><li> Ajouter à la valise une tache six carte indicatrice d&#39;humidité disponible dans le commerce afin de détecter toute accumulation d&#39;humidité au cours de la période de stockage. </li><li> Utilisation d&#39;une machine de soudage à chaud sous vide à un vide et sceller le sac. </li><li> Envoyer les membranes annulaires à une société externe pour γ-irradiation. </li><li> Magasin γ-membranes irradiées PLGA à une large gamme de températures de -20 ° C à 37 ° C dans un environnement humide à l&#39;intérieur d&#39;un incubateur contenant 5% de CO 2. </li><li> stockage du message, examiner l&#39;indicateur d&#39;humidité pour confirmer que le niveau d&#39;humidité est au-dessous de 30%. </li><li> Usoi microscopie électronique à balayage (MEB) afin d&#39;évaluer l&#39;intégrité des fibres. </li></ol> Isolement des 3 explants limbiques Lapin explants limbiques ont été isolés à partir des yeux de lapin (obtenus à partir d&#39;une ferme où les lapins sont élevés pour la consommation). <ol><li> Désinfecter les yeux de lapin à l&#39;aide d&#39;une solution antiseptique (3%). </li><li> Nettoyer les yeux en retirant tout excès de tissu qui entoure la cornée. </li><li> Séparer la région limbique (identifiée comme une zone circulaire mince entre la cornée (transparent) et la sclérotique (blanc)) à partir du reste de la cornée à l&#39;aide d&#39;un microscope à dissection. </li><li> Coupez-les en segments (environ 1,5 cm de long) sous le microscope de dissection. </li><li> Désinfecter les segments du limbe dans une solution antiseptique de 1,5% pendant 1 min. </li><li> Couper les segments du limbe en petits morceaux (de 100 à 500 um) avec une lame de scalpel. </li><li> Stockez les petits morceaux de tissus dans un milieu de culture (DMEM + Glutamax: Ham&#39;s F12 (1: 1), 10% de sérum fœtal bovin, 1 U / ml styloicillin, 100 mg / ml de streptomycine, 2,5 pg / ml d&#39;amphotéricine 10 ng / ml d&#39;EGF, et de 5 ug / ml d&#39;insuline) à 37 ° C et 5% de CO 2 jusqu&#39;à utilisation (pas plus de 60 min). </li></ol> 4. excroissance de cellules limbiques de explants Lapin explants limbiques ont été placés sur les deux membranes microfabriqués fraîchement filés et des membranes qui étaient emballés sous vide et stockés pendant 6 mois à -20 ° C. <ol><li> Enduire les échafaudages cycliques avec 15 ul de la colle de fibrine (1: 1 d&#39;un mélange de fibrinogène à partir de plasma humain à une concentration de 18,75 mg / ml et de la thrombine à partir de plasma humain à une concentration de 2,5 U / ml) en utilisant un racleur de cellules pour la diffusion de la fibrine uniformément. </li><li> Placer les explants de tissu directement sur les micropoches PLGA en utilisant une aiguille de 25 G et un microscope à dissection. </li><li> Ajouter milieux de culture de cellules très doucement pour éviter de détacher les explants. <ol><li> Changer de support tous les 3 jours (recette de milieux décrits dans la section 3.7) et keep en culture pendant 2 semaines dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Fixer les échantillons avec 3,7% de formaldéhyde tamponnée pendant 10 min suivi par 3 lavages avec du PBS. </li><li> Contre-coloration par incubation à 1 ug / ml de 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ou l&#39;iodure de propidium (PI) pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Laver 3 fois en PBS et stocker les échantillons recouverts de papier d&#39;aluminium. </li><li> Image les échantillons à l&#39;aide