Les lignées cellulaires HCC4017 et HBEC30KT ont été gracieusement fournis par le laboratoire du Dr John Minna. Ce travail a été soutenu par les fonds Cecil H. et Ida Verts au Dr Li Zhang.

ATTENTION: Tout en travaillant avec la radioactivité, prendre les précautions nécessaires pour éviter la contamination de l&#39;expérimentateur et les environs. Éliminer tous les déchets hors suivant les directives de sécurité de rayonnement locales. 1. Préparation des cellules <ol><li> cellules de semences à 3,5 cm plaques telles que la confluence atteint 80% -90% sur le jour de l&#39;analyse. <ol><li> A noter que pour le semis de confluence des cellules dépend du type de cellules et de leur taux de croissance. Lorsque le traitement des cellules avec un réactif pour un certain nombre de jours, ensemencer les cellules de sorte que la confluence est de 80% à 90% le jour de la mesure de l&#39;hème. Si le nombre de cellules obtenu à partir de 3,5 cm plaques est insuffisante, utiliser des plaques de 6 cm avec même quantité d&#39;ALA radioactif comme dans l&#39;étape suivante. Remarque: Utilisez des assiettes individuelles est recommandée car elle est plus facile à manipuler des assiettes individuelles. </li></ol></li><li> Un jour avant la mesure de l&#39;hème, ajouter 0,1-0,3 uCi de [14 C] 5-ALA ALA et froid pour atteindre une finale concentration de 20 um sur un total de ALA à chaque boîte de culture dans un accès de la zone de travail pour travailler avec des matières radioactives et de mettre les plaques de nouveau dans l&#39;incubateur. Idéalement, incuber avec ALA radioactifs pendant 16 heures. Note: radiomarqué 5-ALA nécessaire peut varier entre des lignées cellulaires. Un comptage radioactif par minute (cpm) d&#39;au moins 100 est nécessaire pour minimiser l&#39;erreur associée à comptage. Il est conseillé de déterminer une quantité minimale de [14 C] 5-ALA requis pour les lignées de cellules étudiées. Pour la plupart des expériences 0,1-0,3 pCi est suffisante pour obtenir une bonne mesure. Ajout d&#39;ALA froide est facultative. </li></ol> 2. Heme Extraction <ol><li> Placez les boîtes de culture de cellules sur la glace et les emmener à l&#39;ajustement de la zone pour les travaux de la radioactivité. <ol><li> Effectuer toute extraction et processus d&#39;évaporation sous une hotte anti-explosion. Parce que l&#39;éther stockée peut exploser, utiliser l&#39;éther dans de petites bouteilles et évaporer les liquides restants, ne pas stocker dans l&#39;étherune bouteille ouverte depuis plus d&#39;un mois. Ne pas utiliser d&#39;acétone à proximité de flammes et de chauffe car il est hautement inflammable. acétone de magasin contenant des réactifs dans des bouteilles en verre comme il se dissout en matière plastique pour culture de tissus. </li></ol></li><li> Aspirer le milieu en utilisant une pipette. Laver les cellules une fois avec 1 ml de PBS 1x froid. Aspirer le PBS. </li><li> Ajouter 1 ml de 1 x PBS froid sur les plaques et recueillir les cellules au fond de la plaque en utilisant une spatule en caoutchouc. Transférer les cellules recueillies à partir de chaque plaque à un pré-réfrigérés tube de 2 ml étiqueté. Recueillir toutes les cellules de tubes de 2 ml. Remarque: Utilisez une spatule en caoutchouc frais pour chaque plaque pour racler les cellules de chaque plaque. Pour chaque plaque vous auriez besoin de quatre tubes de 2 ml, un tube de 1,5 ml et un flacon de scintillation. </li><li> Spin à 15.000 g pendant 1 min à 4 ° C. </li><li> Sortez PBS aide d&#39;une pipette, donner un bref essorage et enlever le PBS résiduelle. Resuspendre les cellules dans 100 ul de 1 x PBS. Vortex à remettre en suspension les cellules et de garder sur la glace. </li><li> Prenez 10 &amp;# 