This work was supported by NIH-NINDS grant RO1-NS065895 and NIH-NINDS grant 5-F31-NS076250-02. 
We thank JHU SOM Microscope Facility for the use of the cryostat.

NOTE: Toutes les procédures d&#39;animaux décrits dans le présent protocole ont été réalisées en conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health 26. Le protocole (MO13M391) a été approuvé par le Comité Université soin et l&#39;utilisation des animaux Johns Hopkins. Sacrifice 1. néonatale souris, Dissection, et fixation <ol><li> Sacrifiez une souris néonatale par inhalation de CO 2. </li><li> Immédiatement couper la patte arrière au-dessus du genou. Jusqu&#39;au jour environ 7 postnatale, les os de la jambe sont assez doux pour couper à travers avec des ciseaux de laboratoire grandes ou lame tranchante et de l&#39;article par la suite sur un cryostat. </li><li> Placer la patte arrière dans 10 ml de glace froide 4% de paraformaldehyde dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans un tube de 15 ml. </li><li> Immersion fixer le membre postérieur au paraformaldéhyde pendant 4-24 heures à 4 ° C. Tissus embryonnaires nécessite seulement plusieurs heuress de la fixation. <ol><li> Évitez la fixation de plus de 24 heures, car cela peut réduire l&#39;efficacité de l&#39;essai TUNEL. </li></ol></li><li> Cryoprotect la patte arrière en l&#39;immergeant dans une solution de saccharose. <ol><li> Changer paraformaldehyde à 10% de saccharose dans du STP dans le même tube de 15 ml, incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Changement de saccharose à 30% dans du PBS, incuber une nuit à 4 ° C ou jusqu&#39;à ce que les puits des membres postérieurs au fond du tube. Tissu peut être laissé dans 30% de saccharose pendant une période plus longue, à condition que le saccharose a été stérilisée par filtration. </li></ol></li></ol> 2. Enrobage des tissus <ol><li> Remplir un moule intégration à mi-chemin marqué avec milieu d&#39;inclusion. </li><li> Passer membre postérieur sur le dessus du milieu d&#39;inclusion, avec la face de coupe la plus proche possible à une paroi du moule. Marquer l&#39;orientation de la patte arrière à l&#39;extérieur du moule. <ol><li> Incluez plusieurs membres postérieurs et couper dans le même bloc. Cependant, il est important de se assurer que tous hindlimbs dans le bloc sont orientés parallèlement les uns aux autres pour obtenir des sections correspondant à des niveaux le long de l&#39;axe du membre. </li></ol></li><li> Couvrir avec les membres postérieurs milieu d&#39;inclusion. Si hindlimbs Maj enfoncée tout en versant le milieu, les réorienter avec une pince à bout mousse ou un cure-dent. </li><li> Autoriser milieu d&#39;inclusion pour infiltrer le tissu à la température ambiante pendant au moins 15 min. </li><li> La place moules directement sur la glace sèche ou en isopentane sur glace sèche de geler milieu d&#39;inclusion. Assurez-vous de maintenir le niveau des moules en tout temps et éviter tout déplacement du tissu intégré. </li><li> Gardez moules congelées à -80 ° C jusqu&#39;au moment de couper, pendant plusieurs mois. </li></ol> 3. Cryosectioning embarqué Limbs <ol><li> Régler la température de la chambre cryostat à -20 ° C, température de l&#39;objet à -18 ° C; régler la température de l&#39;objet de la manière nécessaire. </li><li> Équilibrer le bloc de tissu à l&#39;intérieur de la chambre de cryostat pendant au moins 30 min. Bloc correcte températurerature est crucial pour la section qualité. </li><li> Couper des sections transversales d&#39;une épaisseur de 10 um ou moins. Sections plus épaisses ne seront pas entièrement pénétré par les réactifs TUNEL. Utilisez la plaque anti-roulis, lames, et l&#39;angle de la lame (typiquement 5 °) recommandé pour le cryostat. </li><li> Recueillir sections SUR DES gelatin- ou lames de verre vectabond revêtus à la température ambiante. Placez immédiatement dans une boîte de diapositives sur glace sèche. Gardez la boîte de diapositive dans un récipient séparé avec de la glace sèche est placé près du cryostat à portée de bras. <ol><li> Couper sections transversale série à travers le grand axe de la branche, en sautant 100-200 um. Collectez au moins 3 sections adjacentes à chaque niveau de série. </li></ol></li></ol> 4. TUNEL Essai sur les articles des membres postérieurs en utilisant un kit disponible dans le commerce (toutes les