Ce protocole de culture cellulaire est conçu pour empêcher les cellules endothéliales cornéeles de subir une transition épithéliale à mésenchymale pendant l’isolement, l’expansion et la sous-culture. Les cultures cellulaires sont établies à partir d’explantations de tissus cornéens, qui peuvent être réutilisées pour assurer un approvisionnement continu en cellules primaires à partir d’un donneur. Commencez par enduire les puits d’une plaque de culture tissulaire de six puits avec le facteur d’attachement en utilisant les instructions du fabricant.
Ajoutez ensuite un millilitre de milieu de culture à chaque bien codé. Placer le côté endothélium de la cornée vers le haut dans une boîte de Pétri stérile sur la scène d’un microscope disséquant. Ajustez l’éclairage de sorte que la surface cornéenne soit bien éclairée avec un contraste suffisant pour mettre en évidence la couche endothéliale, et ajustez le zoom de sorte que le bord et un certain endothélium cornéen central est en vue.
Utilisez des forceps d’horlogers stérilisés pour soulever et arracher doucement la membrane de Descemet du stroma sous-jacent. Placez la bande membranaire dans l’un des puits préparés de la plaque de culture, en vous assurant de remplacer immédiatement le couvercle de la plaque afin de réduire le risque de contamination. Retirez d’abord les bandes de la membrane de Descemet de la périphérie extrême de l’endothélium, puis des régions centrales, en plaçant toutes les bandes d’une cornée dans un seul puits.
Une fois terminé, incuber les explants dans un incubateur humidifié de culture cellulaire fixé à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Assembler la chambre haute de la chambre micro Boyden en plaçant un anneau rouge O dans son centre. Utilisez une tréphine de 18 millimètres de diamètre pour percer un disque à partir d’une feuille de biomatériau sur une planche à découper PTFE.
Ensuite, placez le disque sur l’anneau rouge O dans la chambre haute de la chambre boyden micro. Vissez la chambre basse sur la chambre haute, en sécurisant le disque du matériau bio entre les deux. Et tremper la chambre micro Boyden assemblée dans 70% d’éthanol pendant une heure pour la stériliser.
Après le trempage, plonger complètement la chambre dans le HBSS stérile pendant 10 minutes pour enlever l’éthanol. Ensuite, laver la chambre dans le milieu de la culture pendant 10 minutes. Et le transfert à la culture milieu à l’intérieur d’un puits d’une plaque de six puits, en s’assurant que la chambre haute est orientée vers le haut.
Ajustez le niveau du milieu de sorte qu’il entre en contact avec la surface inférieure de la membrane biomatériale, mais ne s’écoule pas dans la chambre haute. Pipette 100 microlitres de suspension cellulaire sur la membrane dans la chambre micro Boyden, et l’incuber dans l’incubateur de culture tissulaire pendant quatre heures, avant d’ajouter moyen pour submerger complètement la chambre. La plupart des explants qui ont été dérivés des cornées d’un à deux ans moutons ou donneurs humains de moins de 30 ans attachés à des plaques de culture de tissu codé facteur d’attachement dans la semaine.
Après six semaines, de nombreuses petites cellules serrées étaient présentes à côté de l’explant. Les petites cellules serrées dans les cultures cellulaires endothéliales cornéeles sont résistantes à la digestion avec triple, tandis que les plus grandes cellules fibroblastiques sont plus sensibles à elle. Cette différence a été exploitée pour éliminer sélectivement les grosses cellules des cultures avant de transférer les cellules plus petites vers de nouvelles plaques.
Des analyses immunisées de flourescence ont été conduites sur des cultures endothéliales cornéennes de cellules pour localiser ZO-1, une protéine serrée de jonction, et N-cadherin, une protéine de jonction d’adhérence. Les mêmes anticorps ont été utilisés pour les cellules ovines et humaines, et les deux protéines ont été détectées dans les membranes plasmatiques des cellules des deux espèces. La chambre de micro Boyden sur mesure permettait aux deux côtés d’une membrane d’être utilisés simultanément comme surfaces de culture cellulaire.
Une vue transversale d’une construction de cellule machinée de tissu montre une seule couche des cellules endothéliales cornéeles sur une surface, et une culture multicouche des cellules stromal cornéeles de l’autre. Lorsque vous essayez ce protocole, il est important d’éviter de racler l’endothélium avec vos forceps lorsque vous épluchez la membrane de Descemet loin de la cornée. Après cette procédure, l’intégrité d’une couche de cellules endothéliales cornéeennes sur une membrane peut être vérifiée en mesurant sa résistance électrique.