d&#39;un microscope de fluorescence à des longueurs d&#39;onde de 543 nm et 800 nm (deux photons). </li></ol> 5. Mettre en place des lapins blessés modèles Cornée 3D <ol><li> Nettoyer et désinfecter les yeux des lapins comme décrit ci-dessus. </li><li> Wound les yeux de lapins en les immergeant dans 0,14% d&#39;hydroxyde d&#39;ammonium pendant 5 min. </li><li> Rincer les yeux dans du PBS et gratter l&#39;épithélium avec un couteau de sclérotome. </li><li> Couper et isoler le bouton de la cornée-scléral à enlever de tissu restant. </li><li> Placez les cornées côté épithélial vers le bas surune tasse stérile et remplir avec de l&#39;agar 0,5% made in DMEM. </li><li> Une fois réglé, mis les cornées côté épithélial en place, en petites boîtes de Pétri et ajouter milieux de culture (recette ci-dessus) jusqu&#39;à la zone limbique. NOTE: Ne pas couvrir l&#39;ensemble de la cornée; maintenir la culture de l&#39;orgue à l&#39;interface air-liquide. </li></ol> 6 Isolation des explants limbiques et de l&#39;inclusion de Ring échafaudages en lapin modèles Cornée 3D <ol><li> Enduire les membranes annulaires avec 15 ul de la colle de fibrine (1: 1 d&#39;un mélange de fibrinogène à une concentration de 18,75 mg / ml et de la thrombine à une concentration de 2,5 U / ml) .Utilisez un racleur de cellules comme décrit ci-dessus. </li><li> Placer les explants de tissu directement sur les micropoches PLGA en utilisant une aiguille de 25 G et un microscope à dissection. </li><li> Placez les anneaux avec les explants de tissus sur les cornées dénudées avec les explants vers le haut et dans les conditions de l&#39;interface air-liquide. (Ces conditions ont été décrites précédemment 22). </li><li> Maintenir les modèles de culture d&#39;organes pour4 semaines dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% CO 2, le changement du support tous les 2 jours. </li></ol> 7 Évaluation de la cornée et la régénération des cellules souches de maintenance <ol><li> Après 4 semaines, fixer les cornées en utilisant 3,7% de formaldéhyde. </li><li> Traiter les cornées pour l&#39;histologie conventionnelle pour produire 6 um sections de paraffine. </li><li> Colorer à l&#39;hématoxyline et à l&#39;éosine (H &amp; E). </li><li> Par immunocytochimie, déparaffiner les sections dans du xylene (3min) et réhydrater dans 100% d&#39;éthanol (1 min), 70% d&#39;éthanol (1 min), et de l&#39;eau distillée (2 min). </li><li> Délimiter les sections à l&#39;aide d&#39;un stylo Dako pour délimiter petites zones et éviter l&#39;utilisation excessive d&#39;anticorps. <ol><li> Traiter les zones délimitées par la trypsine à 0,05% (100 pi) pendant 20 min (37 ° C). </li></ol></li><li> Bien se laver avec du PBS et ajouter 100 ul de sérum de chèvre 10% (blocage) pendant 1 heure. </li><li> Incuber les échantillons avec 100 pi d&#39;anticorps monoclonal de souris cytokeraétain 3 (CK3) et 100 pi de p63 dans le sérum S de 1% chèvre / N à 4 ° C. </li><li> Laver avec du PBS et on traite avec 100 pl d&#39;anticorps anti-souris secondaire biotinylé (1: 1000 dans 1% de sérum de chèvre) pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Ajouter 100 pi de streptavidine-FITC (1: 100 de sérum de chèvre à 1%) pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Traiter les échantillons avec du DAPI, comme décrit ci-dessus. </li><li> Image les échantillons à l&#39;aide d&#39;un microscope de fluorescence à des longueurs d&#39;onde de 800 nm (deux photons) et 488 nm. </li></ol>

