Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Wobus pour les commentaires et suggestions. Travailler dans le laboratoire de l &#39;AI a été financée par fonds de démarrage de l&#39;Université du Michigan, une subvention de développement de carrière à partir du Centre NIH / NIAID régional d&#39;excellence pour Bio-défense et émergentes de recherche en infectiologie (RCE) du programme, la Région V&#39; Grande Lacs »RCE (NIH prix 1-U54-AI-057 153) et le NIH R01 AI080611. MBG-H. a été financé par l&#39;immunologie expérimentale (NIH T32 A1007413-16) et les Mécanismes moléculaires de la pathogenèse microbienne (NIH T32 A1007528) bourses de formation à l&#39;Université du Michigan. JBC a été financé par coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES), Brasilia, Brésil.

1. La culture de la lignée cellulaire de macrophages RAW 264.7 <ol><li> Maintenir des cellules RAW 264.7 (ATCC, numéro de catalogue TIB-71) dans DMEM-10 des médias, qui se compose de glucose à haute DMEM avec 10% (v / v) faible endotoxine sérum fœtal bovin (&lt;10 EU / ml), HEPES 10 mM , 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 1 mM de non-acides aminés essentiels, 2 mM de L-glutamine. Les cellules sont généralement maintenues dans 175 cm 2 flacons de culture tissulaire contenant 35 ml de milieu par flacon et incubées à 37 ° C et 5% de CO 2 dans un incubateur de culture tissulaire. Cependant, tout flacon format peut être utilisé avec un volume de support qui est adapté à la taille du flacon. </li><li> Pour diviser des cellules: Aspirer les anciens médias, ajouter 10 ml de DMEM frais-10 médias sur les cellules, puis gratter les cellules du fond du flacon à l&#39;aide d&#39;un grattoir à cellules. Ensuite, remettre en suspension les cellules dans une solution homogène en élaborant des cellules dans une pipette de 10 ml et serrer avec force les cellules à travers l&#39;embout de pipette prEssed contre le fond du flacon. Répétez cette opération au moins 3 fois si les cellules ne s&#39;agrègent. Vérifier par microscopie optique qu&#39;une suspension de cellules isolées a été généré. Ensuite, transférer 1 ml (dilution 1:10 ou ~ 1x10 7 cellules) - 2 ml (dilution 1:5 ou ~ 2x10 7 cellules) de la suspension cellulaire à un nouveau flacon de 175 cm 2, et porter le volume final du milieu jusqu&#39;à 35 ml. </li><li> Les cellules divisées quand ils sont presque confluentes (~ 1x10 8 cellules total/175 cm 2 flacons): tous les trois jours si vous commencez avec une dilution de 1:10, ou tous les deux jours si vous commencez avec une dilution 1:5. Utilisez la microscopie optique pour vérifier la morphologie des cellules, avant fractionnement de cellules. La plupart des cellules devraient regarder autour et pas activée. Cellules activées ont granules et / ou étendues, avec des appendices filiformes morphologie. Ne laissez pas envahir les cellules comme les cellules ne sont généralement pas former des plaques. Gardez une trace du nombre de passages et souvent recommencer par la fonte d&#39;une partie aliquote passage inférieur de cellules. (Nous utilisons passage 30 comme un cut-off). </li></ol> 2. Infecter les cellules RAW 264.7 MNV avec l&#39;inoculum <ol><li> Semences cellules RAW 264.7 en plaques 6 puits (3,5 cm de diamètre) à une densité de 1x10 6 cellules viables / ml dans du DMEM-10 médias, et ajouter 2 ml de cette suspension dans chaque puits. Il est important de distribuer uniformément les cellules dans des puits de plaques, soit par basculement à la main au moins 10 fois ou au moyen d&#39;un dispositif à bascule pour ~ 10 min. Ne pas faire tourbillonner les plaques car cela pourrait causer des cellules à se regrouper dans le centre du puits. Plaques placer dans un incubateur de culture tissulaire (à 37 ° C et 5% de CO 2). Laisser les cellules d&#39;attacher pendant la nuit ou pendant au moins 4 heures à 37 ° C. Les cellules doivent être de 60 à 80% de confluence pour le dosage de la plaque et distribué uniformément dans le puits. </li><li> Le lendemain, préparer l&#39;inoculum viral, qui peut être de MNV cellules infectées en culture de tissus ou de tissus homogénéisés ou des échantillons fécaux de MNV souris infectées. Lors de l&#39;utilisation d&#39;échantillons