This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été effectuées en conformité avec la Politique sur la protection des animaux soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire exposés par le Bureau de la protection des animaux de laboratoire (NIH) et seulement avec l&#39;approbation du Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC) de l&#39;Université de Connecticut Health Center. 1 Préparation de cultures gliales mixtes <ol><li> Stériliser tous les instruments avant de les utiliser. Ajouter 3 ml de solution glacée stérile de sel équilibrée de Hank (HBSS) ne contenant pas de cations (Mg2 + ou Ca2 +) à 60 mm de trois boîtes de Pétri stériles maintenus sur de la glace pour conserver au froid. </li><li> Isoler les cortex de souriceaux P0-P2 postnatales, comme décrit précédemment 17,18. REMARQUE: les structures sous-corticales, comme les hippocampes, ne sont pas inclus dans ces cultures. </li><li> Retirez délicatement les méninges et ensuite transférer les cortex isolés de HBSS frais et dissocier les tissus par voie enzymatique, en utilisant une amendeKit de dissection tissulaire ural selon le protocole du fabricant. </li><li> Plaque de cellules stériles dans des flacons T-175 et incuber pendant une nuit dans un milieu [milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) contenant 1 x pénicilline / streptomycine]. </li><li> Remplacer tous les médias le lendemain avec des milieux frais. Continuer à incuber les cultures, avec les changements de supports réguliers, pendant environ 3 semaines ou jusqu&#39;à une monocouche cellulaire est établie. NOTE: Cette monocouche sera composé des astrocytes et la microglie avec une participation d&#39;environ 10: 1 19. </li></ol> 2. Globoid induction de cellules dans les cultures gliales mixtes <ol><li> Préparer les lamelles ECM-enduit. <ol><li> Tremper les lamelles circulaires avec 1 acide stérile N chlorhydrique (HCl) dans une boîte de Pétri stérile pendant 30 min. Laver lamelles avec 3x d&#39;eau stérile, puis tremper dans EtOH à 95% pendant au moins 20 min. puis laisser sécher à l&#39;air. </li><li> La place des gouttelettes de matr extracellulaire diluéix matériaux (ECM) de la protéine de revêtement sur ​​une feuille de Parafilm (par exemple, 150 à 250 pl / gouttelette de la laminine de 10 pg / ml dissous dans une solution tampon de phosphate stérile [PBS]). Distribuez les gouttelettes de telle sorte que les lamelles ne toucheront pas lorsqu&#39;il est placé sur ces gouttelettes. Placez délicatement chaque lamelle séché sur une gouttelette en utilisant une pince. </li><li> Laissez les lamelles sur les gouttelettes pendant env. 4-6 h dans la hotte de culture avec la ceinture fermée. </li><li> Placer les lamelles de l&#39;ECM (ECM revêtu revêtu vers le haut) dans chacun des puits d&#39;une plaque à 24 puits. Laver chaque puits avec du PBS stérile 3x et conserver à 4 ° C jusqu&#39;au moment de servir. </li></ol></li><li> Préparation des cellules gliales pour placage sur des lamelles. <ol><li> Aspirer les médias des cultures gliales et laver délicatement les 3x monocouches gliales avec 10 ml de PBS stérile. Ensuite, ajoutez 8-10 ml de solution de trypsine-EDTA à la T-175, et incuber pendant 5-10 min à 37 ° C. </li><li> Lorsque la plupart de la monocouche a été détaché, ajouter 20 ml de milieu completà arrêter le ballon à la trypsine. Recueillir les médias contenant les cellules individuelles dans un tube conique de 50 ml et tourner pendant 10 min à 300 g à la température ambiante. </li><li> Aspirer le surnageant sans déranger le culot, puis remettre en suspension les cellules dans 2 ml de milieu complet frais à la pipette doucement la solution à l&#39;aide d&#39;une pipette P1000. </li><li> Déterminer le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre et ensuite remettre en suspension les cellules dans du milieu complet à la densité souhaitée (par