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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structural+niches+engineered+via+two-photon+laser+polymerization+promote+stem+cell+homing.">Three-dimensional structural niches engineered via two-photon laser polymerization promote stem cell homing.</a> Acta Biomaterialia. 9, 4579-4584 (2013).</li><li>Gobaa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+niche+microarrays+for+probing+single+stem+cell+fate+in+high+throughput.">Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput.</a> Nat Meth. 8, 949-955 (2011).</li><li>Truckenm&#252;ller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+cell+container+arrays+with+overlaid+surface+topographies.">Fabrication of cell container arrays with overlaid surface topographies.</a> Biomedical Microdevices. 14, 95-107 (2012).</li><li>Ortega, &. #. 2. 0. 5. ;., Ryan, A. J., Deshpande, P., MacNeil, S., Claeyssens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+microfabrication+and+electrospinning+to+produce+3-D+architectures+for+corneal+repair.">Combined microfabrication and electrospinning to produce 3-D architectures for corneal repair.</a> Acta Biomaterialia. 9, 5511-5520 (2013).</li><li>Blackwood, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+biodegradable+electrospun+scaffolds+for+dermal+replacement.">Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement.</a> Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

Cette étude décrit (a) une technique pour la fabrication de membranes électrofilées microcaractéristiques contenant en leur sein, et (b) la préparation de telles membranes pour l&#39;utilisation clinique de l&#39;emballage sous vide, l&#39;irradiation gamma et ensuite le stockage avant l&#39;utilisation. Dans cette application particulière, nous avons mis au point des membranes de PLGA contenant des micro-poches qui imitent les caractéristiques physiques des niches de cellules souches limbiques. Les objectifs de cette étude sont (i) de décrire les méthodes à fournir aux lecteurs les connaissances nécessaires pour concevoir et fabriquer des échafaudages contenant microcaractéristiques pour la recherche sur la contribution des niches de cellules souches pour la régénération des tissus et (ii) de fournir au lecteur une meilleure compréhension de façon à stocker des échafaudages électrofilées pendant de longues périodes de temps. En termes d&#39;application clinique, le stockage des membranes d&#39;anneau est d&#39;une importance primordiale. Dans ce travail, la dégradation de l&#39;anneau a été étudiée sur une période de 6 mois. La dégradation de l&#39;membranes est entraîné par hydrolyse afin de simplement garder les membranes humidité sans le processus est arrêté. Blackwood et al. Rapporté qu&#39;en faisant varier le rapport de PLA de PGA, la dégradation de la membrane change 32. Cette étude a également montré que, en augmentant la quantité d&#39;AMP, le taux de membranes électrofilées de dégradation in vivo accrue 22. Ici, il a été montré que l&#39;emballage sous vide avec les membranes avec un peu desséchant et les irradiant et en les stockant à basse température pendant 6 mois, il n&#39;y a pas de changement dans l&#39;intégrité de la fibre et de la dégradation. À l&#39;heure actuelle, 6 mois est aussi loin que nous avons étudié avec ces membranes contenant micropoches mais les données de stockage pendant 1 an a été rapporté sur les membranes électrofilées simples à -20 ° C 22 et nous avons maintenant des données inédites pour leur stockage à -20 ° C pour 2 ans sans aucun signe de dégradation. Ainsi, pour le stockage à long terme, il serait recommandé de les stocker à sec à -206, C, mais il est possible de les stocker à la température ambiante, même en Inde pendant au moins 6 mois (peut-être beaucoup plus longue). L&#39;inclusion d&#39;un indicateur d&#39;humidité donne un moyen facile de vérifier que l&#39;emballage a gardé membranes sèches dans ce cas, ils seront aptes à l&#39;emploi. Transfert des cellules de ces anneaux aux modèles 3D de la cornée a été montré lors de la passation des explants limbiques dans les micropoches. Ce groupe a récemment rapporté le transfert des cellules sur un modèle in vitro de la cornée de lapin en plaçant les explants sur des membranes plates PLGA (membranes sans structures cycliques 24). Utilisation du transfert de cellules de échafaudages microfabriqués présent a été pris un peu plus loin que nous pouvons maintenant localiser précisément explants de tissus dans les microcaractéristiques. La possibilité de placer directement les explants dans les créneaux permet également au chirurgien d&#39;utiliser les membranes directement dans la salle d&#39;opération en évitant la nécessité d&#39;une salle blanche à la première expansion des cellules souches limbiques. Bien que ce morceau de work a été axée sur le développement de dispositifs pour les maladies de la cornée, cette technologie de microfabrication peut également être demandée pour des dispositifs pour de nombreuses autres applications en développement. Les travaux à venir découvrir la fabrication de constructions pour la régénération d&#39;autres tissus tels que la peau et les os. Alors que la conception et la fabrication initiale des microstructures PEGDA peuvent prendre beaucoup de temps, une fois fabriqué les structures peuvent être réutilisés plusieurs fois sans dégradation. Par conséquent, la fabrication ultérieure de membranes biodégradables PLGA microstructurée par électrofilature peut être effectuée à un taux comparable à la production de «non structurées (&#39;) membranes lisses suite à l&#39;assemblage du collecteur. Bien que, dans ce travail, nous avons utilisé microstéréolithographie pour fabriquer des moules, d&#39;autres méthodes de fabrication telles que l&#39;impression en 3D ou de moulage par injection peuvent être également utilisés. En conséquence, le moule sous-jacent peut être fabriqué à partir de polymères ou d&#39;autres métaux au lieu de PEGDA. En tant que tel cette technique est très polyvalent et chercheurs peut facilement adapter la méthode en fonction de leurs propres besoins et des installations. La maison en microstéréolithographie set-up utilisé dans cette étude ne permettra pas la préparation de constructions avec des caractéristiques moins de 30 microns; ce n&#39;est pas une limitation de l&#39;application de la cornée est décrit ici, mais il pourrait être essentielle dans la conception d&#39;autres modèles. Dans ce cas, d&#39;autres techniques telles que la polymérisation de 2 photons (2PP) pourrait être d&#39;intérêt mais la technique de électrofilature pourrait ne pas permettre la reproduction des structures à l&#39;échelle sub-micronique (ce qui est actuellement à l&#39;étude par notre groupe). Les étapes critiques dans le processus de fabrication sont (i) d&#39;éviter la surcuisson des modèles PEGDA qui peuvent être contrôlés en ajustant le temps et les quantités de photo-initiateur. (Ii) contrôler les conditions électrofilage tels que la température et l&#39;humidité. (Iii) Le stockage appropriée la electrospumembranes n anneau à l&#39;aide de l&#39;emballage sous vide et desséchants. En résumé, en plaçant des explants de tissu du limbe dans les microcaractéristiques de la membrane, nous avons montré l&#39;excroissance des cellules des explants sur le créneaux, le transfert des cellules sur une cornée de lapin blessé et après réépithélisation de la cornée. La dégradation des membranes stockés à différentes températures a également été étudié et un protocole de conditionnement qui permet le stockage à long terme de membranes a été mise au point, cette dernière étant indispensable à l&#39;élaboration des membranes pour une utilisation clinique.