de tissus, taille d&#39;un pois piEPE de tissus sont homogénéisés dans 2 ml à bouchon à vis des tubes contenant des billes de silice stériles dans 1 ml de DMEM-10 à l&#39;aide d&#39;un homogénéiseur de tissus (par exemple MagnaLyser; Roche). Pour les échantillons fécaux, pas plus de 3 pelotes fécales doivent être homogénéisés dans 1 ml médias. Tous les échantillons sont ensuite congelés (à -80 ° C) et décongelés une fois avant d&#39;effectuer le dosage de la plaque. </li><li> Préparer 10 dilutions de l&#39;inoculum viral dans du DMEM complet-5 moyen, qui se compose de DMEM / glucose élevé, 5% (v / v) faible endotoxines sérum de veau fœtal (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 1 mM de non-acides aminés essentiels, 2 mM de L-glutamine. </li><li> Dix dilutions en série sont disposés dans des plaques 24-puits: Une pipette de répéteur est utilisé pour distribuer 1,35 ml de milieu dans des puits multiples, la dilution 10 -1 est réalisée en mélangeant 1,35 ml de milieu et 0,15 ml de virus contenant de l&#39;échantillon, et puis 0,15 ml de la dilution 10 -1 est ajouté à 1,35 ml médias afin de faire le 10 -2 dilution et ainsi de suite. Il est important de changer d&#39;embout chaque fois que vous effectuez une nouvelle dilution. Une pipette multicanaux peut être utilisée pour effectuer les dilutions d&#39;échantillons multiples à la fois avec deux pointes de montage dans un puits d&#39;une plaque de 24 puits transfert d&#39;un volume total de 0,15 ml par puits (voir figure 3A). </li><li> Une gamme de dilution de type homogénats de tissus et les contenus fécaux est de 10 -1 à 10 -3. Cependant, les plaques de ces échantillons ont tendance à être plus petits par rapport à ceux des échantillons de culture de tissus. En outre, dans certains cas, une dilution 1:100 des échantillons fécaux est nécessaire pour diluer suffisamment sur les composants toxiques des matières fécales qui peuvent perturber la monocouche de cellules, empêchant ainsi la capacité de compter des plaques. La gamme de dilution des lysats de culture de tissus dépend du point de temps d&#39;intérêt au cours du cycle de vie du virus. Dilutions allant jusqu&#39;à 10 -9 peut être nécessaire à l&#39;apogée de l&#39;infection. </li><li> Après les dilutions sont préparées, étiqueter la plaque à 6 puitss contenant RAW 264.7 monocouches (à partir de la section 2.1) avec le nom de l&#39;échantillon et les dilutions étant plaqué. Une plaque à la fois, retirer tout support en le feuilletant ou en dehors d&#39;aspiration. Immédiatement après, ajoutez 0,5 ml d&#39;un échantillon dilué dans un puits, puis répétez avec un double puits, avant de procéder à la dilution suivante. Une fois tous les 3 dilutions sont ajoutés à une plaque d&#39;inclinaison plaque, d&#39;avant en arrière à la main pour s&#39;assurer que toutes les cellules ont été couverts. Manipuler une plaque à la fois pour s&#39;assurer que les cellules ne se dessèchent pas. </li><li> Après addition de 0,5 ml des dilutions de chaque puits, à empiler des plaques droite et les incuber pendant 1 heure à température ambiante. Parce que le volume ajouté à chaque puits n&#39;est pas suffisante pour couvrir complètement la monocouche, les plaques doivent être légèrement inclinée vers l&#39;arrière et en arrière à la main toutes les 10-15 minutes ou placé sur un appareil à bascule (~ 18 oscillations par minute). Cela empêche les cellules de se dessécher. </li></ol> 3. Faible point de fusion d&#39;agarose (SeaPlaque) Préparation Overlay <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Remarque: il est conseillé d&#39;avoir plusieurs bouteilles avec autoclave SeaPlaque agarose préparé à l&#39;avance. D&#39;agarose peuvent être refondus dans un four micro-ondes avant l&#39;utilisation. <ol><li> Calculer la quantité de revêtement nécessaire pour que le volume total des plaques avant l&#39;incubation 1 h est terminée. Le volume nécessaire est de 2 ml / puits ou 12 ml/6-well plaque. Préparer agarose (voir section 3.2) et les médias (voir la section 3.3) séparément. </li><li> À préparer l&#39;agarose, suspendre 3 g de SeaPlaque agarose dans un volume total de 100 ml d&#39;eau distillée (3% v / v) dans un flacon en verre. Autoclaver pendant 