This work was supported by the Lehigh University Start-up Package. We thank Dr. Walter Fast for providing the GST-PAD4 plasmid for protein expression.

1. PAD4 transformation, expression et la purification <ol><li> Pour PAD4 Transformation, transformer le plasmide pGEX contenant PAD4 TPS fusion dans E. chimiquement compétent Coli (BL21 (DE3)), les cellules pour l&#39;expression de protéine en utilisant la procédure suivante. Préparer chimiquement compétente (chlorure de calcium) E. Coli (BL21 (DE3)), les cellules selon les protocoles standards. <ol><li> 50 ul de dégel préalablement préparée chimiquement compétente BL21 (DE3), les cellules sur de la glace et mélanger avec 1 ul du plasmide pGEX PAD4 contenant le gène dans un tube de culture de 5 ml. Incuber le mélange sur de la glace pendant 10 min en agitant doucement toutes les 2 min. </li><li> Choc thermique des cellules en plaçant le mélange dans un bain d&#39;eau à 42 ° pendant 40 secondes. Placer immédiatement le mélange cellulaire plasmide retour sur la glace pendant 2 min pour permettre aux cellules de se rétablir. Ajouter 1 ml de bouillon LB stérile pour le mélange et le placer sur de la glace pendant 1 min. </li><li> Incuber la chaleur cellules choqué à 37 ° C, en agitant à 250 rpm pendant 1h. Introduire à la pipette 75 ul de cellules transformées sur une plaque de gélose à l&#39;ampicilline et résistant à incuber à 37 ° C pendant 15 heures. plaque de magasin à 4 ° C. </li></ol></li><li> Expression PAD4. <ol><li> Choisissez une colonie de BL21 (DE3) de la plaque de gélose à l&#39;ampicilline et le lieu dans 5 ml de LB contenant de l&#39;ampicilline 1x. Lieu dans l&#39;incubateur et secouer O / N à 37 ° C. </li><li> Transférer les 5 ml de LB (entrée) dans 1 L de milieu LB stérile contenant 1x trihydrate d&#39;ampicilline (MW 403,45 g / mol). Lieu croissance dans un incubateur à agitation à 37 ° C. Surveiller la DO 600 de la croissance. Lorsque la croissance atteint une DO 600 de 0,3, se déplacer en croissance de 16 ° C en secouant incubateur. </li><li> Après avoir atteint une DO 600 de 0,6, induire les cellules avec isopropylthiagalactoside 0,3 mM (IPTG, MW 238,30 g / mol). Permettent aux cellules de secouer pendant 15 heures à 16 ° C. </li><li> cellules de récolte par centrifugation à 4000 g pendant 20 min à 0 ° C. Verser le surnageant et magasin culot à -80 ° C. </li></ol></li><li> PAD4 Purification <ol><li> Remettre en suspension le culot contenant la PAD4 exprimée dans BL21 (DE3), les cellules dans un tampon de 50 mM de NaCl (MW 58,44 g / mol), 300 mM de NaH 2 PO 4 (MW 119,98 g / mol), 10 mM d&#39;imidazole (68,077 MW g / mol), 0,1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF, MW 174,94 g / mol) et mM de dithiothréitol (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8,0 1. </li><li> Lyser les cellules par traitement aux ultrasons pendant 15 min à 4 ° C. Suite à la sonification, centrifuger le lysat cellulaire à 20 000 x g pendant 20 min à 0 ° C. Décanter et conserver le surnageant. Lot le surnageant avec le glutathion (GSH), des billes d&#39;agarose pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Égoutter surnageant de la TPS perles / colonne par gravité. Laver les billes avec 4 x 25 ml de 1 x PBS (solution saline tamponnée au phosphate, pH = 8,0) à la température ambiante. </li><li> Eluer PAD4 avec 2 x 10 ml de tampon d&#39;élution, 50 mM de tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris Base, MW 121,14 g / mol), 10 mM de glutathion (GSH, MW 307,32 g / mol), pH = 8,0. </li><li> Concentrez PAD4 utilisant 100k MW coupe-otubes à centrifuger ff et centrifuger à 4000 g pendant 20 min à 4 ° C. protéines aliquote dans 200 volumes ul dans 1,0 ml microtubes et conserver à -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Préparation des solutions d&#39;achat d&#39;actions pour tampons <ol><li> Peser le chlorure de sodium (NaCl, MW 58,44 g / mol) et préparer une solution à 2 m. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire. </li><li> Peser Tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris base, MW 121.14 g / mol) et préparer une solution 2 M, pH = 8,0. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire. </li><li> Peser le chlorure de calcium dihydraté (CaCl 2 2H 2 O, MW 147,01 g / mol) et de préparer une solution 500 mM. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire. </li><li> Peser Tris (2-carboxyéthyl) phosphine (PTCE, MW 250.19 g / mol) et préparer une solution de 200 mM. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C. </li><li> Peser dithiothréitol (DTT, MW 154.25 g / mol) et préparer une solution à 1 M. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C. </li><li> Préparerune solution à 0,5% de Triton X-100. </li><li> Peser acide éthylène (EDTA, MW 292,24 g / mol) et préparer une solution à 100 mM. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire. </li><li> Peser Z- Arg Arg 7- amido 4- méthylcoumarine chlorhydrate (ZRcoum, MW 621,69 g / mol) et de préparer une solution à 10 mM dans du diméthylsulfoxyde (DMSO). </li></ol> 3. PAD4 test à 37 ° C <ol><li> De 10 mM ZRcoum mère, préparer une solution 125 uM de ZRcoum dans l&#39;eau. Cette solution 125 uM ZRcoum sera la solution A. </li><li> Préparer un tampon de 62,5 mM de NaCl, Tris 62,5 mM, 12,5 mM de CaCl2, 6,25 mM de DTT, et 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Ce sera la solution B. </li><li> Préparer un tampon de 62,5 mM de NaCl, Tris 62,5 mM, 12,5 mM de CaCl2 et 6,25 mM de DTT (pH = 8,0). Ce sera la solution C. </li><li> Peser la trypsine cristalline (provenant de pancréas de bovin) et de préparer un 10 mg / ml dans 100 mM d&#39;EDTA. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire et stocker à -20° C. Ce sera la solution D. </li><li> Obtenir une plaque de 96 puits et de désigner un certain nombre de puits pour les contrôles (pas PAD4) et les puits d&#39;essai (+ de pAD4). </li><li> Pipette 160 ul de solution B dans les puits d&#39;essai et pipette 160 ul de la solution C dans les puits de contrôle. Incuber pendant 15 min à 37 ° C. </li><li> Introduire à la pipette 40 ul de la solution A dans tous les puits et incuber à 37 ° C pendant 45 min. </li><li> Introduire à la pipette 10 ul de dH 2 O à la moitié des puits de contrôle et la moitié des puits d&#39;essai. Pour l&#39;autre moitié des puits de contrôle et des commandes de test, la pipette 10 ul de la solution D. incuber pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Obtenir une lecture de fluorescence sur un lecteur multimodal avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 345 nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 465 nm. </li></ol> 4. PAD4 test à température ambiante <ol><li> De 10 mM ZRcoum mère, préparer une solution à 50 uM de ZRcoum dans l&#39;eau. Cette solution de ZRcoum 50 uM sera la solution A. </li><li> Préparer un tampon de 100 mM NaCl, Tris 100 mM, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, 0,02% de Triton X-100, et 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Ce sera la solution B. </li><li> Préparation d&#39;un tampon de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, et 0,02% de Triton X-100 (pH = 8,0). Ce sera la solution C. </li><li> Peser la trypsine cristalline (provenant de pancréas de bovin) et de préparer un 10 mg / ml dans 100 mM d&#39;EDTA. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C. Ce sera la solution D. </li><li> Obtenir une plaque de 384 puits et désigner puits pour les contrôles (pas pAD4) et les puits d&#39;essai (+ de pAD4). </li><li> Pipette 25 ul de solution B dans les puits d&#39;essai et pipette 25 ul de la solution C dans les puits de contrôle. Autoriser tampon avec / sans PAD4 à incuber dans les puits pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Introduire à la pipette 25 ul de la solution C dans tous les puits et incuber pendant 45 min à température ambiante. </li><li> Introduire à la pipette 10 ul de dH 2 O à la moitié des puits de contrôle et la moitié des puits d&#39;essai. Pour l&#39;autre moitié des puits de contrôle et des commandes de test, pipette 10 ul de solution D. Incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Obtenir une lecture de fluorescence sur un lecteur multimodal avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 345 nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 465 nm. </li></ol> 5. pAD4 Temps cours dosages à 37 ° C et la température ambiante <ol><li> De 10 mM ZRcoum mère, préparer une solution 125 uM de ZRcoum dans l&#39;eau. Cette solution 125 uM ZRcoum sera la solution A. </li><li> Préparer un tampon de 62,5 mM de NaCl, Tris 62,5 mM, 12,5 mM de CaCl2, 6,25 mM de DTT, et 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Ce sera la solution B. </li><li> Peser la trypsine cristalline (provenant de pancréas de bovin) et de préparer un 10 mg / ml dans 100 mM d&#39;EDTA. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C. Ce sera la solution C. </li><li> Obtenir 2 plaques à 96 puits et pipette 160 ul de solution B dans # montant de puits (nombre de puits dépendra du nombre de points de temps). </li><li> Incuber une plaque de 96 puits à 37 ° C. Incuber la plaque 96 autre bien à température ambiante. </li><li> Topette 40 pi de la solution A dans tous les puits dans les plaques à 96 puits et immédiatement pipette 10 ul de la solution dans les puits C t = 0 min. Continuer l&#39;ajout de 10 ul de la solution C à des points de temps spécifiques jusqu&#39;à ce que tous les puits ont été trempés. </li><li> Obtenir une lecture de fluorescence sur un lecteur multimodal avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 345 nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 465 nm. </li></ol> 6. PAD4 test d&#39;inhibition à la température ambiante <ol><li> De 10 mM ZRcoum mère, préparer une solution 83 M de ZRcoum dans l&#39;eau. Cette solution de ZRcoum 83 uM sera la solution A. </li><li> Peser Cl-amidine (MW 424,8 g / mol) et préparer une solution stock de 100 pm. Ce sera la solution B. </li><li> Préparation d&#39;un tampon de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, 0,02% de Triton X-100, et 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Ce sera la solution C. </li><li> Préparation d&#39;un tampon de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, et 0,02% de Triton X-100 (pH = 8,0). Thest sera la solution D. </li><li> Peser la trypsine cristalline (provenant de pancréas de bovin) et de préparer un 10 mg / ml dans 100 mM d&#39;EDTA. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C. Ce sera la solution E. </li><li> Obtenir une plaque de 384 puits et désigner puits pour les contrôles (pas pAD4), puits d&#39;essai (+ pAD4), et les puits d&#39;inhibition (PAD4 + Cl-amidine). </li><li> Pipette 25 ul de la solution C dans les puits d&#39;essai et pipette 25 ul de la solution D dans les puits de contrôle. Autoriser tampon avec / sans PAD4 à incuber dans les puits pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Pipette de 10 pi de solution B dans les puits d&#39;inhibition et incuber pendant 20 min à RTE. </li><li> Introduire à la pipette 15 ul de la solution A dans tous les puits et incuber pendant 45 min à température ambiante. </li><li> Introduire à la pipette 10 ul de la solution E à tous les puits. Incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Obtenir une lecture de fluorescence sur un lecteur multimodal avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 345 nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 465 nm. </li></ol> 7. cellulaire brut lysat Assayà la température ambiante <ol><li> Après la récolte des cellules à partir de PAD4 croissance de 1 L, remettre les cellules dans 10 ml de Tris 50 mM, NaCl 50 mM, 0,1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF, MW 174,94 g / mol) et 1 mM de dithiothréitol (DTT, 154,25 g / mol), le pH = 8,0. </li><li> Lyser les cellules par traitement aux ultrasons pendant 15 min à 4 ° C. Centrifuger le lysat cellulaire à 20 000 x g pendant 20 min à 0 ° C. Concentrer le surnageant clair à la moitié du volume par centrifugation à 4000 rpm à 4 ° C en utilisant 100k MW tubes à centrifuger coupure. </li><li> De 10 mM ZRcoum mère, préparer une solution de 250 M de ZRcoum dans l&#39;eau. Cette solution 250 uM ZRcoum sera la solution A. </li><li> Préparation d&#39;un tampon de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, CaCl2 20 mM, et 2 mM de TCEP (pH = 8,0). Ce sera la solution B. </li><li> Peser la trypsine cristalline (provenant de pancréas de bovin) et de préparer un 10 mg / ml dans 100 mM d&#39;EDTA. Mélanger jusqu&#39;à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C. Ce sera la solution C. </li><li> Obtenir une plaque et la conception de 384 puits noirmangé puits de contrôle (pas de lysat cellulaire) et des puits de test (+ lysat cellulaire). </li><li> Introduire à la pipette 100 ul de solution B dans tous les puits et la pipette 60 ul de lysat de cellules dans des puits d&#39;essai. Incuber pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Introduire à la pipette 40 ul de la solution A dans tous les puits et incuber pendant 45 min à température ambiante. </li><li> Introduire à la pipette 10 ul de la solution C à tous les puits. Incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Obtenir une lecture de fluorescence sur le lecteur multimodal avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 345 nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 465 nm. </li></ol>