exemple 10 5 cellules / ml). Plate cellules sur les lamelles de l&#39;ECM enduit (par exemple 500 pi dans chaque puits de la plaque de 24 puits). Ajouter des milieux complets frais supplémentaires à chaque puits pour 3-5 jours d&#39;incubation à 37 ° C, ou jusqu&#39;à ce que les cellules se développent à la confluence visuel désiré. </li></ol></li><li> Le traitement par psychosine. <ol><li> Reconstituer le psychosine à une concentration de stock (108,3 mM) dans du diméthylsulfoxyde (DMSO). Diluer ce stock dans EtOH à 100% pour faire un bouillon de travail qui peut l&#39;n est ajoutée dans chaque puits d&#39;une plaque à 24 puits pour obtenir une concentration finale de 10 uM. </li><li> Au moment de l&#39;addition du psychosine, agiter doucement la plaque de culture de mélanger le psychosine dans le milieu de culture. Compléter la psychosine en ajoutant l&#39;équivalent de 10 uM tous les deux jours pendant une semaine. </li></ol></li><li> Après 7 jours de traitement psychosine, recueillir les médias et pipette 500 ul de paraformaldéhyde 4% froid (PFA) dans chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 20 min pour fixer les cellules. Ensuite, lavez chaque puits 3 fois avec du PBS, puis conserver leurs plaques à 4 ° C jusqu&#39;à sa transformation pour immunocytochimie (voir ci-dessous). REMARQUE: milieux de culture cellulaire peuvent être collectées pour enzymatique ou test ELISA à ce point, si désiré. </li></ol> 3. immunocytochimie (ICC) pour visualiser les cellules Globoid <ol><li> Remplacer PBS avec du tampon de blocage [PBS + 0,3% de Tween-20 + 5% de sérum normal de chèvre (NGS)], et on incube les cellules pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Danscubate les cellules fixées à des antiserums primaires contre Iba-1 [(1: 1000) dilué dans du PBS + 0,3% de Tween-20 + 2% de NGS] pendant au moins 1 heure à température ambiante, puis laver chaque puits avec du PBS 3 x 5 min / laver. </li><li> Ajouter l&#39;anticorps secondaire conjugué à fluorescence approprié pour identifier le marquage de l&#39;anticorps et de la contre-colorant primaire avec 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 1: 1000) pour identifier les noyaux. Incuber dans une solution d&#39;anticorps secondaire pendant 1 heure à température ambiante et laver avec du PBS 3 x 5 min. </li><li> Montez chaque lamelle lames de microscope en utilisant un support de montage. Voir glisse sur un microscope à fluorescence pour des analyses visuelles et quantitatives. </li></ol> 4 Analyse et caractérisation des cellules en culture primaire Globoid <ol><li> Utilisez les trois critères morphologiques suivants pour identifier une cellule globoïde dans la culture: <ol><li> Identifier les cellules globoïdes utilisant la microscopie à fluorescence par étiquetage immunopositif pour le marqueur de la microglie, Iba-1 +. </li><li> Identifiercellules globoïdes que polynucléaires (c. contenant deux ou plusieurs noyaux positifs DAPI). </li><li> Identifier les cellules globoïdes par une morphologie arrondie distincte de l&#39;aspect très ramifié de cellules au repos microgliales. REMARQUE: Les cellules peuvent également être collectés pour l&#39;analyse et la quantification des marqueurs de surface cellulaire par cytométrie en flux à partir de ces cultures. </li></ol></li><li> Mesure de l&#39;activation de la microglie et de phagocytose des cellules globoïdes <ol><li> Pour évaluer l&#39;activité phagocytaire des cellules microgliales traitées de psychosine, ajouter des perles de latex marqués au FITC dans les puits selon les instructions du fabricant. Ajouter des billes de latex fluorescentes conjuguées 48 heures avant la fixation de PFA. Fixer les cellules traitées avec des perles (comme indiqué à la section 2.4), et le processus d&#39;immunocytochimie (comme décrit dans la section 3). </li><li> Sélectionner des anticorps secondaires conjugués à un