Les lignées cellulaires HCC4017 et HBEC30KT ont été gracieusement fournis par le laboratoire du Dr John Minna. Ce travail a été soutenu par les fonds Cecil H. et Ida Verts au Dr Li Zhang.

ATTENTION: Tout en travaillant avec la radioactivité, prendre les précautions nécessaires pour éviter la contamination de l&#39;expérimentateur et les environs. Éliminer tous les déchets hors suivant les directives de sécurité de rayonnement locales. 1. Préparation des cellules <ol><li> cellules de semences à 3,5 cm plaques telles que la confluence atteint 80% -90% sur le jour de l&#39;analyse. <ol><li> A noter que pour le semis de confluence des cellules dépend du type de cellules et de leur taux de croissance. Lorsque le traitement des cellules avec un réactif pour un certain nombre de jours, ensemencer les cellules de sorte que la confluence est de 80% à 90% le jour de la mesure de l&#39;hème. Si le nombre de cellules obtenu à partir de 3,5 cm plaques est insuffisante, utiliser des plaques de 6 cm avec même quantité d&#39;ALA radioactif comme dans l&#39;étape suivante. Remarque: Utilisez des assiettes individuelles est recommandée car elle est plus facile à manipuler des assiettes individuelles. </li></ol></li><li> Un jour avant la mesure de l&#39;hème, ajouter 0,1-0,3 uCi de [14 C] 5-ALA ALA et froid pour atteindre une finale concentration de 20 um sur un total de ALA à chaque boîte de culture dans un accès de la zone de travail pour travailler avec des matières radioactives et de mettre les plaques de nouveau dans l&#39;incubateur. Idéalement, incuber avec ALA radioactifs pendant 16 heures. Note: radiomarqué 5-ALA nécessaire peut varier entre des lignées cellulaires. Un comptage radioactif par minute (cpm) d&#39;au moins 100 est nécessaire pour minimiser l&#39;erreur associée à comptage. Il est conseillé de déterminer une quantité minimale de [14 C] 5-ALA requis pour les lignées de cellules étudiées. Pour la plupart des expériences 0,1-0,3 pCi est suffisante pour obtenir une bonne mesure. Ajout d&#39;ALA froide est facultative. </li></ol> 2. Heme Extraction <ol><li> Placez les boîtes de culture de cellules sur la glace et les emmener à l&#39;ajustement de la zone pour les travaux de la radioactivité. <ol><li> Effectuer toute extraction et processus d&#39;évaporation sous une hotte anti-explosion. Parce que l&#39;éther stockée peut exploser, utiliser l&#39;éther dans de petites bouteilles et évaporer les liquides restants, ne pas stocker dans l&#39;étherune bouteille ouverte depuis plus d&#39;un mois. Ne pas utiliser d&#39;acétone à proximité de flammes et de chauffe car il est hautement inflammable. acétone de magasin contenant des réactifs dans des bouteilles en verre comme il se dissout en matière plastique pour culture de tissus. </li></ol></li><li> Aspirer le milieu en utilisant une pipette. Laver les cellules une fois avec 1 ml de PBS 1x froid. Aspirer le PBS. </li><li> Ajouter 1 ml de 1 x PBS froid sur les plaques et recueillir les cellules au fond de la plaque en utilisant une spatule en caoutchouc. Transférer les cellules recueillies à partir de chaque plaque à un pré-réfrigérés tube de 2 ml étiqueté. Recueillir toutes les cellules de tubes de 2 ml. Remarque: Utilisez une spatule en caoutchouc frais pour chaque plaque pour racler les cellules de chaque plaque. Pour chaque plaque vous auriez besoin de quatre tubes de 2 ml, un tube de 1,5 ml et un flacon de scintillation. </li><li> Spin à 15.000 g pendant 1 min à 4 ° C. </li><li> Sortez PBS aide d&#39;une pipette, donner un bref essorage et enlever le PBS résiduelle. Resuspendre les cellules dans 100 ul de 1 x PBS. Vortex à remettre en suspension les cellules et de garder sur la glace. </li><li> Prenez 