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	<li>Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+the+protein+language+using+proteomics.">Interpreting the protein language using proteomics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).</li><li>Sims, R. J., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+there+a+code+embedded+in+proteins+that+is+based+on+post-translational+modifications.">Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).</li><li>Pandey, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+to+study+genes+and+genomes.">Proteomics to study genes and genomes.</a> Nature. 405, 837-846 (2000).</li><li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+language+of+chromatin+regulation+during+transcription.">The complex language of chromatin regulation during transcription.</a> Nature. 447, 407-412 (2007).</li><li>Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binary+switches+and+modification+cassettes+in+histone+biology+and+beyond.">Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond.</a> Nature. 425, 475-479 (2003).</li><li>Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+chromatin-binding+modules+interpret+histone+modifications:+lessons+from+professional+pocket+pickers.">How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).</li><li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading+protein+modifications+with+interaction+domains.">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).</li><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+covalent+histone+modifications.">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403, 41-45 (2000).</li><li>Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD,+a+growing+family+of+citrullinating+enzymes:+genes,+features+and+involvement+in+disease.">PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease.</a> Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).</li><li>Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrullination:+a+posttranslational+modification+in+health+and+disease.">Citrullination: a posttranslational modification in health and disease.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).</li><li>Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localization+of+peptidylarginine+deiminase+V+and+histone+deimination+in+granulocytes.">Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).</li><li>Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deimination+of+histone+H2A+and+H4+at+arginine+3+in+HL-60+granulocytes.">Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes.</a> Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).</li><li>Kearney, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+characterization+of+protein+arginine+deiminase+4:+a+transcriptional+corepressor+implicated+in+the+onset+and+progression+of+rheumatoid+arthritis.">Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis.</a> Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).</li><li>Christophorou, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrullination+regulates+pluripotency+and+histone+H1+binding+to+chromatin.">Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin.</a> Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).</li><li>Wang, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidylarginine+deiminases+in+citrullination,+gene+regulation,+health+and+pathogenesis.">Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).</li><li>Trouw, L. A., Mahler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+serological+gap:+promising+novel+biomarkers+for+the+early+diagnosis+of+rheumatoid+arthritis.">Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis.</a> Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).</li><li>Chang, X., Fang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PADI4+and+tumourigenesis.">PADI4 and tumourigenesis.</a> Cancer Cell Int. 10, 7 (2010).</li><li>Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+peptidylarginine+deiminase+type+4+in+ovarian+tumors.">Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors.</a> Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).</li><li>Chang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+pathogenic+role+of+PADI4+in+oesophageal+cancer.">Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer.</a> Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+PADI4+cooperates+with+Elk-1+to+activate+c-Fos+expression+in+breast+cancer+cells.">Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells.</a> PLoS Genet. 7, (2011).</li><li>Tanikawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+histone+modification+and+chromatin+structure+by+the+p53-PADI4+pathway.">Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway.</a> Nat. Commun. 3, 676 (2012).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+microRNA-16+in+colon+cancer+cells+by+protein+arginine+deiminase+inhibition+causes+a+p53-dependent+cell+cycle+arrest.">The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest.</a> PLos One. 8, (2013).</li><li>Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+deiminase+4+(PAD4):+Current+understanding+and+future+therapeutic+potential.">Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential.</a> Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+p53+target+gene+expression+by+peptidylarginine+deiminase+4.">Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4.</a> Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticancer+peptidylarginine+deiminase+(PAD)+inhibitors+regulate+the+autophagy+flux+and+the+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+activity.">Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity.</a> J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).</li><li>Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+deiminase+4:+a+target+for+an+epigenetic+cancer+therapy.">Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).</li><li>Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluoroacetamidine-based+inactivator+of+protein+arginine+deiminase+4:+design,+synthesis,+and+in+vitro+and+in+vivo+evaluation.">A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+kinetic+studies+of+PADs.">Substrate specificity and kinetic studies of PADs.</a> Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).</li><li>Knipp, M., Vasak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorimetric+96-well+microtiter+plate+assay+for+the+determination+of+enzymatically+formed+citrulline.">A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline.</a> Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluopol-ABPP+HTS+assay+to+identify+PAD+inhibitors.">A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors.</a> Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).</li><li>Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+citrulline:+development+of+a+phenylglyoxal-based+probe+to+visualize+protein+citrullination.">Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).</li><li>Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+protein+arginine+deiminase+activity+by+using+fluorescence+quenching:+multicolor+visualization+of+citrullination.">Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).</li><li>Jones, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+screening+of+a+haloacetamidine+containing+library+to+identify+PAD4+selective+inhibitors.">Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors.</a> ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).</li><li>Dreyton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).</li><li>Shimoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deimination+stabilizes+histone+H2A/H2B+dimers+as+revealed+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4:+functional+and+structural+characterization.">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Herein, a fluorescence based assay was successfully developed that monitors the activity of PAD4. The assay has proven to be incredibly robust in a number of high-throughput conditions and is also compatible with whole cell lysates37.
The affinity between the histone proteins and the DNA strands surrounding it loosens due the neutralization of the positive charge on the arginine side chain upon citrullination. It was envisioned that the neutralization of the arginine side-chain coul...