fluorophore de sorte qu&#39;ils ne se chevauchent pas les spectres d&#39;émission de fluorescence des perles de fluorophores marqué. </li><li> Analyze les profils de phagocytose des Iba-1 + microglie par l&#39;identification des cellules qui co-localisent avec les billes marquées par fluorescence. REMARQUE: psychosine va activer la microglie. Perles phagocytés seront identifiés dans Iba-1 + les cellules mononucléées et multinucléées dans ce cadre de la culture. </li></ol></li></ol> 5. induction de cellules Globoid de cultures purifiée microgliales REMARQUE: Une autre approche de déchiffrer la signalisation intercellulaire entre les astrocytes et la microglie est un autre avantage de cette vitro globoïde modèle cellulaire. Purification des cellules microgliales primaires pour réensemencement ou la co-culture peut être réalisé par leur propriété d&#39;adhérence plus faible dans la culture, comme décrit dans les étapes suivantes (voir la section 5.2). <ol><li> Recueillir les médias dans les cultures mixtes gliales confluentes dans 50 ml tube conique et la maintenir à 37 ° C dans l&#39;incubateur. </li><li> Isolation de la microglie de cultures mixtes gliales primaires.<ol><li> Après avoir enlevé le support à partir d&#39;une culture gliale ballon T175 confluent mixte, ajouter supports serrant chauds [constitués de milieu complet 25 mM + 4 (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) + 25 mM de bicarbonate de sodium (Sigma)]. Agiter les flacons pour 3-4 heures dans un agitateur orbital à 100 tours par minute (37 ° C). Recueillir les médias de ces flacons secoués dans 50 ml tubes coniques. NOTE: Ce support inclura la microglie moins adhérente des flacons. </li><li> Spin médias à 300 g pendant 10 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 2 ml du milieu conditionné d&#39;astrocytes (collectées à l&#39;étape 5.1). </li><li> Établir le nombre de cellules acquises à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre et plaque les cellules microgliales sur des lamelles de substrat enduit (voir section 2.1) pour immunocytochimie, ou la plaque sur UltraLow ​​plaques respect de puits pour la collecte future des cellules globoïdes de co-culture avec d&#39;autres types de cellules, telles que les oligodendrocytes (comme described dans la section suivante). REMARQUE: Une fois plaqué la microglie peut être traitée avec psychosine (10 M) tel que décrit ci-dessus (voir section 2.3). </li></ol></li><li> Co-culture avec des oligodendrocytes primaires pour l&#39;analyse de cytotoxicité. REMARQUE: Collection de microglie de psychosine traitée à partir des plaques de faible adhérence pour la co-culture subséquente sur des cultures primaires d&#39;oligodendrocytes ou des cellules oligodendrocytes progénitrices, peut être utilisé pour étudier la fonction de potentiel cytotoxique de ces cellules globoïdes, comme in vitro. <ol><li> Développer des cultures d&#39;oligodendrocytes primaires en utilisant des méthodes établies 18,20. Pour recueillir les cellules microgliales traitées de psychosine, pipeter doucement pour détacher les cellules faiblement adhérentes à partir du fond des puits. Recueillir les cellules, centrifuger à 300 g pendant 10 min, puis remettre en suspension attentivement dans les médias de la différenciation des oligodendrocytes [composé de Neurobasal médias, L-glutamine (1x), B-27 supplément (1x) et triiodothyronine (T3, 10 ng / ml )]. </li><li> Compter le nombre de cellules en utilisant un hématimètre puis ensemencer les microglies sur la culture d&#39;oligodendrocytes à 1 x 10 5 cellules / ml, ce qui entraîne un approximatif de 1: 2 microglie / rapport des oligodendrocytes. Incuber à titre de co-culture pendant 3 jours. </li><li> Fixer les cellules pour immunocytochimie (voir section 2.4). Recueillir les milieux de culture cellulaire pour ELISA ou analyse chimique selon les besoins. </li></ol></li></ol>