La cornée, le tissu avasculaire extérieur plus centrale de l&#39;oeil, est l&#39;un des tissus les plus importants impliqués dans une vision. Il existe plusieurs types de cellules qui conservent la fonction de la cornée. La couche supérieure externe de la cornée est composée de cellules épithéliales qui peuvent être d&#39;environ 5-7 couches d&#39;épaisseur 2. Cette couche empêche l&#39;invasion bactérienne dans la cornée et 3 permet l&#39;entrée d&#39;oxygène 4. Il a été rapporté que les cellules souches de l&#39;épithélium de la cornée se trouvent dans des niches ou des cryptes (avec des tailles de 120 à 150 um) dans la région périphérique de la cornée du limbe connu comme 5,6. Comme les cellules souches se divisent, les cellules filles aussi appelées cellules d&#39;amplification transitoire voyagent sur ​​des niches et que la division continue les cellules se déplacent de façon centripète vers l&#39;intérieur et vers le haut résultant dans des cellules différenciées à la région centrale de la cornée 7,8. Ces cellules sont régulièrement effacés avec le clin d&#39;œil exposing nouvelles cellules sous 9. En plus d&#39;être l&#39;emplacement des cellules souches épithéliales, le limbe joue également un rôle dans le maintien de la conjonctive vascularisée loin de la région de la cornée 10. Dommages au limbe peut être causée par des brûlures thermiques / chimiques, les radiations et aussi les maladies génétiques 10. Lorsque cela se produit, la barrière de la limbe est décomposé en permettant aux cellules de la conjonctive de se déplacer sur la cornée, la vascularisation de la région, causant de la douleur et de la cécité dans certains cas. La condition est connue comme la carence en cellules souches limbiques (LSCD) 10. Différents substrats naturels ont été rapportés en tant que supports de cellules souches possibles pour aider à la régénération de la cornée. Par exemple, les membranes à base de collagène ont été utilisés par dravidien et al. 11 et Rama et ses collègues 12 ont signalé l&#39;utilisation de fibrine dans une étude de 112 patients. À l&#39;heure actuelle cependant la méthode la plus couramment utilisée de traitementest d&#39;utiliser la membrane amniotique humaine à partir d&#39;une banque de tissus et de la culture des cellules épithéliales limbiques sur sa surface 13,14. Une fois qu&#39;une monocouche est formée, la membrane amniotique est collée cellule vers le haut sur ​​la cornée endommagée, ce qui a toutes les cellules de la conjonctive et de tissus cicatriciels enlevée chirurgicalement de celle-ci avant cette transplantation de cellules 14. La membrane amniotique se dégrade en quelques semaines à quelques mois en laissant les cellules épithéliales attachés à la zone dénudée pour régénérer l&#39;épithélium 15,16. Cette technique a réussi à restaurer la vision mais il ya encore quelques questions pratiques qui restreignent son adoption généralisée cliniquement. Comme la membrane amniotique est un tissu humain, il doit subir un dépistage par les procédures de la banque de tissus de bons avant d&#39;être utilisé pour la transplantation de cellules sur des patients. Ce dépistage ne ​​réduit le risque de transmission de maladies, mais ne peut pas éliminer complètement 17. En plus de cela, il ya eu des rapports de la variabilité de la performance de la membrane amniotique due à la variation des donateurs entre 18,19 et différentes méthodes de traitement 19,20. Parallèlement le faible risque de transmission de maladies, il ya la nécessité de centres de chirurgie d&#39;avoir accès à des banques de tissus bien gérées, ne sont pas disponibles pour tous. Bien que la membrane amniotique est relativement de succès, il existe un besoin pour le développement de nouvelles alternatives synthétiques biodégradables de support cellulaire pour le traitement des maladies de la cornée. Transporteurs synthétiques seraient surmonter la nécessité de procédures bancaires ainsi que d&#39;éliminer le faible risque de transmission de la maladie et de la variabilité inter-bailleurs de fonds. En ce sens, des matériaux tels que le polyethylene glycol 21,22 et 23,24 PLGA ont été étudiés. En développant une alternative synthétique de la membrane amniotique humain, il ya aussi la possibilité de concevoir en elle des caractéristiques souhaitables pour aider espérons la survie des cellules cultivées. La inclusion de microcaractéristiques au sein des dispositifs de biomatériaux pour le contrôle spécifique du comportement des cellules est un domaine d&#39;intérêt. De nombreux auteurs ont rapporté des travaux sur le développement des cellules souches artificielles niches 25-30. Ce groupe a récemment rapporté la création d&#39;un PEGDA fibronectine biofunctionalized limbe artificielle micro-usiné pour la livraison des cellules epitheliales limbiques et 22 une méthode pour la fabrication de membranes électrofilées biodégradables contenant des micro-usinés poches pour le support de cellules epitheliales limbiques 31. Le but de ce travail est de développer une nouvelle technologie de fabrication pour le développement de dispositifs biomatériaux contenant microcaractéristiques qui imitent dans une certaine mesure les micro-environnements dans lesquels les cellules souches se trouvent dans le corps. Nous avons développé une technique qui combine microstéréolithographie et électrofilature qui permet la fabrication de membranes biodégradables microstructurées qui montrent GREAt potentiel pour des applications de régénération tissulaire. Il est important de remarquer que, bien que dans ce travail de cette technique a été appliquée à la fabrication de plaques pour la régénération de la cornée, la technologie peut être appliquée à la fabrication de dispositifs pour la régénération d&#39;une large gamme de tissus épithéliaux, par exemple la peau, par voie orale épithélium muqueuse, de l&#39;intestin, des voies respiratoires, et de la vessie. Plus précisément, dans cette étude, nous avons mis au point une membrane synthétique biodégradable, qui fonctionne d&#39;une manière similaire à la membrane amniotique pour fournir des cellules de la cornée. Cette membrane contient micropoches de l&#39;ordre de 300 um (plus grand que les cryptes limbiques des Pallisades de Vogt (environ 150 pm)). Enfin, nous avons mis en place un protocole d&#39;emballage qui permet à ces membranes à être conservés à -20 ° C pendant plus de 6 mois sans montrer aucun signe de rupture.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:183px;">Name of&#160; reagents/material/equipment</td>