étapes à la température ambiante, sauf indication contraire) <ol><li> Décongeler diapositives avec des sections à température ambiante et sécher pendant la nuit ou le week-end. </li><li> Réhydrater sections par immersing lames dans du PBS pour 2 x 10 min dans une jarre de Coplin. Sécher avec un laboratoire lingette, retirer autant de liquide autour de la section que possible. </li><li> Sections perméabilisent <ol><li> Utilisez soit un non-protéolytique, basée saponine-réactif commercial ou 0,5% de Tween 20 et 0,05% de Triton X100 dans du PBS. </li><li> Placer la lame dans une chambre humide. Une chambre d&#39;humidité est simple: une boîte de pointe de la pipette vide avec un couvercle étanche, avec juste assez d&#39;eau ajoutée pour couvrir le fond de la boîte. </li><li> Pipette assez réactif sur la diapositive pour couvrir la section (50 pi est suffisante pour les membres de la souris néonatales). Ne pas pipette directement sur la section, que l&#39;agitation répétée peut provoquer la section de soulever hors de la diapositive. </li><li> En utilisant une pince à bout mousse, placez un petit rectangle de parafilm sur le dessus de la section d&#39;étaler la goutte de réactif et couvrir complètement la section. Si des bulles se forment sous la parafilm, soulevez doucement le tout, sec, et réappliquer. </li><li> Incuber les lames avec permeabiliréactif tion pendant 1 heure dans une chambre d&#39;humidité couverte. Si sections commencent à décoller de la diapositive, le temps de perméabilisation peut être réduite à 30 min. </li><li> Laver les lames dans du PBS dans une jarre de Coplin 2 x 5 min. Les rectangles de parafilm devraient flotter à la surface et peuvent ensuite être enlevé et jeté. </li><li> Utiliser un laboratoire lingette, sécher autant de liquide autour des sections que possible. </li></ol></li><li> TdT médiation étiquetage de cassure de l&#39;ADN <ol><li> Suivez les instructions du kit pour faire 1x tampon de l&#39;étiquetage TdT, tampon d&#39;étiquetage suffisamment de pipette sur la lame pour couvrir coupe de tissu (50 pi est suffisante pour les membres de la souris néonatales). Incuber dans la chambre humide pendant 5 min. Alternativement, immerger la lame dans du tampon de l&#39;étiquetage TdT dans un bocal de Coplin. </li><li> Suivez les instructions du kit pour faire TdT étiquetage mélange. Le kit comprend le cobalt, le magnésium, le manganèse et des cations; le cation manganèse fonctionne bien sur une variété de tissus, y compris le muscle squelettique, le système nerveux tissUES, le foie, la peau et les os. </li><li> Pour un contrôle positif, ajouter DNase (étiqueté «nucléase&quot; dans le kit) à l&#39;étiquetage mélange TdT. Alternativement, pré-traiter une section de contrôle positif à la DNase dans un tampon de nucléase pendant 1 heure à 37 ° C, selon les instructions du kit. Conserver la solution de DNase et les articles de DNase traité loin des autres sections expérimentales pour prévenir la contamination croisée. </li><li> Pour un contrôle négatif, omettre TdT enzyme de la composition de l&#39;étiquetage. </li><li> Utiliser un laboratoire pour effacer d&#39;un tampon d&#39;étiquetage autant TdT de la diapositive que possible. Pipette TdT étiquetage mélange sur la lame (50 pi par section), couvrir avec un nouveau rectangle de parafilm et incuber dans la chambre d&#39;humidité à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Suivez les instructions du kit pour faire tampon d&#39;arrêt 1x. Utilisez un laboratoire pour effacer d&#39;TdT étiquetage mélange de la diapositive, et ajouter 200-300 tampon d&#39;arrêt ul pour couvrir la section de tissu et incuber dans la chambre de l&#39;humidité pendant 5 min. Al<html> variante, immerger la lame dans du tampon d&#39;arrêt dans une jarre de Coplin. </li><li> Laver la glissière 2 x 2 min dans du PBS. Utiliser un laboratoire pour effacer d&#39;autant PBS de la diapositive que possible. </li></ol></li><li> Le marquage fluorescent <ol><li> Suivez les instructions du kit pour préparer une solution d&#39;étiquetage pour étiqueter fluorescéine dNTP au cassures de l&#39;ADN. solution de pipette sur la lame (50 ul par section), couvrir avec un nouveau rectangle de parafilm, et incuber dans la chambre humide pendant 20 minutes. </li><li> Laver la lame pendant 2 min dans du PBS dans une jarre de Coplin. Utiliser un laboratoire pour effacer d&#39;autant PBS que possible de la diapositive. </li><li> Diluer Hoechst 33258 colorant nucléaire à 1 pg / ml dans PBS et la pipette sur la lame (100-200 pi est suffisant pour couvrir la section). Incuber dans la chambre humide pendant 5 min. </li><li> Laver 3x pendant 5 min dans du PBS. </li><li> Lamelle avec Antifade milieux de montage de fluorescence et de sceller les bords avec du vernis à ongles. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 5 Acquisition d&#39;images numériques. <ol><li> Acquérir des images en utilisant un microscope à fluorescence conventionnelle avec DAPI, FITC, et des filtres rouge Texas (ou équivalent). Utilisation d&#39;un objectif de grossissement supérieur (20X ou 40X) pour vérifier que l&#39;étiquette a été un succès et noyaux (intacts ou fragmentées) ont été marquées. Un objectif 10X est suffisante pour la quantification des points lacrymaux TUNEL positif. </li><li> Recueillir des images de la coloration Hoechst, coloration TUNEL, et le signal de autofluorescente que trois canaux en fausses couleurs distinctes combinées en une seule image. Si l&#39;étiquette de fluorophore TUNEL est vert, le signal image autofluorescente dans le filtre rouge, et vice versa. <ol><li> Conservez tous les paramètres d&#39;imagerie équivalent entre les diapositives pour seuil et la quantification ultérieure. Pour chaque filtre, des heures prédéfinies et d&#39;exposition d&#39;enregistrement, le gain et binning (pas binning est le meilleur); ne pas utiliser les réglages d&#39;exposition ou de gain automatique. </li><li> Utilisez essais et erreurs pour trouver exposition et de gain paramètres qui répondra le mieux capturer la gamme de intensités dans toutes les lames colorées. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas pixels saturés dans les images acquises, que cette volonté biais quantification. </li></ol></li><li> Prenez des photos du groupe d&#39;intérêt musculaire entière. Cela peut nécessiter plusieurs images à &quot;cousu&quot; ensemble. </li></ol> Analyse 6. Image <ol><li> Utilisez disponibles dans le commerce des programmes d&#39;analyse d&#39;images pour analyser les images numériques de coloration TUNEL. Analyse utilisant un logiciel commercial est montré ici. Alternativement, le ImageJ du logiciel libre du NIH peut être utilisé pour analyser la coloration TUNEL. </li><li> Colorer une section adjacente à la section de TUNEL-colorées à l&#39;hématoxyline et de l&#39;éosine (H &amp; E) et prendre une image numérique à pleine section avec un microscope à fond clair conventionnel. Utilisez cette image H &amp; E en combinaison avec un atlas d&#39;anatomie 5,18,19 pour tracer les structures anatomiques être quantifiés. </li><li> Avec le canal TUNEL éteint, tracer manuellement le contour de la zone à quantifier, en utilisantHoechst et canaux de autofluorescence d&#39;orientation. Convertir la zone tracée dans un masque (un ensemble de pixel sélectionné coordonne à analyser). </li><li> Tournez sur le canal TUNEL. Utilisation de la fonction d&#39;un seuil d&#39;intensité dans le programme d&#39;analyse d&#39;image, réglez le seuil inférieur à exclure tous les signaux d&#39;autofluorescence. </li><li> Appliquer les mêmes paramètres de seuil pour toutes les images dans l&#39;ensemble de l&#39;étude. Convertir sélections seuillées en masques. </li><li> Pour chaque image, mélanger le masque de zone du muscle et le masque TUNEL. Le nouveau masque de combinaison représentera le signal TUNEL dans la zone musculaire tracée seulement. </li><li> Effectuer quantification masque sur le masque de combinaison pour déterminer le nombre d&#39;objets et de la zone du signal TUNEL dans la zone musculaire tracé opposer. Effectuez cette aide de la fonction analyseur de particules dans ImageJ. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Une méthode pour détecter et analyser quantitativement dommages à l&#39;ADN associée apoptose dans le muscle squelettique de souris est décrit. La procédure comprend la récolte des tissus, coloration TUNEL, l&#39;acquisition d&#39;image numérique, et l&#39;analyse d&#39;image. Fournitures et des outils histologiques communes sont nécessaires, et un kit spécial commerciale TUNEL est nécessaire. Les grands éléments essentiels de l&#39;équipement nécessaires sont un cryostat, un microscope à épifluorescenc...