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The authors declare no conflicts of interest.

Le protocole décrit ici fournit un nouveau système modèle pour étudier le développement et la caractérisation fonctionnelle de la microglie et les cellules activées globoïdes. Des travaux antérieurs par Im et al. en utilisant une lignée cellulaire HEK293 a fourni un modèle pour le développement du présent Protocole pour l&#39;étude de la formation des cellules globoïde 21. Il est également important de souligner que les cellules globoïdes dérivés dans le modèle diffèrent des cell...

Leucodystrophie à cellules globoïdes (GLD), également connue comme la maladie de Krabbe, est une maladie démyélinisante mortelle résultant de la perte de mutations de fonction dans le galatocerebrosidase (GalC) une gène. La forme la plus répandue de GLD est la variante infantile qui est caractérisée par l&#39;apparition de la petite enfance et se caractérise par une évolution clinique agressive de moteur et le déclin cognitif conduisant à la mort prématurée souvent avant cinq ans de 2,3 ans. Les tests génétiques sont utilisés pour vérifier un diagnostic de GLD 4. Neuropathologie de GLD révèle démyélinisation répandue, l&#39;atrophie neuronale, astrogliose et la présence de la microglie multi-nucléées engorgés appelé cellules globoïdes 5-7. L&#39;identification des cellules globoïdes, contenant souvent des inclusions tubuleuses dans leur cytoplasme, a été un élément déterminant de GLD pour les 97 dernières années, bien que la fonction spécifique de ces cellules visibles est resté inaccessible. La participation des non-MYELnaires gliales (astrocytes) et la microglie dans la pathogenèse de GLD a longtemps été considéré comme une réponse secondaire à la démyélinisation profonde dans cette maladie 8. Fait intéressant, la première description de cette maladie, faite par Knud Krabbe en 1916 5, la formation rapporté des phagocytes multinucléées contenant des débris de lipides qui ont été nommé «cellules globoïdes» et sont l&#39;une des caractéristiques de cette maladie. Cellules globoïdes sont le symptôme caractéristique de GLD pathologie, bien que leur rôle dans la GLD a longtemps été ignorée. Fait intéressant, ces cellules sont parmi les premiers changements caractéristiques dans les tissus du système nerveux central de GLD. Ce manque de connaissances peut être dû à l&#39;hypothèse que la formation des phagocytes multinucléées, appelées cellules géantes dans d&#39;autres maladies, sont généralement considérée comme une conséquence de la pathologie plutôt qu&#39;une force motrice pathogène initial 9. Par conséquent, il ya eu peu d&#39;études du mécanisme par whicellules globoïdes ch sont formées à partir des phagocytes, en particulier dans le système nerveux central de GLD. La procédure décrite dans le présent rapport met l&#39;accent sur ​​l&#39;importance de la formation des cellules globoïdes dans le SNC et notre démonstration précédente que de multinucléation induite psychosine-des microglies in vitro et ces cellules ont un sens élevé de l&#39;activité phagocytaire. En accord avec ces observations, les cellules globoïdes dans le cerveau twitcher contiennent souvent des débris de PAS-positif, suggérant des niveaux élevés de l&#39;activité phagocytaire. Cellules globoïdes sont également avérés immunopositif pour la ferritine (un marqueur de la microglie) 10, KP-1 / CD68 (un marqueur des monocytes), et certains sont également positives pour la vimentine (une protéine intermédiaire du filament et un marqueur des astrocytes et la microglie activée) 11, HLA-DRA (un récepteur de surface MHCII), le TNF-α et 7, et Iba-1 (une protéine de liaison de calcium utilisé pour identifier les cellules microgliales) 12. Sur la base de cette collection de marqueurs, les cellules globoïdes proviennent de la microglie qui se développentun phénotype unique. En dépit de leur caractère unique, la fonction spécifique et la contribution de GC à GLD pathogenèse a été largement négligé. Cellules globoïdes ont été pensé pour être une conséquence secondaire de démyélinisation chronique. Toutefois, des études antérieures portant sur le lien temporel de cellules globoïdes à la question pathologie blanc de GLD ont identifié la présence de cellules globoïdes à la fin du embryonnaire à la période postnatale précoce; fois précédentes oligodendrocytes apoptose et une démyélinisation manifeste 13. Ainsi, la séquence temporelle de développement de la neuropathologie dans GLD suggère que les cellules globoïdes sont formés à l&#39;avance de la démyélinisation dans la maladie 14. Cela a conduit à notre hypothèse que la formation précoce des cellules globoïdes dans GLD peut représenter un événement pathogène plutôt que de définir une réponse réactive secondaire à des lésions des oligodendrocytes 15. En outre, la dérégulation de l&#39;activité de la microglie dans GLD a été considéré comme un faitr limitant l&#39;efficacité à long terme des thérapies de cellules souches hematopeotic pour le traitement de cette maladie 16. Ainsi, l&#39;étude des fonctions cellulaires et la régulation de la microglie et les cellules globoïdes, en réponse à psychosine devrait fournir de nouvelles perspectives dans la pathogenèse de GLD. Jusqu&#39;à récemment, l&#39;absence d&#39;un modèle approprié pour étudier la formation des cellules globoïdes avait limité la compréhension de la fonction précise et la contribution de ces cellules à la pathologie de la GLD. Dans des études récentes, il a été déterminé que les cellules globoïdes analogue peuvent être formées en réponse directe à la psychosine, une toxine pathogène lipidique qui s&#39;accumule dans GLD. Nous avons constaté que la microglie, des macrophages, mais non, sont activés et transformés dans des cellules globoïdes dans les cultures gliales primaires en réponse à psychosine 15. Cette transformation en cellules globoïdes a été trouvé pour être médiée par la protéase extracellulaire, la matrice métalloprotéinase (MMP) -3 15. Plus récemment, nousont étendu ces résultats et déterminé que les cellules de la microglie et globoïdes psychosine activé développés dans ce système in vitro de modèle sont puissamment toxique pour les oligodendrocytes et les cellules progénitrices oligodendrocytes. Par conséquent, lorsqu&#39;il est considéré dans le contexte de GLD, l&#39;accumulation rapide de psychosine et la formation de cellules globoïdes avant démyélinisation appuierait un rôle principal et éventuellement pathogène émergent de la microglie dans cette maladie. Nous proposons que l&#39;étude de la formation des cellules globoïde va révéler de nouvelles informations sur la pathogenèse de GLD qui contribuera à notre compréhension de cette maladie. En outre, ce nouveau modèle cellulaire de GLD peut fournir un nouveau format à partir de laquelle de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter des changements pathologiques dans cette maladie pourraient être testés. Par conséquent, dans ce rapport, nous proposons un protocole détaillé pour le développement in vitro de cellules globoïdes induite psychosine-de cultures primaires de cellules gliales non-myélinisation.