10 &amp;# 956; l à partir de l&#39;étape 5 et le transfert à un tube de 1,5 ml et conserver dans la glace pour mesurer la concentration de protéine. Remarque: un tampon de lyse cellulaire doit être ajouté aux cellules et conservé sur de la glace pour mesurer la concentration de protéine par la suite. </li><li> Faites tourner les 90 pi restants de l&#39;étape 5 à 5000 g pendant 30 secondes à 4 ° C; retirer PBS complètement en utilisant une pointe de pipette 200 pi. </li><li> Ajouter 300 pi de tampon d&#39;extraction de l&#39;hème (voir la liste des matériaux) à chaque tube. Puis vortex pendant 15 secondes pour mélanger et mettre sur la glace pendant 1 min, répéter cette 3 fois. <ol><li> Ajouter tampon d&#39;extraction de l&#39;hème (HEB) et vortex le tube rapidement à remettre le culot, le faire seulement un ou deux tubes à la fois parce que la pastille doit être remis en suspension rapidement sans être laissé dans le HEB pendant trop longtemps. Une fois HEB est ajouté à tous les tubes et le culot est remis en suspension puis suivre le tourbillon de 15 sec et 1 min sur le cycle de la glace comme à l&#39;étape 8. Notez que granulés ne peut pas aller complètement dans la HEB si le culot est laissé dans la mémoire tampon HEB pour un plus longtemps et ne pas remises en suspension rapidement. </li></ol></li><li> Ajouter 1,2 ml d&#39;éther diéthylique à chaque tube et vortexer pendant 30 secondes. Spin à 15.000 g pendant 5 min à 4 ° C. Remarque: l&#39;éther de diéthyle est à court de pointes de pipette rapidement. Pour contrôler cela, l&#39;éther diéthylique pipette de haut en bas une fois ou deux fois, faisant aide à maintenir l&#39;éther diéthylique à la pipette. Répétez cette chaque fois une pointe de pipette frais est utilisé. </li><li> Top (éther) en phase de transfert avec pipette de 1 ml à un nouveau tube. Ajouter 0,5 ml de HCl, de vortex de mélanger et de spin 2 comme à l&#39;étape 9. Remarque: Il est difficile de voir la séparation entre les phases éther et HCl. Par conséquent, ajouter de petites quantités de bleu Trypan en solution de HCl 2N pour être utilisé lors de l&#39;expérience, assez pour lui donner une couleur bleu pâle. Cela vous aidera à distinguer les deux phases. La phase inférieure sera bleu et la phase d&#39;éther supérieure sera incolore. Transférer la phase éther incolore supérieure dans un nouveau tube et jeter le HCl (bleu) phase inférieure. </li><li> Répétez l&#39;étape 10 de deuxplusieurs fois pour laver la phase éthérée avec du HCl 2. Transvaser seulement la phase d&#39;éther supérieure dans un nouveau tube lors de chaque répétition et éliminer la phase HCl inférieure. </li><li> Après le troisième lavage avec de l&#39;HCl, transférer la phase supérieure avec une pipette ml dans un flacon à scintillation. Sécher les échantillons par evaporation de l&#39;éther de diéthyle en maintenant les échantillons dans la hotte chimique O / N. </li></ol> 3. Mesure de la radioactivité <ol><li> Le jour suivant, ajouter 5 ml de fluide de scintillation pour les échantillons séchés provenant de l&#39;étape 2.12. </li><li> Bien agiter pour mélanger. Mesurer la radioactivité en utilisant un compteur à scintillation. </li></ol> 4. Calculs <ol><li> Lyse des cellules de l&#39;étape 2.6 en utilisant des quantités égales de tampon CelLytic M (voir list des matériaux) et de spin à 14.000 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Prélever une partie aliquote du surnageant et mesurer la concentration en protéine en utilisant le kit BCA Protein Assay. Quantité totale de protéine en mg (TP) = (90 * pi conc. De protéine dans81; g / ul) / 1000 niveau de la synthèse de l&#39;hème (radioactivité / TP) = pmol / mg de protéine. </li></ol>

