Les travaux menant à cette publication a bénéficié d&#39;un financement du programme Marie Curie COFUND &quot;U-Mobilité», cofinancé par l&#39;Université de Malaga et le programme de l&#39;Union européenne 7 e programme-cadre (FP7/2007-2013) sous AG n ° 246550. Le travail dans notre laboratoire est financé par des subventions des NIH, l&#39;USDA / NIFA, NSF, BARD, et BSF à VC

Une. L&#39;expression des protéines <ol><li> Choix du système d&#39;expression Sélectionnez le système, c&#39;est à dire, des vecteurs et la méthode de délivrance de vecteur, le mieux adapté pour l&#39;expression de la protéine d&#39;intérêt dans l&#39;organisme modèle / cellule spécifique. A noter que notre dosage nécessite l&#39;expression des protéines testées dans des quantités facilement détectables, ce qui est mieux réalisée par transformation transitoire de grands nombres de cellules. Chez les plantes, par exemple, cela est le mieux réalisée en utilisant des plasmides binaires en tant que vecteurs d&#39;expression et Agrobacterium comme système de délivrance. </li><li> Construction de vecteurs d&#39;expression binaires, Cloner la séquence (s) codante de la protéine (s) d&#39;intérêt dans un vecteur d&#39;expression, seul ou en fusion traductionnelle d&#39;une étiquette d&#39;épitope. Utilisation des vecteurs appropriés pour le système d&#39;expression choisi et les procédures standard de biologie moléculaire pour le clonage de gène. Pour la livraison de gène au moyen d&#39;Agrobacterium, employer des vecteurs binaires et leur présenter, en utilisant également standard protocoles, dans une souche d&#39;Agrobacterium, tels que EHA105, pour l&#39;inoculation ultérieure de tissus végétaux. </li><li> Choix des espèces végétales Sélectionner les espèces de plantes dans lesquelles la protéine (s) d&#39;intérêt est exprimé. Notez que, bien que toutes les espèces de plantes sensibles à la transformation génétique par Agrobacterium peuvent être utilisées, les espèces de plantes de choix est Nicotiana benthamiana, qui est facile à cultiver, très sensibles à Agrobacterium, et a de grandes feuilles qui sont facilement inoculées. </li><li> La croissance des plantes Cultiver une plante pour 4 à 6 semaines dans une casserole avec le Pro-Mix BX dans un pot (20 cm x 20 cm x 20 cm) dans des conditions respectueuses de l&#39;environnement contrôlé (par exemple, la chambre de croissance) de journée (soit 16 h de 130 -150 uE m-2 s-1 lumière à 23 ° C et 8 h d&#39;obscurité à 20 ° C) et 40-65% d&#39;humidité relative. 1.5.2 Fertiliser parfois avec des produits disponibles dans le commerce par les instructions du fabricant. Une fois que la plante est cultivée, sélectionnezfeuilles avec la taille de 50 mm x 70 mm ou plus (ces mesures de longueur ne comprennent pas le pétiole) pour inoculation d&#39;Agrobacterium. </li><li> Inoculation avec Agrobacterium Cultiver la souche d&#39;Agrobacterium hébergeant la construction binaire exprimant la protéine (s) testé à l&#39;étape 1.3 pendant une nuit à 28 ° C dans du milieu YEP (1% de peptone, 1% d&#39;extrait de levure et 0,5% de NaCl) supplémenté avec des antibiotiques appropriés (par exemple, 100 mg / L de streptomycine et 10 mg / L de rifampicine pour les vecteurs à base de pPZP-RSC2 24-25). 1.6.2 centrifuger les cellules, remises en suspension à DO 600 = 0,5 dans un tampon d&#39;infiltration [10 mM de MgCl2, 10 mM MES (pH 5,6), 100 uM acétosyringone], et incuber pendant 2 h à température ambiante. Infiltrer la culture dans la face abaxiale des feuilles, en utilisant une seringue sans aiguille 1 mL; noter que les feuilles sont inoculés in situ, tout en est fixée à la plante. 