20-30 min. (Si agarose a été déjà préparé avant-main, de refonte d&#39;agarose à micro-ondes.) Il est important d&#39;équilibrer SeaPlaque agarose à 42 ° C dans un bain d&#39;eau avant de l&#39;utiliser parce que si l&#39;agarose est trop chaud, il va tuer les cellules. S&#39;assurer que le niveau d&#39;eau est égal ou supérieur au niveau de l&#39;agarose pour éviter la solidification indésirable. </li><li> Pour préparer les médias: faire 100 ml de milieu MEM 2x, qui se compose de2x MEM, 10% (v / v) faible endotoxine sérum de veau fœtal (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 4 mM de L-glutamine. Équilibrer médias à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Mélanger à la fois l&#39;agarose SeaPlaque et les médias MEM 2x ensemble dans un flacon stérile dans un rapport 1:1 immédiatement avant la superposition des monocouches de cellules infectées. Si plus de 200 ml de recouvrement est nécessaire, le volume divisé en plusieurs bouteilles et de garder à 37 ° C bain d&#39;eau jusqu&#39;au moment de servir. </li><li> À la fin de l&#39;incubation de 1 h (voir section 2.7), aspirer l&#39;inoculum hors de chaque puits. Ajouter lentement 2 ml de recouvrement vers le bord de chaque puits en plaçant la pointe de la pipette contre la paroi de chaque puits. Jusqu&#39;à 5 plaques peuvent être traitées simultanément sans cellules se dessécher. </li><li> Permettre le recouvrement se solidifier pendant environ 10 min à température ambiante avant de placer les plaques verticalement dans le incubateur de culture tissulaire. Incuber les plaques pendant 48 heures à 37 ° C dans 5% de CO 2. </li><li> Aprèsla période d&#39;incubation, les plaques sont à peine visible à l&#39;œil nu, afin de vérifier plaques non colorées de la présence de plaques. Si aucune plaque sont visibles, incuber pendant 4 heures supplémentaires et vérifier de nouveau. Toutefois, la période d&#39;incubation maximale ne doit pas dépasser 72 heures. </li></ol> 4. Visualisation des plaques de coloration rouge neutre <ol><li> Pour visualiser les plaques, la solution de coloration au rouge neutre est préparé en ajoutant 3 ml de rouge neutre (0,33% v / v dans du DPBS, Sigma, catalogue # N2889) pour chaque ml de PBS 1x 97 (grade de culture tissulaire, Mg 2 + -, Ca 2 + - gratuit; Gibco, catalogue # 10010). Calculer le volume de solution de coloration au rouge neutre nécessaire pour l&#39;expérience: 12 ml de solution neutre coloration rouge sont obligatoires pour chaque plaque à 6 puits. Ensuite, ajoutez 2 ml dans chaque puits. Bien que certains protocoles de dosage plaque nécessitent la prise d&#39;agarose à être présente dans le puits, en ce protocole la solution de coloration au rouge neutre est ajouté directement sur le revêtement. </li><li> Après une heure un danscubation à 37 ° C, vérifier si les plaques sont visibles avec une solution de coloration au rouge neutre encore dans les puits. Si les plaques ne sont pas évidentes, permettent la coloration se poursuivre pendant une autre heure. Continuer jusqu&#39;à ce que l&#39;incubation des plaques sont visibles. (Remarque:. Coloration pendant plus de 3 heures n&#39;est pas optimale et si aucune plaque sont visibles dans l&#39;échantillon de contrôle positif après 3 heures de la coloration, le dosage de la plaque ne fonctionne pas correctement) Après la coloration est terminée, aspirer la solution de coloration au rouge neutre , en veillant à la prise d&#39;agarose n&#39;est pas perturbée, puis procéder au comptage des plaques. </li><li> Compter plaques en plaçant la plaque à l&#39;envers sur une boîte à lumière et un point de marquage sur des plaques en compte pour éviter chiffres dupliquée. Choisissez la dilution de compter plaques dans les puits où les plaques sont clairement séparées (ie pas de preuve visuelle de fusion plaques ensemble). Si possible, compter plaques à deux dilutions. Il est important de noter que la taille des plaques peut varier entre les souches MNV, inoculum de virus, et dépend de laétat des cellules RAW 264.7 au cours de l&#39;essai de plaque. </li><li> Si aucune plaque sont visibles dans un puits, soit il n&#39;y avait pas de virus présent dans l&#39;échantillon ou la quantité de virus était sous la