956; l à partir de l&#39;étape 5 et le transfert à un tube de 1,5 ml et conserver dans la glace pour mesurer la concentration de protéine. Remarque: un tampon de lyse cellulaire doit être ajouté aux cellules et conservé sur de la glace pour mesurer la concentration de protéine par la suite. </li><li> Faites tourner les 90 pi restants de l&#39;étape 5 à 5000 g pendant 30 secondes à 4 ° C; retirer PBS complètement en utilisant une pointe de pipette 200 pi. </li><li> Ajouter 300 pi de tampon d&#39;extraction de l&#39;hème (voir la liste des matériaux) à chaque tube. Puis vortex pendant 15 secondes pour mélanger et mettre sur la glace pendant 1 min, répéter cette 3 fois. <ol><li> Ajouter tampon d&#39;extraction de l&#39;hème (HEB) et vortex le tube rapidement à remettre le culot, le faire seulement un ou deux tubes à la fois parce que la pastille doit être remis en suspension rapidement sans être laissé dans le HEB pendant trop longtemps. Une fois HEB est ajouté à tous les tubes et le culot est remis en suspension puis suivre le tourbillon de 15 sec et 1 min sur le cycle de la glace comme à l&#39;étape 8. Notez que granulés ne peut pas aller complètement dans la HEB si le culot est laissé dans la mémoire tampon HEB pour un plus longtemps et ne pas remises en suspension rapidement. </li></ol></li><li> Ajouter 1,2 ml d&#39;éther diéthylique à chaque tube et vortexer pendant 30 secondes. Spin à 15.000 g pendant 5 min à 4 ° C. Remarque: l&#39;éther de diéthyle est à court de pointes de pipette rapidement. Pour contrôler cela, l&#39;éther diéthylique pipette de haut en bas une fois ou deux fois, faisant aide à maintenir l&#39;éther diéthylique à la pipette. Répétez cette chaque fois une pointe de pipette frais est utilisé. </li><li> Top (éther) en phase de transfert avec pipette de 1 ml à un nouveau tube. Ajouter 0,5 ml de HCl, de vortex de mélanger et de spin 2 comme à l&#39;étape 9. Remarque: Il est difficile de voir la séparation entre les phases éther et HCl. Par conséquent, ajouter de petites quantités de bleu Trypan en solution de HCl 2N pour être utilisé lors de l&#39;expérience, assez pour lui donner une couleur bleu pâle. Cela vous aidera à distinguer les deux phases. La phase inférieure sera bleu et la phase d&#39;éther supérieure sera incolore. Transférer la phase éther incolore supérieure dans un nouveau tube et jeter le HCl (bleu) phase inférieure. </li><li> Répétez l&#39;étape 10 de deuxplusieurs fois pour laver la phase éthérée avec du HCl 2. Transvaser seulement la phase d&#39;éther supérieure dans un nouveau tube lors de chaque répétition et éliminer la phase HCl inférieure. </li><li> Après le troisième lavage avec de l&#39;HCl, transférer la phase supérieure avec une pipette ml dans un flacon à scintillation. Sécher les échantillons par evaporation de l&#39;éther de diéthyle en maintenant les échantillons dans la hotte chimique O / N. </li></ol> 3. Mesure de la radioactivité <ol><li> Le jour suivant, ajouter 5 ml de fluide de scintillation pour les échantillons séchés provenant de l&#39;étape 2.12. </li><li> Bien agiter pour mélanger. Mesurer la radioactivité en utilisant un compteur à scintillation. </li></ol> 4. Calculs <ol><li> Lyse des cellules de l&#39;étape 2.6 en utilisant des quantités égales de tampon CelLytic M (voir list des matériaux) et de spin à 14.000 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Prélever une partie aliquote du surnageant et mesurer la concentration en protéine en utilisant le kit BCA Protein Assay. Quantité totale de protéine en mg (TP) = (90 * pi conc. De protéine dans81; g / ul) / 1000 niveau de la synthèse de l&#39;hème (radioactivité / TP) = pmol / mg de protéine. </li></ol>

Nous avons rien à révéler.