1.6.3 Après infiltration, cultiver la plante pendant 72 h sous le régime de lumière de 16 h 130-150 et# 181; E m-2 s-1 lumière à 23 ° C / 8 heures d&#39;obscurité à 20 ° C avant la récolte. </li><li> Application des inhibiteurs de protéasome Pour soutenir l&#39;idée que la protéine (s) testé est dégradée par une voie du protéasome, utiliser des inhibiteurs de protéasome spécifiques MG132 et lactacystine 28-29, ce qui devrait réduire ou même bloquer la dégradation. Quatre heures avant la récolte (voir l&#39;étape 2.1), infiltrer les surfaces foliaires Agrobacterium inoculés avec 10 uM MG132 (Merck Millipore) ou 10 uM lactacystine (Sigma-Aldrich) ou une maquette de traiter la feuille avec les solvants respectifs, soit 0,1% de DMSO ou de l&#39;eau distillée. </li></ol> 2. Préparation d&#39;extraits acellulaires <ol><li> Récolte des feuilles Récolter les zones de la feuille inoculée, habituellement ca. 200-400 mg de poids frais, et les moudre en poudre fine dans de l&#39;azote liquide. Sinon, perles battre les tissus, en utilisant n&#39;importe quel cordon-batteur (par exemple, Biospec) ou un amalgamateur dentaire (par exemple, PTC avancée<html> Technologies) directement dans la mémoire tampon de dégradation (voir l&#39;étape 2.2). </li><li> L&#39;extraction des protéines Préparer un extrait de protéines totales en plaçant le tissu broyé dans 500 ul de tampon de dégradation [50 mM de Tris-HCL (pH 7,5), NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM, DTT 5 mM, mM adénosine 5-5&#39;-triphosphate, et un inhibiteur de protéase 1x cocktail (Sigma-Aldrich)]. A noter que le cocktail d&#39;inhibiteurs de protease affecte principalement la sérine, la cystéine, aspartique, et de métalloprotéases et n&#39;interfère pas avec la protéase 26S. Clarifier l&#39;extrait par deux centrifugations successives à 12000 g pendant 5 min. </li><li> réaction de dégradation de la protéine Transférer des volumes égaux d&#39;extraits, généralement de 20 ul, à des tubes de microcentrifugation et incuber à température ambiante pendant des périodes de temps de plus en plus. Typiquement, le temps de l&#39;échantillon zéro, et 5, 10, 15, 20, et 30 points dans le temps min. Arrêtez réactions faisant bouillir dans un tampon de gel échantillon SDS, et de les analyser par western blot. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. Détection dégradation des protéines par immuno- <ol><li> L&#39;électrophorèse sur gel 3.1.1 résoudre les échantillons de protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS et électrotransfert des protéines résolues à une membrane de nitrocellulose selon le protocole standard de 30. 3.1.2 Déterminer la concentration en protéine en utilisant la méthode de Bradford (Bio-Rad), et la charge de 50 à 80 ug de protéine totale par voie de circulation. Assurez-vous que tous les échantillons sont chargés aussi. Pour les commandes de chargement, comparer les intensités d&#39;une espèce de protéine ubiquitaire, comme putatif Rubisco grandes chaînes qui migrent comme un groupe majeur avec une mobilité électrophorétique relative de l&#39;ordre de 50 kDa, ils peuvent être détectés sur Coomassie gels colorées en bleu ou sur Ponceau S-ou fluorescent SYPRO Ruby teinté membranes de nitrocellulose. </li><li> Blocage Bloquer la membrane avec 5% de lait écrémé dans du TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) pendant 1 h à température ambiante. </li&gt; <li> L&#39;anticorps primaire Diluer l&#39;anticorps anti-épitope primaire dans 1% de lait écrémé dans du TBST à la concentration recommandée par le fabricant et incuber avec la membrane bloquée pendant 1 h à la température ambiante ou pendant une nuit à 4 ° C sous agitation douce. </li><li> Rinçage Rincer la membrane est rincée dans 20 ml de TBST pendant 15 min une fois, et deux fois pendant 5 min à température ambiante avec agitation douce. </li><li> Anticorps secondaire Diluer l&#39;anticorps secondaire (par exemple, anti-IgG de lapin) conjugué à de la peroxydase de raifort (HRP) dans 1% de lait écrémé dans du TBST tel que recommandé par le fabricant et incuber avec la membrane pendant 1 h à température ambiante avec agitation douce. </li><li> Détection Rincer à nouveau la membrane, comme décrit à l&#39;étape 3.4. Après le dernier rinçage dans du TBST, de visualiser les protéines d&#39;intérêt avec un substrat chimioluminescent HRP, le plus souvent en utilisant un kit ECL. </li></ol>