limite de détection de la méthode des plages. Dans ce cas, le puits se colorent en rouge avec une couleur similaire à celle d&#39;autres plaques contenant du puits. Alternativement, l&#39;absence de plaques est également observée quand il ya trop de particules virales présentes dans une dilution donnée. Cela conduit à la lyse de la monocouche tout puits prend une couleur orange / jaune. </li><li> Calculer les titres viraux. Ajouter le nombre de plaques dans les deux puits à une dilution unique et multiplier par le facteur de dilution (soit 1 ml si 2 puits sont infectés avec 0,5 ml). Cela donnera la quantité d&#39;unités formant des plages (UFP) dans votre volume d&#39;inoculum de 1 ml. Par exemple, dans la Figure 4 à la dilution 10 -2, un puits (&quot;II&quot;) dispose de 14 plaques et l&#39;autre puits (marqué &quot;V&quot;) dispose de 17 plaques. Ainsi, le titre viral sera de 14x10 2 + 2 = 17x10 3100 (3.1x10 3) pfu / ml. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Infectieuses MNV-1 particules peuvent être quantifiés à l&#39;aide d&#39;un dosage de la plaque comme indiqué schématiquement dans la figure 1. Figure 2A montre un puits avec une monocouche de cellules RAW 264.7 juste avant l&#39;infection, tandis que la figure 2B montre trois plaques visibles indiquées par des chiffres romains I, II et III dans un puits. Les différentes étapes de l&#39;analyse sont représentés dans les figures 3A à F. La figure 3A montre la préparation de la série de dilution de 10 fois d&#39;un échantillon contenant un virus. Figure 3B montre le transfert des dilutions de dupliquer les puits d&#39;une plaque à 6 puits. Figure La figure 3C montre le dispositif de bascule utilisée pour incuber des cellules RAW 264,7 avec l&#39;inoculum à la température ambiante pendant 1 h figure 3D montre des cellules est recouverte par la SeaPlaque:. MEMmélange. figure 3E montre une plaque à la température ambiante pour permettre la superposition de se solidifier, tandis que la figure 3F montre des cellules étant colorées avec une solution 0,01% neutre 48 h plus tard rouge. Après la coloration des cellules pour hr 1-3 et aspirer la solution de coloration au rouge neutre, les plaques sont visibles et peuvent être pris en compte (figure 4). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma du protocole de MNV dosage de la plaque. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig2.jpg" /> Figure 2. Images représentatives d&#39;un puits d&#39;une monocouche avant l&#39;infection et après la formation de plaques. A 264,7) RAW cellules ont été cultivées pendant une nuit et imagée sous un microscope optique à un grossissement de 20x. B) Les cellules ont été colorées avec une solution à 0,01% de rouge neutre après 48 hr de l&#39;infection et visualisées sous un microscope optique à un grossissement de 4x. Roman numéros I, II, et III indiquent trois plaques visibles. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig3.jpg" /> Figure 3. Images représentatives des différentes étapes d&#39;analyse plaque. A) MNV-1 inoculum est préparé dans 10 des dilutions. B) L&#39;inoculum est ajouté à des monocouches de cellules dans les puits en double. C) Les cellules et l&#39;inoculum sont incubés en basculant pendant 1 heure à température ambiante. D) Les cellules sont recouvertes d&#39;un mélange 1:1 de SeaPlaque agarose et 2x MEM médias. E) Les plaques sont incubées pendant 10 min à température ambiante pour permettre la superposition de se solidifier. F) La coloration des cellules avec la solution de coloration au rouge neutre 48 heures post-infection. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig4.jpg" /> Figure 4. Plaques MNV-1 dans la cellule formes monolayers. Montré ici est une plaque plaque représentant test 48 heures après l&#39;infection, montrant plaques colorées avec une solution de coloration au rouge neutre après 1 heure d&#39;incubation. La plaque montre deux puits de trois 10-dilutions. Wells étiquetés avec chiffres romains I et IV correspondent à la dilution 10-1, II et V correspondent à la dilution 10-2, III et VI correspondent à la dilution 10-3. Le titre viral de l&#39;échantillon est indiquée ci-dessous (voir la section 4.5 pour les détails du calcul).