			<td style="width:173px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:180px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:183px;">Poly lactic-co-glycolic acid</td>
			<td style="width:173px;">Purac</td>
			<td style="width:157px;">PDLG5004</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:183px;">Dichloromethane</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich Or Fisher</td>
			<td style="width:157px;">270997 Or D/1850/17</td>
			<td style="width:180px;">&#62;99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser</td>
		</tr>
		<tr height="113">
			<td height="113" style="height:113px;width:183px;">Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board &#38; Starter Kit</td>
			<td style="width:173px;">Texas Instruments</td>
			<td style="width:157px;">1076N732 (UV)</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">473 nm Laser</td>
			<td style="width:173px;">Laser 2000</td>
			<td style="width:157px;">MBL-III</td>
			<td style="width:180px;">150 mW</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:183px;">Poly (ethylene glycol) diacrylate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">475629</td>
			<td style="width:180px;">Mn = 250g/mol&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">DEMEM + Glutamax</td>
			<td style="width:173px;">Fisher</td>
			<td style="width:157px;">12077549</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:183px;">Ham&#8217; s F12</td>
			<td style="width:173px;">Labtech biosera</td>
			<td style="width:157px;">LMH1236/500</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:173px;">Labtech biosera</td>
			<td style="width:157px;">FB-1090/50</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">EGF</td>
			<td style="width:173px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:157px;">236-EG-200</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Insulin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">91077C-1G</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Amphotericin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">A2942-100ml</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P0781-100ml</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="39" rowspan="2" style="height:39px;width:183px;">DAPI</td>
			<td rowspan="2" style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:157px;">32670</td>
			<td rowspan="2" style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P4864</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Thrombin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">T9326</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Fibrinogen</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">F3879</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">p63</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P3737</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">CK3</td>
			<td style="width:173px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:157px;">CLB218</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Hematoxylin</td>
			<td style="width:173px;">SLS</td>
			<td style="width:157px;">HHS16-500ML</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Eosin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">HT110232-1L</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:183px;">Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch</td>
			<td style="width:173px;">Riverside Medical Ltd. Derby, UK</td>
			<td style="width:157px;">Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50)</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:183px;">gamma- irradiation (Sterilisation)</td>
			<td style="width:173px;">Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) - external dose range of 25-40KGy</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:183px;">Silica gel orange</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">10087</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:183px;">Cobalt (II) chloride</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">232696</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:183px;">Copper (II) sulphate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">C-1297</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:183px;">Six spot humidity indicator card</td>
			<td style="width:173px;">SCC, USA</td>
			<td style="width:157px;">6HIC200</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:183px;">Vacuum heat seal machine</td>
			<td style="width:173px;">Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK</td>
			<td style="width:157px;">VS518</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:183px;">Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls</td>
			<td style="width:173px;">Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK</td>
			<td style="width:157px;">BR2805</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:183px;">Scanning Electron Microscopy (SEM)</td>
			<td style="width:173px;">Philips/FEI XL-20 SEM</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:183px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:173px;">Zeiss LSM 510 META</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:183px;">Videne Antiseptic Solution</td>
			<td>Ecolab, Swindon, UK</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;">3%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combination of microstereolithography and electrospinning to produce membranes equipped with niches for corneal regeneration