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Cell. 4, 813-826 (2003).</li><li>Tzfira, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pSAT+vectors:+a+modular+series+of+plasmids+for+fluorescent+protein+tagging+and+expression+of+multiple+genes+in+plants.">pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants.</a> Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).</li><li>Goderis, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+set+of+modular+plant+transformation+vectors+allowing+flexible+insertion+of+up+to+six+expression+units.">A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units.</a> Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).</li><li>Lee, L. Y., Gelvin, S. 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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Ce test repose sur l&#39;expression des protéines testées dans les tissus végétaux, ainsi, le processus potentiel de dégradation par le protéasome se produit évidemment déjà à l&#39;intérieur des tissus vivants. Nous dosage protéine déstabilisation, cependant, que dans les extraits, avec le temps zéro échantillon servant de point de référence initial. Par conséquent, nous définissons comme un essai acellulaire. Un aspect important pour la réussite de cet essai est le choi...

Le protéasome ubiquitin/26S est en train de devenir un mécanisme généralisé pour le contrôle de diverses réactions biologiques, y compris la régulation transcriptionnelle, la progression du cycle cellulaire et la transduction du signal, le récepteur régulation à la baisse ou l&#39;endocytose, entre autres procédés 1-4. Dans cette voie, la protéine cible est marquée par ubiquitine résidus qui sont d&#39;abord fixés par l&#39;intermédiaire d&#39;une liaison thiolester d&#39;enzyme ubiquitine-activation E1 et ensuite transporté vers un résidu d&#39;acide aminé cystéine de l&#39;ubiquitine-enzyme de conjugaison E2, enfin, E2 interagit avec l&#39;ubiquitine ligase E3 , entraînant une polyubiquitination du substrat protéique. En fin de compte, les protéines polyubiquitinées sont reconnues et dégradées par le protéasome 26S. Dans ce mécanisme, l&#39;enzyme E3 spécifie le substrat et agit en tant que composant clé de régulation du système de protéasome ubiquitin/26S (UPS). Ligases E3 peuvent agir indépendamment, comme ligases de domaine RING, ou dans le cadre d&#39;un SCF unités multiples (S) complexe protéique kp1/Cullin/F-box, tels que F-box ligases de domaine. SCF-médiation voies de dégradation par le protéasome sont impliquées dans la régulation de la transcription, le cycle cellulaire, la transduction du signal 5-10 et bien d&#39;autres fonctions cellulaires majeurs. Outre ces rôles essentiels dans la régulation des processus cellulaires, UPS prend l&#39;étape centrale dans de nombreuses interactions plante-pathogène. Par exemple, en plus de preuves suggère que plusieurs agents pathogènes des plantes, y compris Agrobacterium tumefaciens, s&#39;appuient sur ​​les UPS d&#39;accueil pour faciliter le processus d&#39;infection 11. Agrobacterium provoque des tumeurs néoplasiques sur les plantes, qui représentent ses hôtes naturels, et il peut également transformer une large gamme d&#39;autres eucaryotes, les champignons de 1,2 à 12,13 cellules humaines. Au cours de son infection, Agrobacterium exporte un élément d&#39;ADN (ADN-T) et de plusieurs protéines de virulence (vir) dans la cellule hôte de 12 à 13. Une de ces protéines est VirF, la première protéine F-box trouvéêtre codée par un génome de procaryote 14. Dans le cadre du complexe SCF ubiquitine ligase, VirF, et son homologue de l&#39;hôte fonctionnel VBF 15, faciliter l&#39;infection par Agrobacterium via la dégradation des protéines UPS médiée, ce qui facilite probablement la décapsidation de l&#39;ADN-T des bactéries envahissent de ses protéines bactériennes et d&#39;accueil d&#39;accompagnement, VirE2 et VIP1, respectivement 16,17. Fait intéressant, de nombreuses protéines F-box, y compris VirF, sont intrinsèquement instables en raison de leur propre protéolyse, qui est médiée par l&#39;activité de autoubiquitination 18,19 ou par d&#39;autres ligases E3 pour lesquels les protéines F-box peuvent servir de substrats de 20 à 23. Lorsque l&#39;on étudie l&#39;activité biochimique des protéines F-box, d&#39;autres ligases ubiquitine, et / ou leurs substrats, il serait très utile d&#39;utiliser un test simple et fiable pour la dégradation par le protéasome. Nous décrivons ici un tel protocole pour l&#39;analyse de la stabilité de la protéine dans une celluleSans système. Dans cet essai, la stabilité du substrat UPS est analysée en présence ou en l&#39;absence de l&#39;un des composants essentiels de la voie de dégradation par le protéasome, comme une protéine F-box, dans un système acellulaire. En règle générale, on exprime la protéine (s) testé dans les tissus végétaux, de préparer des extraits acellulaires à partir de ces tissus et de contrôler les quantités de la protéine (s) d&#39;intérêt par western blot. Le mécanisme de l&#39;onduleur dépendant de la dégradation des protéines est mise en évidence par l&#39;inclusion d&#39;inhibiteurs de protéasome spécifiques et / ou en utilisant la co-expression de la forme négative dominante d&#39;un composant d&#39;SCF, Cullin. Alors que nous illustrons ce dosage en utilisant la dégradation par le protéasome de la protéine Arabidopsis VIP1 17 par la protéine F-box VBF 15, elle peut être utilisée pour étudier la stabilité de tous les autres substrats du protéasome.