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	<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+norovirus:+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis.">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li><li>Condit, R. C., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Fields Virology. 1, 25-58 (2007).</li><li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence.">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+estimating+50%+endpoints.">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li><li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection.">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li><li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute.">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435 (2011).</li><li>Cox, C., Cao, S., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+and+study+of+murine+norovirus-1+using+a+more+efficient+microglial+cell+line.">Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line.</a> Virology journal. 6, 196 (2009).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway.">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li><li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses.">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode de dosage de la plaque de MNV-1 présenté ici est un moyen de quantifier les particules infectieuses MNV. En suivant les étapes de l&#39;analyse illustrés à la figure 3, on peut obtenir des titres viraux reproductibles. La limite de détection du dosage dépend de la dilution de départ utilisé. Lors du démarrage d&#39;une dilution 1:10 de l&#39;échantillon tel que décrit ci-dessus, la limite de détection du test est la plaque 10 pfu (soit 1 plaque visible à la dilution à 10 -1). Étant donné que chaque plaque représente un seul virus, le dosage de la plaque peut également être utilisé pour purifier des populations clonales de MNV en choisissant plaques isolées et leur multiplication comme décrit précédemment 1. En outre, purifications sur plaque peut également être utilisé pour séparer une population de virus individuel de populations virales mixtes. Une limitation de l&#39;utilisation d&#39;une plaque d&#39;essai pour la détection de l&#39;infection MNV est que toutes les souches MNV former des plaques 4. Toutefois, il peut être possible de surmonter la inabilité de certaines souches MNV, isolés chez les animaux, pour former des plaques en série passages de ces virus dans 7 la culture de tissus. Une alternative à l&#39;essai de plaque est de mesurer les particules infectieuses par la technique DICT 50 3, 4. Ce test quantifie la quantité de virus nécessaire pour produire CPE dans 50% des cellules de culture tissulaire inoculés après dilutions de point final et prend 1 semaine à remplir pour MNV 4. En plus d&#39;être plus lent qu&#39;un essai de plaque, le test TCID 50 n&#39;est pas aussi sensible (limite de détection = 200 DICT 50 / ml) en raison de la toxicité des échantillons de tissus pour des cellules RAW 264.7 4. Bien que les étapes critiques dans le protocole ont été décrites dans le protocole, la section suivante fournit un résumé pour faciliter le dépannage. L&#39;étape la plus critique dans le protocole est de faire en sorte que les cellules RAW 264.7 rester viable tout au long de l&#39;essai à charge la réplication du virus. Cela peutêtre contrôlés à chaque étape de l&#39;analyse par microscopie optique. La viabilité cellulaire est assurée de deux façons. Tout d&#39;abord, il faut prendre soin de ne pas laisser sécher les cellules lors de la manipulation des plaques. Ainsi, les plaques sont inoculées une à la fois, bercé pendant la période d&#39;infection, et doit rester fermé quand ils ne sont pas traitées. Deuxièmement, les solutions ajouté sur les cellules doivent être équilibrés à ~ 37 ° C En outre, il est vital pour la santé globale des cellules RAW 264.7 de les maintenir dans un milieu contenant une endotoxine sérique basse (&lt;10 EU / ml), ce qui limite l&#39;activation des cellules. En outre, nous avons observé un taux d&#39;échec plus élevé de l&#39;essai de plaque lors de l&#39;utilisation des cellules de passage 30 ou supérieur. Bien que cela va probablement varier d&#39;un