Désoxynucléotidyl transférase (TdT) dUTP nick Terminal étiquetage final (TUNEL) est le processus d&#39;utilisation de l&#39;enzyme TdT pour fixer dUTP à 3 &#39;extrémités de double et l&#39;ADN simple brin casse 12,23. La méthode TUNEL pour la détection de l&#39;apoptose et dommages à l&#39;ADN a été signalée il ya plus de 20 ans par Gavrieli et al. 1,12,24. Depuis, il a été évalué et optimisé dans les différentes préparations de tissu 7,23,27,40. TUNEL a été utilisée pour étudier la mort cellulaire induite par l&#39;ischémie des neurones et des cardiomyocytes 43,44 6,14,29, excitotoxique mort des cellules neuronales 30,31, et en tant que biomarqueur pour le traitement de l&#39;arthrite 39. Il a également été utilisé en tant que facteur de pronostic et le marqueur de cellules tumorales dans divers cancers humains 2,3,15,32,37,38,42. Des méthodes alternatives existent pour dommages à l&#39;ADN et la détection de la mort cellulaire, mais ils ont des défis techniques et mises en garde. Southern blot peut être utilisée pour QUANTIFdommages à l&#39;ADN dans les lysats y tissus entiers 7,9-11, mais cette méthode ne fournit pas la résolution au niveau cellulaire et est difficile à quantifier. Le dosage comète est une méthode à base de cellules de remplacement qui nécessite l&#39;extraction des noyaux de cellules conservées 4,20,28,36. Bien que le test des comètes fonctionne bien sur des cellules isolées en culture, il est beaucoup plus difficile de préparer des noyaux intacts à partir de tissu musculaire squelettique 8,21. Comme Southern blot, le dosage comète ne fournit pas d&#39;informations de type cellule-spécifique de tout un homogénat du tissu musculaire. Une autre alternative à la méthode TUNEL est immunohistochimie utilisant des anticorps contre l&#39;ADN simple brin 25,33,41 ou contre des protéines qui participent dans les voies dommages à l&#39;ADN d&#39;intervention et de mort cellulaire (par exemple p53, H2AX et caspases) 13,17,22,40. De telles méthodes à base d&#39;anticorps nécessite la caractérisation d&#39;anticorps complète et une excellente spécificité de l&#39;anticorps pour donner un rapport signal à bruit de fond. Même lorsque specific anticorps existent, ils peuvent nécessiter une dénaturation de la protéine cible par des procédures de récupération de l&#39;antigène 34,35. Comme nous le verrons ici, la récupération d&#39;antigène dans les résultats de tissu musculaire dans inacceptablement élevé autofluorescence. Contrairement aux autres méthodes, TUNEL atteint dommages détection de l&#39;ADN avec un signal élevé et faible bruit de fond, une excellente spécificité qui peut être testée avec des contrôles simples positifs et négatifs, une bonne pénétration de tissu qui ne nécessitent pas de récupération d&#39;antigène, et la résolution de niveau cellulaire. En outre, la méthode TUNEL faut environ quatre heures pour terminer, alors que les méthodes alternatives nécessitent généralement incubations nuit. Nous étudions squelettique mort des cellules musculaires dans un modèle murin de l&#39;atrophie musculaire spinale (SMA) 10 qui a été généré par Hsieh-Li et ses collègues 16. Pour quantifier les cellules apoptotiques dans le muscle, nous avons développé une méthode de préparation des tissus, la coloration, et la quantification robuste qui fonctionne à travers skele différenteTal groupes musculaires à différents points de temps de développement chez la souris. Nous utilisons un kit TUNEL d&#39;étiquetage disponible dans le commerce et commercialisés logiciel d&#39;analyse d&#39;image. Nous avons également utilisé avec succès l&#39;essai TUNEL en combinaison avec coloration immunofluorescente dans la 10 moelle épinière. Les méthodes décrites ici sont utiles pour les enquêteurs qui veulent évaluer la pathologie des tissus, des mécanismes de la maladie, les mécanismes du vieillissement et de développement (pré et post-natal) la mort cellulaire dans le muscle squelettique. La technique TUNEL est particulièrement utile pour l&#39;étude des lésions de l&#39;ADN et la réparation et la mort cellulaire dans des systèmes modèles où seul un sous-ensemble de cellules est affecté résolution au niveau cellulaire et ne est nécessaire. Cette vidéo décrit la dissection, le traitement des tissus, le sectionnement, et basé sur la fluorescence étiquetage TUNEL du muscle squelettique de souris. Il décrit également un procédé de semi-automatisé TUNEL signal de quantification.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:121px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:460px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">19202</td>