Heme joue un rôle clé dans la génération d&#39;énergie par la respiration cellulaire 26. Altered métabolisme de l&#39;hème est connue pour être associée à diverses maladies y compris le cancer 28,41. L&#39;inhibition de la synthèse de l&#39;hème est connu pour provoquer un arrêt du cycle cellulaire et l&#39;apoptose dans des cellules Hela 26,41. Il a été démontré que le niveau de synthèse de l&#39;hème élevée est associée à la progression de cellules de cancer du p...

L&#39;hème, un complexe de fer ferreux et la protoporphyrine IX est une molécule central pour le transport et l&#39;utilisation de l&#39;oxygène dans pratiquement tous les organismes vivants 1-3. La structure unique de l&#39;hème lui permet de fonctionner en tant que transporteur de gaz et des électrons diatomiques, ainsi que pour effectuer diverses autres fonctions 1-5. Par exemple, l&#39;hème se lie à l&#39;oxygène de l&#39;hémoglobine et de la myoglobine pour le transfert et le stockage de 6,7 à oxygène. Il fonctionne aussi comme un porteur d&#39;électrons dans les cytochromes pendant la respiration et agit comme un donneur d&#39;électrons pour des réactions catalysées par des enzymes d&#39;oxydo-réduction du cytochrome P450 8,9. L&#39;une des caractéristiques les plus importantes de l&#39;hème est que, il peut jouer un rôle de régulation dans les processus cellulaires et moléculaires, tels que la transcription des gènes, la synthèse des protéines et de micro-ARN biogenèse 4. Par exemple, elle affecte la transcription de nombreux gènes en contrôlant l&#39;activité de répresseur de la transcription de mammifère et la rec Bach1 nucléaire mammifèreeptor Rev-erbα 10-15. L&#39;hème régule l&#39;activation de la protéine activatrice de l&#39;hème (Hap) 1 qui joue un rôle important dans l&#39;activation de gènes impliqués dans la respiration et de contrôle des dommages oxydatifs, en réponse à l&#39;hème ou de l&#39;oxygène 16. Heme réglemente également la transcription des gènes dans les cellules neuronales par le facteur de croissance des nerfs (NGF) de signalisation 3,17-20. Elle régule également la synthèse des protéines dans les cellules érythroïdes de mammifère en modulant l&#39;activité de l&#39;hème-kinase régulée eIF2α (HRI) 21-24. En outre, l&#39;hème affecte l&#39;activité de protéines de signalisation clés tels que la tyrosine kinase Src et Jak2, qui sont essentiels pour le fonctionnement des cellules et 4,20,25 de la croissance cellulaire. On a constaté que dans les cellules HeLa inhibition de l&#39;hème provoque l&#39;arrêt du cycle cellulaire et l&#39;activation des marqueurs associés à la sénescence et l&#39;apoptose 26. Les deux Heme carence ou des niveaux accrus de l&#39;hème sont associés à des effets graves sur la santé chez les humains 27. Une moléculaire récentend études épidémiologiques ont montré une association positive de l&#39;apport élevé en hème et un risque accru de maladies, comme le diabète de type 2, les maladies coronariennes et plusieurs cancers dont le cancer du poumon, le cancer colorectal et le cancer du pancréas 27,28. Utilisation d&#39;une paire appariée de laboratoire cellules pulmonaires normales et cancéreuses auteurs ont constaté que les cellules cancéreuses ont augmenté les niveaux de consommation d&#39;oxygène, la synthèse de l&#39;hème et des protéines impliquées dans l&#39;absorption de l&#39;hème et de l&#39;oxygène 28 utilisation. Chose intéressante, l&#39;inhibition de la synthèse de l&#39;hème diminution de la consommation d&#39;oxygène, la prolifération, la migration et la formation des colonies de cellules 28 cancéreuses. Ainsi, la fluctuation des niveaux d&#39;hème endogène joue un rôle important dans la régulation des processus moléculaires et cellulaires 3,4,28,29. Chez les mammifères, la biosynthèse de l&#39;hème se produit en huit étapes, faisant intervenir des enzymes situées dans les mitochondries et le cytosol 4 (figure 1). Heme biosynthèse commence dans la matrice de la mitochondrie avec la condensation de glycine et de succinyl-CoA pour former l&#39;acide 5-aminolévulinique (5-ALA), catalysée par ALA synthase (ALAS) 4,31. Ceci est le taux étape de biosynthèse de l&#39;hème dans les cellules nonerythroid limitant. 