laboratoire à l&#39;autre, il est important d&#39;inclure un contrôle positif (par exemple, un échantillon avec un titre connu virale) afin d&#39;assurer la reproductibilité des titres, en particulier lors de l&#39;utilisation plus élevés passage des cellules RAW 264.7. Pour limiter l&#39;utilisation de cellules de passage plus élevées, il est conseillé de congeler les flacons de début passacellules ge à la réception de cellules RAW 264.7 et commencer une nouvelle culture des flacons congelés fréquemment. Starting over avec de faibles cultures de cellules de passage sera également utile lorsque les cellules présentent des caractéristiques altérées, comme le non-respect, des changements dans la morphologie des cellules (par exemple de rond à grêles et étalées), ou lorsque contamination par des mycoplasmes a été détectée. Un autre point important de faire attention à faire en sorte que les embouts de pipette sont changés entre les échantillons et pendant les dilutions. Cela permettra d&#39;assurer précises dilutions en série et à prévenir la contamination croisée entre les échantillons. L&#39;étape dans le protocole une où le même embout de pipette peut être utilisée à nouveau, c&#39;est quand dilutions en série d&#39;un même échantillon sont ajoutés dans les puits. Dans ce cas, on devrait commencer à partir de l&#39;inoculum plus dilué à tout le moins, et vigoureusement pipette de haut en bas lors de l&#39;élaboration d&#39;une nouvelle dilution. Le protocole de dosage de la plaque est modifiable à plusieurs modifications. Une modification qui peut être fait lorsque tici ne sont pas assez de cellules pour inoculer des puits en double exemplaire consiste à inoculer qu&#39;un seul puits pour chaque dilution. Toutefois, étant donné le volume d&#39;inoculum est de 0,5 ml, le nombre de plaques doit ensuite être multiplié par un facteur de 2 à normaliser à pfu / ml. Le dosage de la plaque peut également être adapté pour être utilisé avec n&#39;importe quelle autre lignée cellulaire adhérente qui est capable de supporter la réplication de MNV, et cela a été décrit pour la lignée murine microgliale BV-2 8 cellules. D&#39;autres modifications qui peuvent être mises en œuvre sont des adaptations qui ont été décrits pour les protocoles d&#39;essais développés plaque pour d&#39;autres virus. En cas de MNV, les modifications suivantes ont déjà été mis en œuvre avec succès, l&#39;utilisation de la cellulose de méthyle au lieu d&#39;une plaque d&#39;agarose Mer 9, et la coloration des cellules avec du cristal violet ou bleu de méthylène au lieu de rouge neutre 10, 11. Dans l&#39;ensemble, ce protocole peut facilement être adapté selon les besoins de quantifier les autres formatrices de plages virus ou utilisés pour other virus qui causent des infections lytiques dans des cellules RAW 264.7, ce qui en fait un outil utile pour quantifier les particules virales infectieuses en général.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> DMEM / glucose élevé </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2x MEM </td><td> Gibco </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> 100x pénicilline et de la streptomycine </td><td> Hyclone </td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10 mM non-acides aminés essentiels </td><td> Hyclone </td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Hyclone </td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 mM (100x) L-glutamine </td><td> Hyclone </td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Gibco, Hyclone </td><td> 10437, SH30070.02 </td></tr><tr><td> Plaque mer Agarose </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> Rouge neutre 0,33% </td><td> Sigma </td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010 </td></tr><tr><td> 1,0 mm en zircone / silice perles </td><td> Produits BIOSPEC </td><td> 11079110z </td></tr><tr><td> Rocker Speed ​​Modèle 35 </td><td> Labnet </td><td> S2035 </td></tr><tr><td> Instrument Lyser Magna </td><td> Roche </td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> RAW 264.7 lignée cellulaire </td><td> ATCC </td><td> TIB-71 </td></tr><tr><td> Incubateur de culture tissulaire </td><td> Sanyo </td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