Problèmes de cornée touchent des millions de personnes dans le monde en réduisant leur qualité de vie de manière significative. Maladie de la cornée peut être causée par des maladies telles que Aniridie ou le syndrome de Steven Johnson, ainsi que par des facteurs externes tels que des brûlures chimiques ou de radiations. Les traitements actuels sont (i) l&#39;utilisation de greffes de cornée et (ii) l&#39;utilisation de cellules souches étendu dans le laboratoire et remis sur des supports (par exemple, la membrane amniotique); ces traitements sont relativement efficace, mais malheureusement, ils peuvent échouer au bout de 3-5 ans. Il est nécessaire de concevoir et de fabriquer de nouveaux dispositifs de biomatériaux capables de mimer la cornée en détail l&#39;environnement physiologique où les cellules souches se trouvent dans la cornée. Des cellules souches limbiques sont situés dans le limbe (zone circulaire entre la cornée et la sclère) dans des créneaux spécifiques connus sous le nom de Vogt palissades. Dans ce travail, nous avons développé une nouvelle technologie de plate-forme qui combine deux techniques de fabrication de pointe (microstéréolithographie et electrospinnING) pour la fabrication de membranes qui imitent la cornée dans une certaine mesure du limbe. Nos membranes contiennent micropoches artificiels dont le but est de fournir des cellules de protection comme le Palisades Vogt faire dans l&#39;œil.