Nous avons rien à révéler.

Heme joue un rôle clé dans la génération d&#39;énergie par la respiration cellulaire 26. Altered métabolisme de l&#39;hème est connue pour être associée à diverses maladies y compris le cancer 28,41. L&#39;inhibition de la synthèse de l&#39;hème est connu pour provoquer un arrêt du cycle cellulaire et l&#39;apoptose dans des cellules Hela 26,41. Il a été démontré que le niveau de synthèse de l&#39;hème élevée est associée à la progression de cellules de cancer du p...

L&#39;hème, un complexe de fer ferreux et la protoporphyrine IX est une molécule central pour le transport et l&#39;utilisation de l&#39;oxygène dans pratiquement tous les organismes vivants 1-3. La structure unique de l&#39;hème lui permet de fonctionner en tant que transporteur de gaz et des électrons diatomiques, ainsi que pour effectuer diverses autres fonctions 1-5. Par exemple, l&#39;hème se lie à l&#39;oxygène de l&#39;hémoglobine et de la myoglobine pour le transfert et le stockage de 6,7 à oxygène. Il fonctionne aussi comme un porteur d&#39;électrons dans les cytochromes pendant la respiration et agit comme un donneur d&#39;électrons pour des réactions catalysées par des enzymes d&#39;oxydo-réduction du cytochrome P450 8,9. L&#39;une des caractéristiques les plus importantes de l&#39;hème est que, il peut jouer un rôle de régulation dans les processus cellulaires et moléculaires, tels que la transcription des gènes, la synthèse des protéines et de micro-ARN biogenèse 4. Par exemple, elle affecte la transcription de nombreux gènes en contrôlant l&#39;activité de répresseur de la transcription de mammifère et la rec Bach1 nucléaire mammifèreeptor Rev-erbα 10-15. L&#39;hème régule l&#39;activation de la protéine activatrice de l&#39;hème (Hap) 1 qui joue un rôle important dans l&#39;activation de gènes impliqués dans la respiration et de contrôle des dommages oxydatifs, en réponse à l&#39;hème ou de l&#39;oxygène 16. Heme réglemente également la transcription des gènes dans les cellules neuronales par le facteur de croissance des nerfs (NGF) de signalisation 3,17-20. Elle régule également la synthèse des protéines dans les cellules érythroïdes de mammifère en modulant l&#39;activité de l&#39;hème-kinase régulée eIF2α (HRI) 21-24. En outre, l&#39;hème affecte l&#39;activité de protéines de signalisation clés tels que la tyrosine kinase Src et Jak2, qui sont essentiels pour le fonctionnement des cellules et 4,20,25 de la croissance cellulaire. On a constaté que dans les cellules HeLa inhibition de l&#39;hème provoque l&#39;arrêt du cycle cellulaire et l&#39;activation des marqueurs associés à la sénescence et l&#39;apoptose 26. Les deux Heme carence ou des niveaux accrus de l&#39;hème sont associés à des effets graves sur la santé chez les humains 27. Une moléculaire récentend études épidémiologiques ont montré une association positive de l&#39;apport élevé en hème et un risque accru de maladies, comme le diabète de type 2, les maladies coronariennes et plusieurs cancers dont le cancer du poumon, le cancer colorectal et le cancer du pancréas 27,28. Utilisation d&#39;une paire appariée de laboratoire cellules pulmonaires normales et cancéreuses auteurs ont constaté que les cellules cancéreuses ont augmenté les niveaux de consommation d&#39;oxygène, la synthèse de l&#39;hème et des protéines impliquées dans l&#39;absorption de l&#39;hème et de l&#39;oxygène 28 utilisation. Chose intéressante, l&#39;inhibition de la synthèse de l&#39;hème diminution de la consommation d&#39;oxygène, la prolifération, la migration et la formation des colonies de cellules 28 cancéreuses. Ainsi, la fluctuation des niveaux d&#39;hème endogène joue un rôle important dans la régulation des processus moléculaires et cellulaires 3,4,28,29. Chez les mammifères, la biosynthèse de l&#39;hème se produit en huit étapes, faisant intervenir des enzymes situées dans les mitochondries et le cytosol 4 (figure 1). Heme biosynthèse commence dans la matrice de la mitochondrie avec la condensation de glycine et de succinyl-CoA pour former l&#39;acide 5-aminolévulinique (5-ALA), catalysée par ALA synthase (ALAS) 4,31. Ceci est le taux étape de biosynthèse de l&#39;hème dans les cellules nonerythroid limitant. 5-ALA est ensuite exporté vers le cytosol où les quatre étapes suivantes se produisent pour former coproporphyrinogène III (CPgenIII), qui est ensuite importé retour à la mitochondrie, où il est transformé en protoporphyrine IX (PpIX). Enfin, une molécule de fer est incorporé à la protoporphyrine IX (PpIX) pour produire de l&#39;hème, une réaction catalysée par ferrochélatase (FECH) 2,4. Le niveau de biosynthèse de l&#39;hème dépend principalement sur ​​le niveau de ALAS enzyme qui est étroitement contrôlée par le fer intracellulaire et 4 de l&#39;hème. La biosynthèse de l&#39;hème peut être affectée par des défauts génétiques, la disponibilité de certains minéraux et des vitamines (par exemple, la riboflavine, zinc), l&#39;exposition à des toxines (par exemple, l&#39;aluminium, le plomb), Anoxie, de la fièvre, et des niveaux de certains stéroïdes (par exemple, l&#39;œstrogène) 32-35. Le niveau de synthèse de l&#39;hème est modifié dans diverses conditions pathologiques. Diminution de la biosynthèse de l&#39;hème peut causer l&#39;anémie ainsi que les maladies neurologiques 3,36. En variante, l&#39;augmentation de la biosynthèse de l&#39;hème joue un rôle important dans la progression de certains cancers 28,37. L&#39;hème a été montré pour être critique pour la croissance, la différenciation et la survie du tissu adipeux chez les mammifères, érythroïde et des cellules neuronales 4,38-41. Par exemple, une déficience de l&#39;hème conduit à des lésions des neurites dans des neurones corticaux primaires de souris via l&#39;inhibition de glutamate NMDA (N-méthyl-D-aspartate) 17 récepteur. En outre, l&#39;inhibition de la synthèse de l&#39;hème entraîne la mort cellulaire programmée dans le col épithéliale carcinome des cellules humaines HeLa 26,41. Par conséquent, en mesurant les niveaux de la biosynthèse de l&#39;hème dans diverses cellules dans des conditions différentes est important pour l&#39;étude de l&#39;étiologie et progressisur de nombreuses maladies. Nous décrivons ici une méthode rapide et sensible pour mesurer le niveau de synthèse de l&#39;hème intracellulaire en utilisant [4- 14 C] acide 5-aminolevulic. Ceci est une méthode alternative à d&#39;autres méthodes utilisant 55 Fe ou 59 Fe. Nous préférons utiliser 14 C parce que son rayonnement est très faible. En revanche, une forte protection est nécessaire pour travailler avec des isotopes Fe. En outre, cette méthode vise à mesurer et comparer la synthèse de l&#39;hème dans des cellules différentes en parallèle d&#39;une manière rapide. Afin de mesurer les niveaux de l&#39;hème absolus, on peut utiliser la méthode précédemment établi impliquant l&#39;utilisation de HPLC 42,43.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethy ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Scintillation cocktail&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid</td>
			<td>Perkin-Elmer life sciences</td>
			<td></td>
			<td>Store @&#160; -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2978</td>
			<td>Mammalian cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Specific reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Component</td>
			<td>Dispense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5)</td>
			<td>Acetone</td>
			<td>25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated HCl</td>
			<td>1.3ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of heme synthesis levels in mammalian cells