plaque assay for murine norovirus

Norovirus murin (MNV) est le seul membre du genre Norovirus qui pousse efficacement en 1 culture de tissu, 2. La lyse cellulaire et l&#39;effet cytopathogène (ECP) sont observées pendant MNV-1 infection des cellules dendritiques ou des macrophages murins 1. Cette propriété de MNV-1 peut être utilisé pour quantifier le nombre de particules infectieuses dans un échantillon donné en effectuant un essai de 1 plaque. Le dosage de la plaque repose sur la capacité de MNV-1 pour lyser les cellules et pour former des trous dans une monocouche confluente de cellules, qui sont appelées des plaques 3. De multiples techniques peuvent être utilisées pour détecter les infections virales en culture de tissu, tissu récolté, cliniques, et les échantillons environnementaux, mais ne mesurent pas tous le nombre de particules infectieuses (p. ex qRT-PCR). Une façon de quantifier les particules virales infectieuses est d&#39;effectuer un test de la plaque 3, qui sera décrit plus en détail ci-dessous. Une variation sur le dosage de la plaque MNV est le fluordosage accent escent, où l&#39;antigène est MNV immunocolorées en 4 monocouches de cellules. Ce test peut être plus rapide, puisque l&#39;expression des antigènes viraux précède la formation de plaques. Il est également utile pour le titrage de virus sont incapables de former des plaques. Cependant, le dosage accent fluorescente nécessite des ressources supplémentaires au-delà de celles de l&#39;essai de plaque, comme les anticorps et d&#39;un microscope à compter accent unités formatrices. MNV infectieux peut également être quantifiée par la détermination de la dose dans les tissus de 50% de la culture infectieuse (DICT 50) 3. Ce test mesure la quantité de virus nécessaire pour produire CPE dans 50% des cellules de culture tissulaire inoculés de 5 titrage à point final. Cependant, la limite de détection est plus élevé par rapport à un 4 essai de plaque. Dans cet article, nous décrivons un protocole de dosage plaque qui peut être utilisé efficacement pour déterminer le nombre de particules infectieuses MNV présents dans les échantillons biologiques ou environnementaux 1, 4, 6. Cette méthode est based sur la préparation de 10 dilutions en série de MNV échantillons contenant, qui sont utilisés pour inoculer une monocouche de cellules permissives (cellules RAW 264.7 murines macrophages). Virus est autorisé à joindre à la monocouche de cellules pendant une période de temps donnée et ensuite aspiré avant de recouvrir les cellules avec un mélange d&#39;agarose et de milieux de culture cellulaire. L&#39;agar-agar permet la propagation de la descendance virale aux cellules voisines tout en limitant la propagation des cellules situées loin. Par conséquent, les cellules infectées sont lysées et les trous de formulaires dans la monocouche connu sous le nom de plaques. Lors de la propagation du virus suffisante, les plaques deviennent visibles coloration suivante de cellules avec des colorants, comme le rouge neutre, le bleu de méthylène, ou cristal violet. À de faibles dilutions, chaque plaque provient d&#39;une particule virale infectieuse et sa descendance, qui se propager aux cellules voisines. Ainsi, en comptant le nombre de plaques permet de calculer unités formatrices de plages (UFP) présents dans l&#39;échantillon non dilué 3.