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		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Protein assay kit</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">500-0001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Proteinase inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Mini-Protean system</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">165-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Semi-dry western blotting SD electrotransfer system</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Affinity Purified Rabbit Anti-Ha</td>
			<td style="width:129px;">icllab</td>
			<td>RHGT-45A-Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate</td>
			<td style="width:129px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">31460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane</td>
			<td style="width:129px;">Pall Corportation</td>
			<td style="width:119px;">27377-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Immobilon western chemiluminescent HRP substrate</td>
			<td style="width:129px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WBKL S0 050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MG132</td>
			<td style="width:129px;">EMD Millipore</td>
			<td>474790-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Lactacystin</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate</td>
			<td style="width:129px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">35055</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying proteasomal degradation in a cell-free system in plants

La voie ubiquitine-protéasome de dégradation des protéines a émergé comme l&#39;un des mécanismes les plus importants pour la régulation d&#39;un large éventail de fonctions cellulaires dans pratiquement tous les organismes eucaryotes. Plus précisément, dans les plantes, le système de protéasome ubiquitin/26S (UPS) régule la dégradation des protéines et contribue de manière significative au développement d&#39;une large gamme de procédés, y compris la réponse immune, de développement et de la mort cellulaire programmée. En outre, en plus de preuves suggère que de nombreux agents pathogènes des plantes, comme Agrobacterium, exploitent les UPS d&#39;accueil pour une infection efficace, soulignant l&#39;importance de l&#39;UPS dans les interactions plante-pathogène. La spécificité de substrat de l&#39;onduleur est obtenue par l&#39;ubiquitine-ligase E3 qui agit de concert avec le E1 et E2 ligases de reconnaître et de marquer les molécules de protéines spécifiques destinés à la dégradation par la fixation sur les chaînes de molécules d&#39;ubiquitine. Une classe des ligases E3 est l&#39;EFC (Skp1 / Cprotéine Ullin / F-box) complexe, qui reconnaît spécifiquement les substrats UPS et les objectifs pour l&#39;ubiquitination via son composant de la protéine F-box. Pour étudier le rôle potentiel de l&#39;UPS dans un processus biologique d&#39;intérêt, il est important de mettre au point un test simple et fiable pour la dégradation des protéines UPS médiation. Ici, nous décrivons un tel dosage en utilisant un système sans cellule végétale. Ce test peut être adapté pour des études sur les rôles des réglementée dégradation des protéines dans divers processus cellulaires, avec un accent particulier sur les F-box interactions protéine-substrat.