Un grand nombre de protéines de mammifères sont fortement modifiées par l&#39;action d&#39;enzymes suivant la biosynthèse des protéines par le ribosome. Ces modifications post-traductionnelles (MPT) peuvent augmenter considérablement la diversité fonctionnelle du protéome en changeant la taille, la charge, la structure et l&#39;état d&#39;oligomérisation (entre autres fonctions) de protéines 1-3. En conséquence, le changement de structure de la protéine peut avoir des conséquences physiologiques, tels que la dégradation des protéines, la différenciation cellulaire, la signalisation, la modulation de l&#39;expression génique, et les interactions protéine-protéine. Bien que ces modifications sont répandues dans un grand pourcentage de toutes les protéines humaines, le terminal se termine sur des protéines histones subissent un nombre anormalement élevé de modifications covalentes 4. protéines histones sont une famille de protéines de structure qui facilitent la condensation de l&#39;ADN génomique. Des modifications covalentes des queues d&#39;histones non structurées sont effectuées et réglées par une séries d&#39;enzymes capables de catalyser la modification covalente de résidus (écrivains), inverser les mêmes modifications (gommes à effacer), et la distinction entre les changements étant imprimé sur les queues d&#39;histones (lecteurs) 5-7. En fait, la plupart des PTM connus peut être observé dans ce court segment de l&#39;histone y compris la méthylation, phosphorylation, acétylation, sumoylation, ubiquitination, et citrullination 8. Citrullination implique la conversion de peptidyl-arginine de l&#39;ARN t non codé peptidyl-citrulline (figure 1A). Les protéines, responsables de cette neutralisation de la chaîne latérale, sont membres de la PAD (p eptide un d eiminase rginine) famille de protéines, qui sont des enzymes dépendant du calcium. 9,10. À ce jour, cinq membres de la famille de PAD ont été décrits (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, et PAD6). Chaque membre de cette famille semble cibler des protéines cellulaires distincts et affiche également uniprofils de distribution tissulaire Qué. PAD4 est le seul membre de cette famille de protéines connues pour être localisée dans le noyau par l&#39;intermédiaire d&#39;une séquence de localisation nucléaire 11. En conséquence, il a été démontré que deiminate un certain nombre de cibles nucléaires, y compris les chaînes latérales d&#39;arginine sur les queues N-terminales des histones H2A arginine résidu 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17, et H3R26) et H4 (H4R3) 12, 13. Bien que chacune des isoenzymes de la PAD ont des fonctions physiologiques spécifiques et critiques, PAD4 a reçu beaucoup plus d&#39;attention en raison de son rôle dans un certain nombre de processus humains à la fois les cellules saines et malades. Récemment, PAD4 a été montré pour être un membre du réseau de la transcription de la pluripotence 14. Les deux niveaux d&#39;expression et de l&#39;activité pAD4 ont été montrés à être élevé lors de la reprogrammation et l&#39;Etat-sol Etats pluripotentes chez la souris. En contrôlant la régulation des gènes de cellules souches, PAD4 peut conserver un rôle central dans l&#39;efficacité de la reprogrammation cellulaire. PAD4 a également été impliquée dans laformation de pièges extracellulaires neutrophiles, qui lors de la liaison des agents pathogènes permettre leur dégagement du système. Le hypercitrullination de protéines histones par PAD4 induit la décondensation de la chromatine, qui sert de matériau de base pour l&#39;encapsulation de bactéries pathogènes par le piège extracellulaires, ainsi éloigner les infections bactériennes 15,16. En outre, PAD4 a été trouvé à jouer un rôle actif dans un certain nombre de maladies humaines. Il a été précédemment montré que l&#39;expression aberrante de PAD4 est associé à l&#39;apparition et la gravité de la polyarthrite rhumatoïde, la maladie d&#39;Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques et 17. En fait, la présence d&#39;anticorps anti-protéine est une citrullinés des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques fiables et les plus définitives de la polyarthrite rhumatoïde 18. De même, l&#39;activité dérégulée PAD4 a récemment été observé dans un certain nombre de cancers humains, y compris de l&#39;ovaire, du sein, du poumon, und cancers de l&#39;œsophage 19-22. Le lien entre PAD4 et le cancer a été montré être médiée par l&#39;oncogène ELK1 ou via la p53 protéine suppresseur de tumeur et 22,23 travaux antérieurs ont suggéré que PAD4 pourrait être un anti-cancer cible thérapeutique 17,24,25. En tant que preuve de principe étude, l&#39;épuisement des PAD4 via shRNA dans la lignée de cellules de cancer colorectal HCT116 a été révélée être suffisante pour induire l&#39;apoptose et arrêt du cycle cellulaire 26. Inhibiteur irréversible de PAD4 récemment