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Plaque Assay for Murine Norovirus

Nous décrivons ici une méthode pour quantifier les particules infectieuses de norovirus murin (MNV), qui est le norovirus seulement que se réplique efficacement en culture cellulaire. Le dosage de la plaque profite du tropisme MNV pour les macrophages murins et peut être adapté pour une utilisation avec des échantillons biologiques ou environnementaux contenant MNV.

Essai de plaque pour le norovirus murin

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

54.1K vues.  University of Michigan, Ann Arbor. Nous décrivons ici une méthode pour quantifier les particules infectieuses de norovirus murin (MNV), qui est le norovirus seulement que se réplique efficacement en culture cellulaire. Le dosage de la plaque profite du tropisme MNV pour les macrophages murins et peut être adapté pour une utilisation avec des échantillons biologiques ou environnementaux contenant MNV.

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Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Modèle murin de CD40-activation des cellules B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Recherche

Immunologie et infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Débit analyse par cytométrie de cellules immunitaires dans aortes murin

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

Génétique inverse de récupération des norovirus murin médiation infectieuses

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

Isolement, identification et la purification de cellules murines thymique épithéliales

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Détermination de la concentration virale par Plaque Essais: Systèmes calque à l&#39;aide traditionnels et nouveaux

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Un modèle murin du Groupe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonisation

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab Méthode d&#39;échantillonnage pour la détection des norovirus humains sur les surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain insight into an ongoing disease state.
Here, a simple and efficient method is described to perform BAL on murine lungs without the need of special tools or equipment. BAL fluid is isolated by inserting a catheter in the trachea of terminally anesthetized mice, through which a saline solution is instilled into the bronchioles. The instilled fluid is gently retracted to maximize BAL fluid retrieval and to minimize shearing forces. This technique allows the viability, function, and structure of cells within the airways and BAL fluid to be preserved.
Numerous techniques may be applied to gain further understanding of the disease state of the lung. Here, a commonly used technique for the identification and enumeration of different types of immune cells is described, where&#160;flow cytometry is combined with a select panel of fluorescently labeled cell surface-specific markers. The BAL procedure presented here can also be used to analyze infectious agents, fluid constituents, or inhaled particles within murine lungs.

The health status of the lung is reflected by the type and number of immune cells that are present in the bronchioles of the lung. We describe a bronchoalveolar lavage technique that allows the isolation and study of nonadherent cells and soluble factors from the lower respiratory tract of mice.

Lavage bronchoalvéaire des poumons murins pour analyser l&#39;infiltration cellulaire inflammatoire

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

Préparation du murin des glandes salivaires sous-maxillaires pour la microscopie intravitale verticale

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;