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		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:500px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+).&#160;</td>
			<td style="width:297px;">Life technologies</td>
			<td style="width:87px;">14175-095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neural Tissue Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-092-628</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40 uM cell-strainer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363547</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+).&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15070-063</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25299-056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Psychosine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9256</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>19208</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PCN5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iba-1</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>019-19741</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor conjugated antisera</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Various</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Media</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>OB100-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phagocytic Assay Kit</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>500290</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BP310-500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for the study of cellular pathophysiology in globoid cell leukodystrophy

La fonction précise de la microglie multi-nucléées, appelées cellules globoïdes, qui sont uniquement abondant dans le système nerveux central de la leucodystrophie à cellules globoïdes (GLD) n&#39;est pas claire. Cette lacune dans les connaissances a été entravée par l&#39;absence d&#39;un modèle in vitro approprié pour l&#39;étude. Nous décrivons ici un système de culture primaire gliale de souris dans lesquelles un traitement avec des résultats psychosine multinucléation de la microglie ressemblant aux cellules globoïdes caractéristiques trouvées dans GLD. L&#39;utilisation de ce nouveau système, nous avons défini les conditions et les modes d&#39;analyse pour l&#39;étude des cellules globoïdes. L&#39;utilisation potentielle de ce système modèle a été validé dans notre précédente étude, qui a identifié le rôle potentiel de la métalloprotéinase matricielle (MMP) -3 GLD. Ce roman système in vitro peut être un modèle utile pour l&#39;étude de la formation et de la fonction, mais aussi la manipulation thérapeutique potentielle, de ces cellules uniques.