5-ALA est ensuite exporté vers le cytosol où les quatre étapes suivantes se produisent pour former coproporphyrinogène III (CPgenIII), qui est ensuite importé retour à la mitochondrie, où il est transformé en protoporphyrine IX (PpIX). Enfin, une molécule de fer est incorporé à la protoporphyrine IX (PpIX) pour produire de l&#39;hème, une réaction catalysée par ferrochélatase (FECH) 2,4. Le niveau de biosynthèse de l&#39;hème dépend principalement sur ​​le niveau de ALAS enzyme qui est étroitement contrôlée par le fer intracellulaire et 4 de l&#39;hème. La biosynthèse de l&#39;hème peut être affectée par des défauts génétiques, la disponibilité de certains minéraux et des vitamines (par exemple, la riboflavine, zinc), l&#39;exposition à des toxines (par exemple, l&#39;aluminium, le plomb), Anoxie, de la fièvre, et des niveaux de certains stéroïdes (par exemple, l&#39;œstrogène) 32-35. Le niveau de synthèse de l&#39;hème est modifié dans diverses conditions pathologiques. Diminution de la biosynthèse de l&#39;hème peut causer l&#39;anémie ainsi que les maladies neurologiques 3,36. En variante, l&#39;augmentation de la biosynthèse de l&#39;hème joue un rôle important dans la progression de certains cancers 28,37. L&#39;hème a été montré pour être critique pour la croissance, la différenciation et la survie du tissu adipeux chez les mammifères, érythroïde et des cellules neuronales 4,38-41. Par exemple, une déficience de l&#39;hème conduit à des lésions des neurites dans des neurones corticaux primaires de souris via l&#39;inhibition de glutamate NMDA (N-méthyl-D-aspartate) 17 récepteur. En outre, l&#39;inhibition de la synthèse de l&#39;hème entraîne la mort cellulaire programmée dans le col épithéliale carcinome des cellules humaines HeLa 26,41. Par conséquent, en mesurant les niveaux de la biosynthèse de l&#39;hème dans diverses cellules dans des conditions différentes est important pour l&#39;étude de l&#39;étiologie et progressisur de nombreuses maladies. Nous décrivons ici une méthode rapide et sensible pour mesurer le niveau de synthèse de l&#39;hème intracellulaire en utilisant [4- 14 C] acide 5-aminolevulic. Ceci est une méthode alternative à d&#39;autres méthodes utilisant 55 Fe ou 59 Fe. Nous préférons utiliser 14 C parce que son rayonnement est très faible. En revanche, une forte protection est nécessaire pour travailler avec des isotopes Fe. En outre, cette méthode vise à mesurer et comparer la synthèse de l&#39;hème dans des cellules différentes en parallèle d&#39;une manière rapide. Afin de mesurer les niveaux de l&#39;hème absolus, on peut utiliser la méthode précédemment établi impliquant l&#39;utilisation de HPLC 42,43.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethy ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Scintillation cocktail&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid</td>
			<td>Perkin-Elmer life sciences</td>
			<td></td>
			<td>Store @&#160; -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2978</td>
			<td>Mammalian cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Specific reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Component</td>
			<td>Dispense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5)</td>
			<td>Acetone</td>
			<td>25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated HCl</td>
			<td>1.3ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of heme synthesis levels in mammalian cells