développé a conduit à une réduction de soixante-dix pour cent de la masse tumorale chez les souris 27. Tout à fait remarquable, PAD4 inhibition semble agir comme une thérapie ciblée qui conduit à une destruction sélective des cellules cancéreuses tout en épargnant les cellules non transformées. L&#39;utilisation de petites molécules pour désactiver la fonction de PAD4 peut se révéler être une nouvelle stratégie efficace pour cibler les cellules cancéreuses ou d&#39;augmenter les agents chimiothérapeutiques contre le cancer 28 existantes. Malheureusement, un poinhibiteur de PAD4 réversible de la tente n&#39;a pas encore été découvert. Un certain nombre d&#39;inhibiteurs covalents ont été développés en utilisant la chloro / poignée de imidine fluoro qui imite le substrat arginine 27,29,30 et se sont révélés être des outils pratiques pour comprendre le rôle de PAD4 dans les cellules de l&#39;État sains et malades. Cependant, ces molécules inhibent tous les DPA actifs avec une activité similaire. Par conséquent, la nécessité d&#39;un dosage facile que les rapports sur l&#39;activité de PAD4 est crucial. À ce jour, pAD4 essais ont été décrits qui pointent le rejet de l&#39;ammoniac à partir de la réaction à une lecture colorimétrique 31, utiliser un analogue de substrat de chloroamidine marqué par fluorescence pour l&#39;analyse de polarisation de fluorescence 32, compter sur la réaction acide-assistée entre glyoxal et citrulline 33, et coupler l&#39;activité PAD4 à une fluorescence étape 34 dequenching. Parmi ceux-ci, seul le modificateur de stratégie haloacetamidine covalente est avéré être compatible avec scre à haut débitplates-formes Ening 32,35,36. Nous décrivons un test basé sur la fluorescence facile qui mesure de façon fiable l&#39;activité de PAD4. L&#39;essai, qui présente un fort rapport signal-sur-bruit, la vitesse d&#39;analyse, et la robustesse de la mesure, est susceptible de découvrir un inhibiteur de PAD4 vraiment puissant et sélectif.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="716">
	<tbody>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:192px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:123px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:267px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:192px;">LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)</td>
			<td style="width:123px;">Amresco</td>
			<td style="width:135px;">J106-2KG</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.amresco-inc.com/">http://www.amresco-inc.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:192px;">Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP902-25&#160;</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.fishersci.com/">http://www.fishersci.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:192px;">Isopropylthiagalactonse (IPTG)</td>
			<td style="width:123px;">Life Technogolies</td>
			<td>15529-019</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:192px;">All Buffer Salts&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;">Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:192px;">Protino Glutathione (GSH) agarose&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Machery-Nagel</td>
			<td style="width:135px;">745500.10</td>
			<td style="width:267px;">Store at 4 &#176;C; http://www.mn-net.com/</td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:192px;">Z-&#8203;Arg-&#8203;Arg-&#8203;7-&#8203;amido-&#8203;4-&#8203;methylcoumarin hydrochloride (Zcoum)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C5429</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:192px;">Chloroamidine&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Cayman Chemical&#160;</td>
			<td style="width:135px;">10599</td>
			<td style="width:267px;">Store at -20 &#176;C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:192px;">Tris(2-&#8203;carboxyethyl)&#8203;phosphine hydrochloride (TCEP HCl)</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientifc</td>
			<td style="width:135px;">20490</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.piercenet.com/">http://www.piercenet.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:192px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">X100-100ML</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:192px;">Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384)</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;">Purchase from Corning; Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:192px;">Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.tecan.com/">www.tecan.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:192px;">Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.perkinelmer.com/">http://www.perkinelmer.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-based monitoring of pad4 activity via a pro-fluorescence substrate analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