			<td style="width:460px;">For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 &#176;C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td style="width:460px;">Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">O.C.T. compound&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td>Embedding medium for cryosectioning.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:121px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">CM 3050S</td>
			<td style="width:460px;">A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 &#956;m sections may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass slides, 25 x 75 x 1 mm</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-552-3</td>
			<td>Slides from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Gelatin</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G-9391</td>
			<td style="width:460px;">Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 mL distilled water, warm to 60 &#176;C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">243361</td>
			<td style="width:460px;">Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectabond tissue adhesion reagent</td>
			<td style="width:121px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">SP-1800</td>
			<td style="width:460px;">Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gellatin-coated slides may be used instead.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tween20</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td style="width:460px;">A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triton X100</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td style="width:460px;">A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase/nuclease</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>(included with kit)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase/nuclease buffer</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>(included with kit)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:121px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">780</td>
			<td style="width:460px;">Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DNase-free water</td>
			<td style="width:121px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">351-029-131</td>
			<td>Water from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hoechst 33258</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">94403</td>
			<td style="width:460px;">Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Parafilm M</td>
			<td style="width:121px;">multiple</td>
			<td style="width:119px;">807</td>
			<td style="width:460px;">Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fluorescent microscope with digital camera</td>
			<td style="width:121px;">&#160;--</td>
			<td style="width:119px;">&#160;--</td>
			<td style="width:460px;">Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vectashield antifade media</td>
			<td style="width:121px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td>Antifade media from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">glass coverslips, No.1 thickness</td>
			<td style="width:121px;">Brain Research Labs</td>
			<td style="width:119px;">2222-1</td>
			<td style="width:460px;">Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22x22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nail polish</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">114-8</td>
			<td style="width:460px;">Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and analysis of dna damage in mouse skeletal muscle in situ using the tunel method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Avec coloration réussie, signal de TUNEL positif doit être assez brillant pour isoler autofluorescence en fixant des seuils d&#39;intensité. Objets TUNEL-positives à faible grossissement peuvent apparaître fragments irréguliers brillants dans le muscle squelettique (Figure 1A). Toutefois, à plus fort grossissement, certains objets TUNEL positif avec la morphologie apoptotique classique doivent être respectées, si le type de mort cellulaire impliquée est l&#39;apoptose (figure 1B).</str...