Heme sert de groupe prosthétique pour une grande variété de protéines connues comme les hémoprotéines telles que l&#39;hémoglobine, la myoglobine et cytochromes. Elle est impliquée dans divers processus cellulaires et moléculaires, tels que la transcription génique, la traduction, la différenciation cellulaire et la prolifération cellulaire. Les niveaux de la biosynthèse de l&#39;hème varient selon les différents tissus et types de cellules et est altérée dans des conditions pathologiques telles que l&#39;anémie, la neuropathie et le cancer. Cette technique utilise [4- 14 C] de l&#39;acide 5-aminolévulinique ([14 C] 5-ALA), l&#39;un des premiers précurseurs de la voie de biosynthèse de l&#39;hème pour mesurer les niveaux de synthèse de l&#39;hème dans les cellules de mammifères. Ce test implique l&#39;incubation des cellules avec [14 C] 5-ALA suivie d&#39;une extraction de l&#39;hème et de la mesure de la radioactivité incorporée dans l&#39;hème. Cette procédure est précise et rapide. Cette méthode permet de mesurer les niveaux relatifs de biosynthèse de l&#39;hème, plutôt que la teneur totale de l&#39;hème. Pour démontrer l&#39;utilisation de ce technIQUE les niveaux de biosynthèse de l&#39;hème ont été mesurés dans plusieurs lignées de cellules de mammifères.

Cette méthode a été utilisée pour comparer les niveaux de synthèse de l&#39;hème dans la normale (HBEC30KT) vs. cancer (HCC4017) les cellules pulmonaires. La figure 2 montre un niveau plus élevé de la synthèse de l&#39;hème dans les cellules cancéreuses (de HCC4017) que les cellules pulmonaires normales (HBEC30KT). Le niveau de synthèse de l&#39;hème a également été mesurée dans les cellules normales et cancéreuses en présence de cyanure de carbonyle découpleur 3-chlorophénylhydrazo...

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Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Mesure des niveaux Heme synthèse dans des cellules de mammifères

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.0K vues.  University of Texas at Dallas. Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.