Dans un premier temps, il a été démontré que ZRcoum peut rendre compte de l&#39;activité de PAD4 dans un format de plaque à 96 puits. Les puits ont été incubés avec la ZRcoum de substrat et en présence / absence de PAD4. Après une période d&#39;incubation de 45 min à 37 ° C, la fluorescence a été mesurée avec un 340/40-475/15 nm filtre (figure 2A). Comme prévu, les niveaux de fluorescence sont restés faibles comme le fluorophore dans ZRcoum</s...

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Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

Suivi par fluorescence de PAD4 activité via un analogue de substrat Pro-fluorescence

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

9.8K vues.  Lehigh University. PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

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Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice through their ice-binding surfaces. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modified technique used to determine the ice planes to which the AFPs bind. FIPA is based on the original ice-etching method for determining AFP-bound ice-planes. It produces clearer images in a shortened experimental time. In FIPA analysis, AFPs are fluorescently labeled with a chimeric tag or a covalent dye then slowly incorporated into a macroscopic single ice crystal, which has been preformed into a hemisphere and oriented to determine the a- and c-axes. The AFP-bound ice hemisphere is imaged under UV light to visualize AFP-bound planes using filters to block out nonspecific light. Fluorescent labeling of the AFPs allows real-time monitoring of AFP adsorption into ice. The labels have been found not to influence the planes to which AFPs bind. FIPA analysis also introduces the option to bind more than one differently tagged AFP on the same single ice crystal to help differentiate their binding planes. These applications of FIPA are helping to advance our understanding of how AFPs bind to ice to halt its growth and why many AFP-producing organisms express multiple AFP isoforms.

Antifreeze proteins (AFPs) bind to specific planes of ice to prevent or slow ice growth. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modification of the original ice-etching method for determination of AFP-bound ice planes. AFPs are fluorescently labeled, incorporated into macroscopic single ice crystals, and visualized under UV light.

Détermination des plans de liaison à la glace des protéines antigel par affinité du plan de glace basée sur la fluorescence

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Recherche

Chimie

Preparing Silica Aerogel Monoliths via a Rapid Supercritical Extraction Method

A procedure for the fabrication of monolithic silica aerogels in eight hours or less via a rapid supercritical extraction process is described. The procedure requires 15-20 min of preparation time, during which a liquid precursor mixture is prepared and poured into wells of a metal mold that is placed between the platens of a hydraulic hot press, followed by several hours of processing within the hot press. The precursor solution consists of a 1.0:12.0:3.6:3.5 x 10-3 molar ratio of tetramethylorthosilicate (TMOS):methanol:water:ammonia. In each well of the mold, a porous silica sol-gel matrix forms. As the temperature of the mold and its contents is increased, the pressure within the mold rises. After the temperature/pressure conditions surpass the supercritical point for the solvent within the pores of the matrix (in this case, a methanol/water mixture), the supercritical fluid is released, and monolithic aerogel remains within the wells of the mold. With the mold used in this procedure, cylindrical monoliths of 2.2 cm diameter and 1.9 cm height are produced. Aerogels formed by this rapid method have comparable properties (low bulk and skeletal density, high surface area, mesoporous morphology) to those prepared by other methods that involve either additional reaction steps or solvent extractions (lengthier processes that generate more chemical waste).The rapid supercritical extraction method can also be applied to the fabrication of aerogels based on other precursor recipes.

This article describes a rapid supercritical extraction method for fabricating silica aerogels. By utilizing a confined mold and hydraulic hot press, monolithic aerogels can be made in eight hours or less.

Préparation de silice aérogel monolithes par une méthode d&#39;extraction rapide supercritique

A procedure for the fabrication of monolithic silica aerogels in eight hours or less via a rapid supercritical extraction process is described. The ...

Real-time Monitoring of Reactions Performed Using Continuous-flow Processing: The Preparation of 3-Acetylcoumarin as an Example

By using inline monitoring, it is possible to optimize reactions performed using continuous-flow processing in a simple and rapid way. It is also possible to ensure consistent product quality over time using this technique. We here show how to interface a commercially available flow unit with a Raman spectrometer. The Raman flow cell is placed after the back-pressure regulator, meaning that it can be operated at atmospheric pressure. In addition, the fact that the product stream passes through a length of tubing before entering the flow cell means that the material is at RT. It is important that the spectra are acquired under isothermal conditions since Raman signal intensity is temperature dependent. Having assembled the apparatus, we then show how to monitor a chemical reaction, the piperidine-catalyzed synthesis of 3-acetylcoumarin from salicylaldehyde and ethyl acetoacetate being used as an example. The reaction can be performed over a range of flow rates and temperatures, the in-situ monitoring tool being used to optimize conditions simply and easily.