Électrofilées microfabriqué anneaux ont été fabriqués en utilisant une combinaison de microstéréolithographie et électrofilage (figures 1 et 2). PEGDA anneaux de différentes tailles ont été fabriqués en utilisant microstéréolithographie (figure 3); Cette technique permet la fabrication de structures de l&#39;ordre du cm et l&#39;incorporation simultanée de microcaractéristiques. Dans ce cas, les anneaux de diamètres allant de 1,2 à 1,6 cm contenant micropoches de 350-500 um ont été fabriqués (Figure 4). En ce qui concerne la production, l&#39;emballage et la stérilisation de matériaux pour une utilisation clinique futur, il a été constaté que l&#39;emballage sous vide dans des sacs de qualité médicale améliorée de façon significative la capacité de réaliser un stockage à long terme des membranes de PLGA (figure 5); l&#39;utilisation d&#39;un sac de qualité médicale (PET / feuille d&#39;/ LDPE) ayant une épaisseur de 0,12 mm nous a permis d&#39;atteindre une durée de conservation plus longue. Cela a été étudié par l&#39;envoi membranes à nos collaborateurs en Inde et les membranes ont été stockés pendant une période de plusieurs mois à -20 ° C, à la température ambiante et à 37 ° C dans des conditions humides (délibérément un incubateur humide). figure 5 montre que l&#39;utilisation des conditions délibérément provocatrices de stockage à 37 ° C dans des conditions humides, les membranes sont stables pendant seulement environ 1 mois sous des conditions non emballé sous vide, mais atteint 3 mois de stockage sous des conditions emballés sous vide (figure 5 et tableau 1). Le tableau 1 montre l&#39;amélioration des conditions de stockage qui peuvent être atteints même dans des conditions choisies pour être propice à l&#39;absorption d&#39;eau et gonflement des fibres si on fait attention au choix de sac utilisé. Les anneaux en charge excroissance de cellules à partir d&#39;explants limbiques dans différentes conditions (i) des anneaux fraîchement préparés et (ii) des anneaux stockées pendant 6 mois (figure 6). transfert des cellules a été réalisée après 4 semaines quand placing les membranes PLGA sur les modèles 3D blessés. Les cellules ont grandi à partir des explants tissulaires placés sur des membranes créant un nouveau épithélium de la cornée préalablement dénudées (Figure 7). Positifs (cornées sans aucun traitement) et des contrôles négatifs (cornées blessés) ont également été maintenues en culture pendant les mêmes périodes de temps. Les contrôles négatifs ont confirmé l&#39;absence de formation d&#39;un épithélium neuf en l&#39;absence de cellules ajoutées. Immunocytochimie démontré que les cellules en croissance à partir des explants étaient des cellules épithéliales de la cornée, car ils étaient positifs pour la cornée marqueur de différenciation CK3 (Figure 7E). <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1: Schéma de microstéréolithographie mis en place pour la création de sonneries PEGDA. her.within page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2: Schéma de processus électrofilature utilisant des anneaux PEGDA microfabriqués tant que modèles. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3 (A) montre un exemple d&#39;un capteur statique (feuille d&#39;aluminium par électrolyse d&#39;anneaux PEGDA) pour le filage de membranes PLGA micro-usinés. (B) et (E) afficher différents tapis électrofilées être pelées à partir de capteurs statiques. (C) montre PEGDA modèles de tailles différentes mettant en évidence la souplesse d&#39;utilisation de microstéréolithographie pour la fabrication de la surface sous-jacente. (D) montre une réplique PLGA microfabriqué./files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4 Image MEB d&#39;un anneau PEGDA avec un microdétail de fer à cheval (A); fort grossissement image MEB d&#39;une poche microfabriquée (B). image en contraste de phase d&#39;un anneau PLGA microdétail de fer à cheval (C); image de contraste de phase à fort grossissement d&#39;une poche microfabriquée (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig4highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig5highres.jpg" width="500" /> Figure 5 Effet de la température et du temps sur le stockage de vide et non-emballés sous vide PLGA (50/50) des membranes (44 kg / mol) avec des micro-fabriqué des anneaux de plus de 6 mois. intégrité membranaire a été marqué comme fibres entièrement intacts (+++), une partie des fibres de gonflement (++), la fusion de la fibre (+) ou absence de fibres intacts (-). Images MEB et trois desséchants (silice d&#39;orange, de cobalt (II) chlorure et du sulfate de cuivre (II)) ne montrent pas de modifications de l&#39;intégrité ou de l&#39;humidité fibre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig5highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig6highres.jpg" width="500" /> Figure 6 montrant des images de fluorescence de LEC excroissance à partir d&#39;explants limbiques sur fraîchement préparés anneaux biodégradables PLGA (A, B) et sur ​​des anneaux au bout de 6 mois de stockage à -20° C (C, D). D&#39;images (A) et (B) correspondent à des cellules colorées avec du DAPI (bleu) et l&#39;iodure de propidium (rouge), respectivement. Image b est une vue orthogonale d&#39;un z-stack confocale d&#39;un explant placé sur une poche microfabriquée. Images (C) et (D) montrent une coloration positive pour p63 (vert). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig6highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig7highres.jpg" width="500" /> La figure 7 (A) montre un modèle de cornée de lapin blessé avec un anneau d&#39;échafaudage et des explants tissulaires situées sur l&#39;échafaudage, qui a été préalablement revêtu avec la colle de fibrine (B) et (C) sont des témoins positifs et négatifs. le contrôle positif est un nouveau rabbin<html> . t cornée et un contrôle négatif de la cornée, où l&#39;épithélium a été volontairement enlevée (le témoin négatif a été également mis en culture pendant 4 semaines) (D) est une image de H &amp; E d&#39;un tissu conçu cornée après 4 semaines de culture; la figure montre le nouvel épithélium multicouche formé par les cellules qui sortent des explants placés sur les niches (E) est une image de immunocytochimie montrant excroissance de cellules à partir d&#39;un explant limbique. noyaux sont colorés au DAPI (bleu) et les cellules montre une coloration positive pour la cytokératine 3, un marqueur de différenciation de la cornée (vert). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig7highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="611"><tbody><tr height="22"><td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:163px;"> PLGA (50/50) </td><html> x; &quot;&gt; intégrité de membranes à fibres stockées à 37 ° C humide </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"> Jour 0 </td><td style="width:64px;"> Mois 1 </td><td style="width:64px;"> Mois 2 </td><td style="width:64px;"> Mois 3 </td><td style="width:64px;"> Mois 4 </td><td style="width:64px;"> Mois 5 </td><td style="width:64px;"> Mois 6 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:163px;"> Non Sous vide </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr><tr height="67"><td height="67" style="height:67px;width:163px;"> Vacuumed (Sac A) (PE, PA composite) Epaisseur: 0.14 mm </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> + </td><td style="width:64px;"> - </td>64px; &quot;&gt; - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:163px;"> Vacuumed (sac B) (PET / feuille / LDPE) Epaisseur: 0,75 mm </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> + </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr></tbody></table> Tableau 1 Effet du vide et de stockage différents sacs sur l&#39;intégrité de PLGA (50/50) des membranes (44 kg / mol) ont examiné plus de 6 mois de stockage. Intégrité membranaire a été marqué comme fibres entièrement intactes (+++), un gonflement de la fibre (++), fusion des fibres (+) ou absence de fibres intacts (-).