Figure 1, adapté de Zaltsman et al. 17, illustre expériences représentatives pour la détection de la dégradation par le protéasome dans un système acellulaire. Plus précisément, nous démontrons la déstabilisation d&#39;une usine liées à la défense protéine VIP1 par VBF protéine F-box par la voie SCF VBF en N. benthamiana. Arabidopsis VBF et protéines HA-marqués VIP1 (HA-VIP1) ont été transitoirement co-exprimées, et HA-VIP1 la teneur ...

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Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

Dégradation de la protéine ciblée représente un mécanisme de régulation important pour la fonction cellulaire. Il se produit par une voie ubiquitine-protéasome conservée, qui attache chaînes polyubiquitine à la protéine cible qui servent alors des &quot;tags&quot; moléculaires pour le protéasome 26S. Ici, nous décrivons un test simple et fiable sans cellule de la dégradation par le protéasome des protéines.

Le dosage de la dégradation par le protéasome dans un système exempt de cellules dans les plantes

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.3K vues.  Stony Brook University, State University of New York.  Dégradation de la protéine ciblée représente un mécanisme de régulation important pour la fonction cellulaire. Il se produit par une voie ubiquitine-protéasome conservée, qui attache chaînes polyubiquitine à la protéine cible qui servent alors des "tags" moléculaires pour le protéasome 26S. Ici, nous décrivons un test simple et fiable sans cellule de la dégradation par le protéasome des protéines. 

Vidéo: Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ascertain the viability of the purified Wolbachia and (3) maintain the now extracellular Wolbachia in cell-free medium.  Purified Wolbachia remain alive in the extracellular phase but do not replicate until re-inoculated into eukaryotic cells.  Extracellular Wolbachia purified in this manner will remain viable for at least a week at room temperature, and possibly longer.  Purified Wolbachia are suitable for micro-injection, DNA extraction and other applications. 


This video describes a method for purifying Wolbachia pipientis from an Anopheles gambiae cell line and then culturing the endosymbiont in cell-free medium. An assay for viability of the bacterium is demonstrated.

Le maintien de Wolbachia dans la cellule sans moyen

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ...

Recherche

Biologie

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Dosage de l&#39;activité kinase de LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Reconstitution de β-caténine dégradation dans<em&gt; Xenopus</em&gt; Extrait des oeufs

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main lysosome-dependent pathway is called autophagy, while the primary non-lysosomal method for protein catabolism is the ubiquitin-proteasome system. Recent studies in model organisms suggest that the activity of both autophagy and the ubiquitin-proteasome system is not constant across the day but instead varies according to a daily (circadian) rhythm. The ability to measure biological rhythms in protein turnover is important for understanding how cellular quality control is achieved and for understanding the dynamics of specific proteins of interest. Here we present a standardized protocol for quantifying autophagic and proteasomal flux in vivo that captures the circadian component of protein turnover. Our protocol includes details for mouse handling, tissue processing, fractionation, and autophagic flux quantification using mouse liver as the starting material.

We describe our protocol for measuring biological rhythms in protein catabolism via autophagy and the proteasome in mouse liver.

Mesurer les rythmes diurnes dans le flux autophagique et protéasomal

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar tolerance to environmental challenges. An experimental protocol is presented for setting up the hydroponic system, plantlet growth, RSA spreading, and imaging. The approach used a magenta box-based hydroponic system containing polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. Experimental settings are exemplified by assessing the RSA of the plantlets under varying nutrient (phosphate [Pi]) supply. The system was established to examine the RSA of Arabidopsis, but it is readily adaptable to study other plants like Medicago sativa (Alfalfa). Arabidopsis thaliana (Col-0) plantlets are used in this investigation as an example to understand the plant RSA. Seeds are surface sterilized by treating ethanol and diluted commercial bleach, and kept at 4 &#176;C for stratification. The seeds are germinated and grown on a liquid half-MS medium on a polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. The plantlets are grown under standard growth conditions for the desired number days, gently picked out from the mesh, and submersed in water-containing agar plates. Each root system of the plantlets is spread gently on the water-filled plate with the help of a round art brush. These Petri plates are photographed or scanned at high resolution to document the RSA traits. The root traits, such as primary root, lateral roots, and branching zone, are measured using the freely available ImageJ software. This study provides techniques for measuring plant root characteristics in controlled environmental settings. We discuss how to (1) grow the plantlets, and collect and spread root samples, (2) obtain pictures of spread RSA samples, (3) capture the images, and (4) use image analysis software to quantify root attributes. The advantage of the present method is the versatile, easy, and efficient measurement of the RSA traits.