Real-time monitoring allows for fast optimization of reactions performed using continuous-flow processing. Here the preparation of 3-acetylcoumarin is used as an example. The apparatus for performing in-situ Raman monitoring is described, as are the steps required to optimize the reaction.

Suivi en temps réel de réactions effectuées en utilisant traitement en flux continu: la préparation du 3-Acetylcoumarin comme un exemple

By using inline monitoring, it is possible to optimize reactions performed using continuous-flow processing in a simple and rapid way. It is also possible ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since the approval of romidepsin, a class I HDAC inhibitor for cancer therapy, and the clinical investigation of HDAC6-specific inhibitors for multiple myeloma. The present method is used to determine the inhibitory activity of test compounds on HDAC1 and HDAC6 in cells. The isoform activity is measured using the ultra-high-performance liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (UHPLC-MS) analysis of specific substrates incubated with treated and untreated HeLa cells. The method has the advantage of reflecting the endogenous HDAC activity within the cell environment, in contrast to cell-free biochemical assays conducted on isolated isoforms. Moreover, because it is based on the quantification of synthetic substrates, the method does not require the antibody recognition of endogenous acetylated proteins. It is easily adaptable to several cell lines and an automated process. The method has already proved useful in finding HDAC6-selective compounds in neuroblasts. Representative results are shown here with the standard HDAC inhibitors trichostatin A (non-specific), MS275 (HDAC1-specific), and tubastatin A (HDAC6-specific) using HeLa cells.

The present method serves to identify isoform-specific inhibitors of histone deacetylases (HDAC) in HeLa cells by the UHPLC-MS analysis of multiple substrates. This is an antibody-free method developed to reflect HDAC1 and HDAC6 activity in the living cell environment, in contrast to single-isoform cell-free assays.

Mesure simultanée de HDAC1 et de HDAC6 activité en HeLa cellules utilisant UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Fabrication and Testing of Catalytic Aerogels Prepared Via Rapid Supercritical Extraction

Protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms are presented. Three preparation methods are described: (a) the incorporation of metal salts into silica or alumina wet gels using an impregnation method; (b) the incorporation of metal salts into alumina wet gels using a co-precursor method; and (c) the addition of metal nanoparticles directly into a silica aerogel precursor mixture. The methods utilize a hydraulic hot press, which allows for rapid (&#60;6 h) supercritical extraction and results in aerogels of low density (0.10 g/mL) and high surface area (200-800 m2/g). While the work presented here focuses on the use of copper salts and copper nanoparticles, the approach can be implemented using other metal salts and nanoparticles. A protocol for testing the three-way catalytic ability of these aerogels for automotive pollution mitigation is also presented. This technique uses custom-built equipment, the Union Catalytic Testbed (UCAT), in which a simulated exhaust mixture is passed over an aerogel sample at a controlled temperature and flow rate. The system is capable of measuring the ability of the catalytic aerogels, under both oxidizing and reducing conditions, to convert CO, NO and unburned hydrocarbons (HCs) to less harmful species (CO2, H2O and N2). Example catalytic results are presented for the aerogels described.

Here we present protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms. Methods for preparing materials using copper salts and copper-containing nanoparticles are featured. Catalytic testing protocols demonstrate the effectiveness of these aerogels for three-way catalysis applications.

Fabrication et essai d’aérogels catalytiques préparés par Extraction supercritique rapide

Protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms are presented. Three ...

Synthesis of Substrate-Bound Au Nanowires Via an Active Surface Growth Mechanism

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a challenge, as it requires asymmetric growth of symmetric crystals. Here, we report a distinctive synthesis of substrate-bound Au nanowires. This template-free synthesis employs thiolated ligands and substrate adsorption to achieve the continuous asymmetric deposition of Au in solution at ambient conditions. The thiolated ligand prevented the Au deposition on the exposed surface of the seeds, so the Au deposition only occurs at the interface between the Au seeds and the substrate. The side of the newly deposited Au nanowires is immediately covered with the thiolated ligand, while the bottom facing the substrate remains ligand-free and active for the next round of Au deposition. We further demonstrate that this Au nanowire growth can be induced on various substrates, and different thiolated ligands can be used to regulate the surface chemistry of the nanowires. The diameter of the nanowires can also be controlled with mixed ligands, in which another &#34;bad&#34; ligand could turn on the lateral growth. With the understanding of the mechanism, Au nanowire-based nanostructures can be designed and synthesized.

We report a solution-based method to synthesize substrate-bound Au nanowires. By tuning the molecular ligands used during the synthesis, the Au nanowires can be grown from various substrates with different surface properties. Au nanowire-based nanostructures can also be synthesized by adjusting the reaction parameters.

Synthèse de nanofils Au substrat-bondissent Via un mécanisme de croissance de Surface Active

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a ...