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Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

Nous rapportons une technique pour la fabrication de micropoches dans les membranes électrofilées dans lequel étudient le comportement des cellules. Plus précisément, nous décrivons une combinaison de microstéréolithographie électrofilage et pour la production de PLGA (poly (lactide-co-glycolide)), des dispositifs de biomatériaux équipés de micro-caractéristiques de la cornée.

Combinaison de Microstéréolithographie et Électrofilage à produire des membranes Equipé Niches pour la régénération de la cornée

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.4K vues.  University of Sheffield.  Nous rapportons une technique pour la fabrication de micropoches dans les membranes électrofilées dans lequel étudient le comportement des cellules. Plus précisément, nous décrivons une combinaison de microstéréolithographie électrofilage et pour la production de PLGA (poly (lactide-co-glycolide)), des dispositifs de biomatériaux équipés de micro-caractéristiques de la cornée. 

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Electrospinning Fundamentals: Optimizing Solution and Apparatus Parameters

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. Electrospinning is a process in which a charged polymer jet is collected on a grounded collector; a rapidly rotating collector results in aligned nanofibers while stationary collectors result in randomly oriented fiber mats. The polymer jet is formed when an applied electrostatic charge overcomes the surface tension of the solution. There is a minimum concentration for a given polymer, termed the critical entanglement concentration, below which a stable jet cannot be achieved and no nanofibers will form - although nanoparticles may be achieved (electrospray). A stable jet has two domains, a streaming segment and a whipping segment. While the whipping jet is usually invisible to the naked eye, the streaming segment is often visible under appropriate lighting conditions. Observing the length, thickness, consistency and movement of the stream is useful to predict the alignment and morphology of the nanofibers being formed. A short, non-uniform, inconsistent, and/or oscillating stream is indicative of a variety of problems, including poor fiber alignment, beading, splattering, and curlicue or wavy patterns. The stream can be optimized by adjusting the composition of the solution and the configuration of the electrospinning apparatus, thus optimizing the alignment and morphology of the fibers being produced. In this protocol, we present a procedure for setting up a basic electrospinning apparatus, empirically approximating the critical entanglement concentration of a polymer solution and optimizing the electrospinning process. In addition, we discuss some common problems and troubleshooting techniques.

Electrospinning techniques can create a variety of nanofibrous scaffolds for tissue engineering or other applications. We describe here a procedure to optimize the parameters of the electrospinning solution and apparatus to obtain fibers with the desired morphology and alignment. Common problems and troubleshooting techniques are also presented.

Fondements Électrofilage: Solution Optimisation et paramètres Appareillage

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. ...

Recherche

Bio-ingénierie

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

L&#39;utilisation de cellules souches humaines périvasculaires pour la régénération osseuse

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Conception d&#39;un bioréacteur pour la pression cyclique Ex Vivo Étude des valves cardiaques aortiques

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is presented. The polymerization from the membrane surface is induced by plasma treatment of the membrane, followed by reacting the membrane surface with a methanolic solution of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Special attention is given to the process parameters for the plasma treatment prior to the polymerization on the surface. For example, the influence of the plasma-treatment on different types of membranes (e.g.&#160;polyester, polycarbonate, polyvinylidene fluoride) is studied. Furthermore, the time-dependent stability of the surface-grafted membranes is shown by contact angle measurements. When grafting poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) in this way, the surface can be further modified by esterification of the alcohol moiety of the polymer with a carboxylic acid function of the desired substance. These reactions can therefore be used for the functionalization of the membrane surface. For example, the surface tension of the membrane can be changed or a desired functionality as the presented light-responsiveness can be inserted. This is demonstrated by reacting PHEMA with a carboxylic acid functionalized spirobenzopyran unit which leads to a light-responsive membrane. The choice of solvent plays a major role in the postmodification step and is discussed in more detail in this paper. The permeability measurements of such functionalized membranes are performed using a Franz cell with an external light source. By changing the wavelength of the light from the visible to the UV-range, a change of permeability of aqueous caffeine solutions is observed.

A plasma-induced polymerization procedure is described for the surface-initiated polymerization on polymer membranes. Further postmodification of the grafted polymer with photochromic substances is presented with a protocol of conducting permeability measurements of light-responsive membranes.

Préparation des membranes sensibles à la lumière par une greffe de surface combiné et processus Modification ultérieure

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De Fluorescence Imaging rapide à moléculaire loi Diffusion sur les membranes cellulaires en direct dans un microscope commercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingénierie 3D cellularisé collagène Gels pour la régénération tissulaire vasculaire

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

Adapter le processus Électrofilage de fournir trois environnements uniques pour un Tri-couches<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle du mur Airway

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP induces a noninvasive region for charged biomolecules (i.e., the ion depletion zone), and targets can be preconcentrated on this region boundary. Despite the high preconcentration performances with ICP, it is difficult to find the operating conditions of non-propagating ion depletion zones. To overcome this narrow operating window, we recently developed a new platform for spatiotemporally fixed preconcentration. Unlike preceding methods that only use ion depletion, this platform also uses the opposite polarity of the ICP (i.e., ion enrichment) to stop the propagation of the ion depletion zone. By confronting the enrichment zone with the depletion zone, the two zones merge together and stop. In this paper, we describe a detailed experimental protocol to build this spatiotemporally defined ICP platform and characterize the preconcentration dynamics of the new platform by comparing them with those of the conventional device. Qualitative ion concentration profiles and current-time responses successfully capture the different dynamics between the merged ICP and the stand-alone ICP. In contrast to the conventional one that can fix the preconcentration location at only ~5 V, the new platform can produce a target-condensed plug at a specific location in the broad ranges of operating conditions: voltage (0.5-100 V), ionic strength (1-100 mM), and pH (3.7-10.3).

The protocol for a novel ion concentration polarization (ICP) platform that can stop the propagation of the ICP zone, regardless of the operating conditions is described. This unique ability of the platform lies in the use of merging ion depletion and enrichment, which are two polarities of the ICP phenomenon.

Fusion Ion Concentration Polarisation entre juxtaposées échangeuses d&#39;ions Membranes pour bloquer la propagation de la Zone Polarisation

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

Synthèse des hydrogels avec des propriétés antisalissure Membranes pour la purification de l&#39;eau

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Faire fondre électrofilage écrit d’échafaudages Poly(ε-caprolactone) en trois dimensions avec des Morphologies contrôlables pour les Applications de génie tissulaire

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...