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Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Détection et analyse de l&#39;ADN dommages souris muscle squelettique<em&gt; In Situ</em&gt; Utilisation de la méthode TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

16.2K vues.  Johns Hopkins School of Medicine. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling. 

Vidéo: Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

In vivo la micro-circulation de mesure dans le muscle squelettique par voie intra-vitale microscopie

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

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Biologie

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development. To follow the migration of individuals in a crowd of thymocytes , we generate neonatal chimeras where less than one percent of the thymocytes are derived from a donor that is transgenic for a ubiquitously express fluorescent protein. To generate these partial hematopoetic chimeras, neonatal recipients are injected with bone marrow between 3-7 days of age. After 4-6 weeks, the mouse is sacrificed and the thymus is carefully dissected and bissected preserving the architecture of the tissue that will be imaged. The thymus is glued onto a coverslip in preparation for ex vivo imaging by TPM. During imaging the thymus is kept in DMEM without phenol red that is perfused with 95% oxygen and 5% carbon dioxide and warmed to 37&deg;C. Using this approach, we can study the events required for the generation of a diverse T cell repertoire.

We present step-by-step instructions for the generation of neonatal chimeras as well as the dissection and preparation of the thymus for ex vivo imaging by 2-Photon Microscopy.

Dans l&#39;imagerie in situ de la souris en utilisant deux Thymus microscopie biphotonique

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

Purification des progéniteurs du muscle squelettique

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

Procédures pour Rat<em&gt; In situ</em&gt; Propriétés contractiles musculaires squelettiques

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Évaluation de calcium Sparks dans intactes les fibres musculaires squelettiques

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Le poisson zèbre rapide et efficace génotypage utilisant la PCR avec haute résolution Melt analyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolement des mitochondries à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour les mesures à haut débit microplaques respiratoires

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Filtration Isolement des acides nucléiques: Une méthode d&#39;extraction de l&#39;ADN simple et rapide

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.

Détection et analyse de l'ADN dommages souris muscle squelettique

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In vivo la micro-circulation de mesure dans le muscle squelettique par voie intra-vitale microscopie

Dans l'imagerie in situ de la souris en utilisant deux Thymus microscopie biphotonique

Purification des progéniteurs du muscle squelettique

Procédures pour Rat

Visualisation et d'analyse de molécules d'ARNm par fluorescence

Évaluation de calcium Sparks dans intactes les fibres musculaires squelettiques

Le poisson zèbre rapide et efficace génotypage utilisant la PCR avec haute résolution Melt analyse

Isolement des mitochondries à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour les mesures à haut débit microplaques respiratoires

Filtration Isolement des acides nucléiques: Une méthode d'extraction de l'ADN simple et rapide

Électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique de la souris