Ce protocole présente une méthode pour imager en direct, voler l’assemblage de circuits olfactifs au niveau d’un seul axone à partir d’un cerveau en développement. dissection pour nettoyer le tissu recouvrant le cerveau en développement, nous pouvons collecter des images de haute qualité du cerveau interne. Cette méthode fournit des informations précieuses sur la base biologique cellulaire du développement de circuits.
Il peut être facilement modifié pour étudier le développement d’autres circuits. Il faut un certain temps pour qu’une personne effectue un contrôle stable de la main en microdissection. Plus de pratique sera utile.
Pour commencer, préparez le plat de culture pour mobiliser l’explante pendant l’imagerie en accéléré en posant un Sylgard de 0,5 centimètre d’épaisseur sur la surface inférieure d’une boîte de Pétri et en le laissant durcir pendant 48 heures à température ambiante. Pour préparer les micro-broches à l’immobilisation de l’explante sur cette plaque à l’aide de pinces, collez plusieurs micro-broches sur un ruban avec les extrémités tranchantes alignées d’un côté et coupez deux millimètres d’extrémités tranchantes avec des ciseaux. Ensuite, à l’aide des pinces, insérez les micro-broches coupées dans la couche Sylgard d’une plaque Sylgard préfabriquée.
À l’aide d’une brosse, collectez les nymphes blanches, qui forment du puparium en une heure et transférez-les dans un nouveau flacon. Incuber les nymphes dans le bain-marie tempéré à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes pour induire des clones ORN clairsemés de types aléatoires. Après un choc thermique, placez le flacon à 25 degrés Celsius pendant 30 heures, ce qui donne des nymphes âgées de 30 heures après la formation du puparium.
Ensuite, préparez le support de culture pour l’explantation comme décrit dans le manuscrit du texte et stockez à quatre degrés Celsius. Le jour de l’imagerie, ajouter le sérum fœtal bovin, la solution mère d’insuline humaine et la solution mère de 20 hydroxyecdysone se dissolvent dans l’éthanol dans un flacon de 50 millilitres contenant 45 millilitres de milieu drosophila de Schneider. Mélangez bien et transférez 15 millilitres du milieu complet dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et conservez le reste du milieu complet à quatre degrés Celsius pendant une semaine.
Ensuite, couvrez l’ouverture des tubes contenant un milieu plein avec un film de paraffine et oxygénez le milieu en pompant des bulles d’oxygène sous la surface du liquide à travers une pointe de pipette stérile de cinq millilitres à raison d’une bulle par seconde pendant 20 à 30 minutes. Ensuite, stérilisez la surface du puits de dissection et la plaque Sylgard préalablement préparée avec 70% d’éthanol et laissez-les sécher avant utilisation. Utilisez une brosse pour transférer 30 heures de pupe APF sur un papier de soie pour sécher la surface externe de la nymphe pendant cinq minutes.
Après avoir appliqué du ruban adhésif double face sur une lame de verre, fixez soigneusement la nymphe séchée à la surface collante du ruban adhésif avec la face dorsale vers le haut. Appuyez doucement sur la nymphe avec une brosse pour attacher correctement la face ventrale au ruban adhésif sans endommager la nymphe. Insérez une pointe pointue de la pince entre le boîtier de la nymphe brune et la nymphe du côté latéral et cassez soigneusement l’étui de la nymphe brune à travers une ligne jusqu’à l’extrémité postérieure de la nymphe.
Une fois le boîtier de nymphe brune ouvert, à l’aide de la pince, tenez doucement la nymphe et transférez-la dans le puits de dissection contenant un millilitre de milieu plein oxygéné. Immergez la nymphe dans le milieu pour l’enfoncer au fond du puits. Pour disséquer l’explantation cérébrale de l’antenne de la nymphe, tenez doucement la nymphe à l’aide d’une pince d’une main et à l’aide d’une paire de microcisseurs, créez un petit trou du côté postérieur de la nymphe, qui libère une pression élevée à l’intérieur de la nymphe.
En partant du trou, coupez à travers la ligne médiane ventrale jusqu’au cou, puis coupez à travers la circonférence du cou pour détacher la tête du corps de la nymphe et placer le corps dans un puits différent. Ensuite, coupez la cuticule transparente recouvrant la face dorsale du cerveau pour exposer le corps gras sur le dessus du cerveau, en veillant à garder la cuticule à laquelle la rétine et l’antenne se fixent et de même, coupez la cuticule du côté ventral du cerveau. Pipettez le milieu vers les régions ouvertes sur les côtés dorsal et ventral de la tête à l’aide d’une pipette P10 pour laver doucement le corps gras recouvrant le cerveau et l’antenne.
Pour étudier l’interaction des axones ORN bilatéraux ou des axones ORN avec le ciblage de la dendrite PN, coupez le nerf antenne pendant la scène en plaçant soigneusement les lames des microscisseurs entre la cuticule et le cerveau et coupez le nerf antenne intéressé. Pour transférer l’explante disséquée sur la plaque de Sylgard, placez environ 200 gouttelettes de microlitres du milieu complet oxygéné sur la surface de Sylgard. Pipettez le corps gras dérivé du tronc disséqué plusieurs fois à travers une pointe de pipette de 200 microlitres pour recouvrir la surface interne afin d’empêcher les explants de coller à la pointe de la pipette pendant le transfert du puits de dissection à la gouttelette moyenne sur la plaque Sylgard.
Utilisez les pinces pour épingler l’explantation sur la couche de Sylgard dans les deux lobes optiques, puis positionnez soigneusement la plaque de Sylgard sur la station d’imagerie, immobilisez la plaque avec des rubans et ajoutez lentement 10 millilitres du milieu complet oxygéné à la plaque de Sylgard à l’aide d’une pipette P1000. Les axones ORN arrivent au lobe de l’antenne entre 18 heures et 36 heures APF puis naviguent dans le lobe de l’antenne, traversent la ligne médiane et innovent les glomérules. Avant l’enregistrement, les axones présentaient une certaine dérive latérale au fur et à mesure que le cerveau se développait, et après l’enregistrement, la dérive était corrigée.
Les identités glomérulaires des axones ORN extraits ont été révélées par immunocoloration d’un marqueur de neuropil et de la cadhérine. En comparant à la carte du lobe interne, l’identité de chaque glomérule a pu être déterminée. Au cours de la culture ex vivo, la croissance des bactéries provoque généralement un développement reposé du circuit olfactif.
Par conséquent, il est important de bien stériliser le plat culturel et les épingles avant l’imagerie et de garder la salle d’imagerie propre et isolée. Pour obtenir une résolution temporelle spatiale plus élevée, ce système d’explant peut être imagé à l’aide d’un microscope plus avancé, le microscope optique à réseau adaptatif. Bien qu’un développement de circuit d’usine ait été montré ici à titre d’exemple, ce système peut potentiellement être étendu à l’étude d’autres circuits et processus de développement dans le cerveau central en développement.