Ce protocole, tel qu&#39;il est rédigé, devrait prendre environ 36 jours pour terminer du début à la fin (Voir Figure 1: Schéma expérimental de workflow). Il a été notre expérience que le développement des cellules «globoïde-comme» dans ce système de culture primaire est à la fois fiable et reproductible: la formation de cellules multinucléées en réponse à psychosine est toujours observé avec 7 jours de traitement. Coloration immunocytochimique de la micr...

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An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle pour l&#39;étude de la physiopathologie cellulaire en cellules globoïdes Leucodystrophie

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

7.8K vues.  University of Connecticut Health Center. Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells. 

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An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Un modèle Optic Nerve Crush blessures murins pour étudier la rétine de survie des cellules ganglionnaires

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Recherche

Neurosciences

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

Génération d&#39;une ligne Immortalisé microvasculaire murin des cellules endothéliales du cerveau comme un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle barrière hémato-encéphalique

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Le système olfactif comme un modèle pour étudier des modèles axonale croissance et la morphologie<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Les ganglions rachidiens neurones et les cellules souches différenciées dérivées de tissu adipeux: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-culture modèle pour étudier la régénération des nerfs périphériques

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

In Vitro Modélisation de Cancerous Neural Invasion: Le ganglion de racine dorsale Modèle

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

Le Neuron-astrocyte indirecte coculture Assay: Un<em&gt; In vitro</em&gt; Mise en place pour l&#39;investigation détaillée des interactions Neuron-glie

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

In Utero électroporation approches pour étudier l&#39;excitabilité des neurones sous - populations et connectivité unicellulaire

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Augmentation de la réponse du réseau à la stimulation des cultures cellulaires neuronales sur les tableaux de microélectrodes

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at cellular and subcellular resolution. Advances in molecular and imaging technologies have allowed us to gain numerous detailed insights into cellular and molecular mechanisms of brain development in the transparent zebrafish embryo. Recently, processes of refinement of neuronal connectivity that occur at later larval stages several weeks after fertilization, which are for example control of social behavior, decision making or motivation-driven behavior, have moved into focus of research. At these stages, pigmentation of the zebrafish skin interferes with light penetration into brain tissue, and solutions for embryonic stages, e.g., pharmacological inhibition of pigmentation, are not feasible anymore.
Therefore, a minimally invasive surgical solution for microscopy access to the brain of awake zebrafish is provided that is derived from electrophysiological&#160;approaches. In teleosts, skin and soft skull cartilage can be carefully removed by micro-peeling these layers, exposing underlying neurons and axonal tracts without damage. This allows for recording neuronal morphology, including synaptic structures and their molecular contents, and the observation of physiological changes such as Ca2+ transients or intracellular transport events. In addition, interrogation of these processes by means of pharmacological inhibition or optogenetic manipulation is feasible. This brain exposure approach provides information about structural and physiological changes in neurons as well as the correlation and interdependence of these events in live brain tissue in the range of minutes or hours. The technique is suitable for in vivo brain imaging of zebrafish larvae up to 30 days post fertilization, the latest developmental stage tested so far. It, thus, provides access to such important questions as synaptic refinement and scaling, axonal and dendritic transport, synaptic targeting of cytoskeletal cargo or local activity-dependent expression. Therefore, a broad use for this mounting and imaging approach can be anticipated.

Here we present a method to image the zebrafish embryonic brain in vivo upto larval and juvenile stages. This microinvasive procedure, adapted from electrophysiological approaches, provides access to cellular and subcellular details of mature neuron and can be combined with optogenetics and neuropharmacological studies for characterizing brain function and drug intervention.

Imagerie in vivo de tissu cérébral entièrement actif chez des larves et des juvéniles de poissons-zèbres éveillés par enlèvement du crâne et de la peau

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...