We use simple laboratory tools to examine the root system architecture (RSA) of Arabidopsis and Medicago. The plantlets are grown hydroponically over mesh and spread using an art brush to reveal the RSA. Images are taken using scanning or a high-resolution camera, then analyzed with ImageJ to map traits.

Un protocole simple pour cartographier les caractéristiques de l’architecture du système racinaire végétal

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar ...

Quantification de l’infiltration graisseuse des muscles squelettiques par décellularisation

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic disorders, and dystrophies. Clinically in human populations, fatty infiltration is assessed using noninvasive methods, including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound (US). Although some studies have used CT or MRI to quantify fatty infiltration in mouse muscle, costs and insufficient spatial resolution remain challenging. Other small animal methods utilize histology to visualize individual adipocytes; however, this methodology suffers from sampling bias in heterogeneous pathology. This protocol describes the methodology to qualitatively view and quantitatively measure fatty infiltration comprehensively throughout intact mouse muscle and at the level of individual adipocytes using decellularization. The protocol is not limited to specific muscles or specific species and can be extended to human biopsy. Additionally, gross qualitative and quantitative assessments can be made with standard laboratory equipment for little cost, making this procedure more accessible across research laboratories.

Pleins feux sur l’auteur : Quantification de l’infiltration graisseuse des muscles squelettiques basée sur la décellularisation  

The present study describes decellularization-based methodologies for visualizing and quantifying intramuscular adipose tissue (IMAT) deposition through intact muscle volume, as well as quantifying metrics of individual adipocytes that comprise IMAT.

Quantification basée sur la décellularisation de l’infiltration graisseuse des muscles squelettiques

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic ...

Intégration de réactions CFPS dans une variété de matrices d’hydrogel

Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. While the dominant paradigm for the deployment of gene networks is within a cellular chassis, synthetic gene networks may also be deployed in cell-free environments. Promising applications of cell-free gene networks include biosensors, as these devices have been demonstrated against biotic (Ebola, Zika, and SARS-CoV-2 viruses) and abiotic (heavy metals, sulfides, pesticides, and other organic contaminants) targets. Cell-free systems are typically deployed in liquid form within a reaction vessel. Being able to embed such reactions in a physical matrix, however, may facilitate their broader application in a wider set of environments. To this end, methods for embedding cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in a variety of hydrogel matrices have been developed. One of the key properties of hydrogels conducive to this work is the high-water reconstitution capacity of hydrogel materials. Additionally, hydrogels possess physical and chemical characteristics that are functionally beneficial. Hydrogels can be freeze-dried for storage and rehydrated for use later. Two step-by-step protocols for the inclusion and assay of CFPS reactions in hydrogels are presented. First, a CFPS system can be incorporated into a hydrogel via rehydration with a cell lysate. The system within the hydrogel can then be induced or expressed constitutively for complete protein expression through the hydrogel. Second, cell lysate can be introduced to a hydrogel at the point of polymerization, and the entire system can be freeze-dried and rehydrated at a later point with an aqueous solution containing the inducer for the expression system encoded within the hydrogel. These methods have the potential to allow for cell-free gene networks that confer sensory capabilities to hydrogel materials, with the potential for deployment beyond the laboratory.

Pleins feux sur l’auteur : Une nouvelle approche pour intégrer les réactions de synthèse des protéines acellulaires dans les hydrogels 

Here, we present two protocols for embedding cell-free protein synthesis reactions in macro-scale hydrogel matrices without the need for an external liquid phase.

Procédés d’intégration de réactions de synthèse de protéines acellulaires dans des hydrogels à l’échelle macroscopique

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. ...