A Two-Step Protocol for Umpolung Functionalization of Ketones Via Enolonium Species

&#945;-Functionalization of ketones via umpolung of enolates by hypervalent iodine reagents is an important concept in synthetic organic chemistry. Recently, we have developed a two-step strategy for ketone enolate umpolung that has enabled the development of methods for chlorination, azidation, and amination using azoles. In addition, we have developed C-C bond&#8211;forming arylation and allylation reactions. At the heart of these methods is the preparation of the intermediate and highly reactive enolonium species prior to addition of a reactive nucleophile. This strategy is thus reminiscent of the preparation and use of metal enolates in classical synthetic chemistry. This strategy allows the use of nucleophiles that would otherwise be incompatible with the strongly oxidizing hypervalent iodine reagents. In this paper we present a detailed protocol for chlorination, azidation, N-heteroarylation, arylation, and allylation. The products include motifs prevalent in medicinally active products. This article will greatly assist others in using these methods.

A two step one-pot protocol for the umpolung of ketone enolates to enolonium species and addition of a nucleophile to the &#945;-position is described. Nucleophiles include chloride, azide, azoles, allyl-silanes, and aromatic compounds.

Un protocole en deux étapes pour Umpolung fonctionnalisation de cétones par espèce de Enolonium

&#945;-Functionalization of ketones via umpolung of enolates by hypervalent iodine reagents is an important concept in synthetic organic chemistry. ...

Synthesis of Esters Via a Greener Steglich Esterification in Acetonitrile

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the reaction is commonly performed using chlorinated or amide solvent systems, which are hazardous to human health and the environment. Our methodology utilizes acetonitrile as a greener and less hazardous solvent system. This protocol exhibits rates and yields that are comparable to traditional solvent systems and employs an extraction and wash sequence that eliminates the need for the purification of the ester product via column chromatography. This general method can be used to couple a variety of carboxylic acids with 1&#176; and 2&#176; aliphatic alcohols, benzylic and allylic alcohols, and phenols to obtain pure esters in high yields. The goal of the protocol detailed here is to provide a greener alternative to a common esterification reaction, which could serve useful for ester synthesis in both academic and industrial applications.

A modified Steglich esterification reaction was used to synthesize a small library of ester derivatives with primary and secondary alcohols. The methodology uses a non-halogenated and greener solvent, acetonitrile, and enables product isolation in high yields without the need for chromatographic purification.

Synthèse des Esters Via une estérification de Steglich plus écologique dans l’acétonitrile

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the ...

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment screening. NMR-based activity assays are ideally suited to work at the higher concentrations of test compounds required to detect these weaker inhibitors. The dynamic range and chemical shift dispersion in an NMR experiment can easily resolve resonances from substrate, product, and test compounds. This contrasts with spectrophotometric assays, in which read-out interference problems often arise from compounds with overlapping UV-vis absorption profiles. In addition, since they lack reporter enzymes, the single-enzyme NMR assays are not prone to coupled-assay false positives. This attribute makes them useful as orthogonal assays, complementing traditional high throughput screening assays and benchtop triage assays. Detailed protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells. The methods are demonstrated using two nucleoside ribohydrolase enzymes. The use of 1H NMR is shown for the purine-specific enzyme, while 19F NMR is shown for the pyrimidine-specific enzyme. The protocols are generally applicable to any enzyme where substrate and product resonances can be observed and distinguished by NMR spectroscopy. To be the most useful in the context of drug discovery, the final concentration of substrate should be no more than 2-3x its Km value. The choice of NMR experiment depends on the enzyme reaction and substrates available as well as available NMR instrumentation.

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-based activity assays have been developed to identify and characterize inhibitors of two nucleoside ribohydrolase enzymes. Protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells.

Tests d'activité basés sur la RMN pour déterminer l'inhibition des composés, les valeurs IC50, l'activité artifactual et l'activité à cellules entières des ribohydrolases nucléoside

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, metal-binding interactions, and conformational shape. Coupling ESI with ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) provides an instrumental technique that allows for simultaneous measurement of a peptide&#8217;s mass-to-charge (m/z) and collision cross section (CCS) that relate to its stoichiometry, protonation state, and conformational shape. The overall charge of a peptide complex is controlled by the protonation of 1) the peptide&#8217;s acidic and basic sites and 2) the oxidation state of the metal ion(s). Therefore, the overall charge state of a complex is a function of the pH of the solution that affects the peptides metal ion binding affinity. For ESI-IM-MS analyses, peptide and metal ions solutions are prepared from aqueous-only solutions, with the pH adjusted with dilute aqueous acetic acid or ammonium hydroxide. This allows for pH dependence and metal ion selectivity to be determined for a specific peptide. Furthermore, the m/z and CCS of a peptide complex can be used with B3LYP/LanL2DZ molecular modeling to discern binding sites of the metal ion coordination and tertiary structure of the complex. The results show how ESI-IM-MS can characterize the selective chelating performance of a set of alternative methanobactin peptides and compare them to the copper-binding peptide methanobactin.

Ion mobility-mass spectrometry and molecular modeling techniques can characterize the selective metal chelating performance of designed metal-binding peptides and the copper-binding peptide methanobactin. Developing new classes of metal chelating peptides will help lead to therapeutics for diseases associated with metal ion misbalance.

Techniques de spectrométrie de mobilité-masse d'ion pour déterminer la structure et les mécanismes de la reconnaissance d'ion de métal et de l'activité de Redox des Oligopeptides de liaison de métal