Heme sert de groupe prosthétique pour une grande variété de protéines connues comme les hémoprotéines telles que l&#39;hémoglobine, la myoglobine et cytochromes. Elle est impliquée dans divers processus cellulaires et moléculaires, tels que la transcription génique, la traduction, la différenciation cellulaire et la prolifération cellulaire. Les niveaux de la biosynthèse de l&#39;hème varient selon les différents tissus et types de cellules et est altérée dans des conditions pathologiques telles que l&#39;anémie, la neuropathie et le cancer. Cette technique utilise [4- 14 C] de l&#39;acide 5-aminolévulinique ([14 C] 5-ALA), l&#39;un des premiers précurseurs de la voie de biosynthèse de l&#39;hème pour mesurer les niveaux de synthèse de l&#39;hème dans les cellules de mammifères. Ce test implique l&#39;incubation des cellules avec [14 C] 5-ALA suivie d&#39;une extraction de l&#39;hème et de la mesure de la radioactivité incorporée dans l&#39;hème. Cette procédure est précise et rapide. Cette méthode permet de mesurer les niveaux relatifs de biosynthèse de l&#39;hème, plutôt que la teneur totale de l&#39;hème. Pour démontrer l&#39;utilisation de ce technIQUE les niveaux de biosynthèse de l&#39;hème ont été mesurés dans plusieurs lignées de cellules de mammifères.

Cette méthode a été utilisée pour comparer les niveaux de synthèse de l&#39;hème dans la normale (HBEC30KT) vs. cancer (HCC4017) les cellules pulmonaires. La figure 2 montre un niveau plus élevé de la synthèse de l&#39;hème dans les cellules cancéreuses (de HCC4017) que les cellules pulmonaires normales (HBEC30KT). Le niveau de synthèse de l&#39;hème a également été mesurée dans les cellules normales et cancéreuses en présence de cyanure de carbonyle découpleur 3-chlorophénylhydrazo...

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Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Mesure des niveaux Heme synthèse dans des cellules de mammifères

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.0K vues.  University of Texas at Dallas. Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

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Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinisation et Repiquage des cellules de mammifères

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Recherche

Biologie

Bioluminescence Imaging of Heme Oxygenase-1 Upregulation in the Gua Sha Procedure

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol for bioluminescent optical imaging of HO-1-luciferase transgenic mice reported in this manuscript provides a rapid in vivo assay of the upregulation of the heme oxygenase-1 (HO-1) gene expression in response to the Gua Sha procedure. HO-1 has long been known to provide cytoprotection against oxidative stress. The upregulation of HO-1, assessed by the bioluminescence output, is thought to represent an antioxidative response to circulating hemoglobin products released by Gua Sha. Gua Sha was administered by repeated strokes of a smooth spoon edge over lubricated skin on the back or other targeted body part of the transgenic mouse until petechiae (splinter hemorrhages) or ecchymosis (bruises) indicative of extravasation of blood from subcutaneous capillaries was observed. After Gua Sha, bioluminescence imaging sessions were carried out daily for several days to follow the dynamics of HO-1 expression in multiple internal organs.

Gua Sha, traditional Chinese therapeutic skin scraping, causes subcutaneous microvascular blood extravasation. We report a protocol of bioluminescence imaging of HO-1-luciferase transgenic mice to demonstrate that Gua Sha upregulates heme oxygenase-1 (HO-1) in multiple organs.

Imagerie par bioluminescence de l&#39;hème oxygénase-1 Régulation à la hausse dans la procédure de Gua Sha

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

En fractionnement subcellulaire situ des adhérentes et non-adhérents des cellules de mammifères

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

L&#39;analyse de l&#39;ADN double-brin Break (ORD) de réparation dans les cellules de mammifères

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

EsiRNA MISSION pour le dépistage de l&#39;ARNi dans les cellules de mammifères

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Analyse de la cinétique ARNm exportation nucléaire dans les cellules de mammifères par micro-injection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex MISSION dépistage sur mélange d&#39;Bibliothèque shRNA dans les cellules de mammifères

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse de la situation du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualisation des ARNm localisés dans le réticulum endoplasmique des cellules de mammifères

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Methods Article

Mesure des niveaux Heme synthèse dans des cellules de mammifères