Le protocole suivant décrit un système qui fonctionne bien en 20-35 souris g. Le procédé peut facilement être adapté à des souris plus ou moins simplement en changeant la taille du cathéter. Tous les protocoles d&#39;animaux ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et l&#39;utilisation Université Johns Hopkins. 1. Lung instillation <ol><li> Sélectionnez une longue canule 20 g par voie intraveineuse d&#39;un pouce commerciale à utiliser pour l&#39;intubation. </li><li> Modifier la pointe du cathéter flexion manuellement pour générer une légère courbure à l&#39;extrémité comme illustré sur la figure 1. </li><li> Anesthésier la souris avec un mélange de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (15 mg / kg) injecté IP, et confirmer l&#39;anesthésie par l&#39;absence de mouvement réflexe. Appliquer une pommade vétérinaire sur les yeux immédiatement après l&#39;anesthésie. Immédiatement après l&#39;anesthésie Appliquer une pommade vétérinaire sur les yeux et donnent carprofène (5-10 mg / kg SQ) pour l&#39;analgésie post-opératoire et l&#39;instillation. </li><li> Placez le mouSE couchée sur une plate-forme inclinée. Comme le montre la figure 2, un gros classeur de bureau avec des boucles de suture enregistrée sur fonctionne parfaitement bien. </li><li> Rasez la partie ventrale du cou et nettoyer et désinfecter la zone du cou avec 70% d&#39;alcool. Avec de nouveaux gants sans latex et de à poudre, utiliser des instruments chirurgicaux désinfectés alcool à 70%. </li><li> Utilisation de ciseaux tranchants font une petite incision chirurgicale dans le cou d&#39;environ 12 mm au-dessous de l&#39;incisive inférieure. </li><li> Avec une pince tirez doucement la peau dans le cou caudale jusqu&#39;à la paroi ventrale de la trachée peut être vu. </li><li> Rétracter doucement la langue et insérer la canule avec le bout courbé incliné vers la surface ventrale de la souris. Comme dans 1.4, tirez doucement sur la peau dans le cou, et insérer la canule dans la trachée. NOTE: Avec un peu de pratique, le cathéter sera visible déplacer dans la trachée. Si elle va dans l&#39;œsophage, alors il n&#39;y aura pas observation visuelle du mouvement du cathéter. Aucun incisionssont réalisés dans la trachée. </li><li> Une fois que le cathéter est vu dans la trachée dans le cou, l&#39;a avancé d&#39;environ 5 mm pour être fiable passé les cordes vocales, mais toujours bien au-dessus de la carène. </li><li> Préparez-vous à inculquer jusqu&#39;à 50 pi de liquide par injection par le cathéter avec une pointe de pipette de chargement de gel. Placez la pointe dans le moyeu luer, mais avant l&#39;injection de regarder attentivement pour observer le mouvement du fluide dans la pointe synchrone avec la respiration de la souris. Puis injecter l&#39;instillation. </li><li> Avec une seringue de 1 ml, faire immédiatement une inflation relativement rapide de 0,6 ml d&#39;air dans les poumons à travers le cathéter pour aider à distribuer le liquide profondément dans les poumons. Retirer la canule. </li><li> Retirer la canule. </li><li> Utilisez une petite quantité de colle cyanoacrylate pour fermer la petite plaie chirurgicale par colis insérer les instructions pour Vetbond. Placez la souris dans des cages individuelles et surveiller visuellement eux jusqu&#39;à ce qu&#39;ils se réveillent et se comporter normalement sans aucune indication de discomfort. </li></ol> 2. Fixation du poumon Remarque: Une fois que toutes les procédures expérimentales sont réalisées en une souris, les poumons peuvent être préparés pour le traitement histologique par fixation avec du formaldéhyde (ou un autre fixateur désiré). <ol><li> Sacrifiez la souris avec une procédure acceptable IACUC. Pour la souris représentant le montre la vidéo, la dislocation cervicale d&#39;une souris anesthésiée est utilisé. </li><li> Effectuez une trachéotomie (si pas déjà fait) en exposant chirurgicalement la face ventrale de la trachée, faisant une petite coupure, et l&#39;insertion d&#39;un talon pointe de l&#39;aiguille 18 G dans la trachée et l&#39;attachant avec un fil. </li><li> Soigneusement ouvrir le thorax avec une incision médiane, couper la membrane, et retirer les parois thoraciques latérales pour exposer les poumons. </li><li> Connectez l&#39;extrémité luer de l&#39;aiguille à un réservoir sur un support d&#39;anneau contenant du formaldéhyde. Voir Figure 3. </li><li> Réglez la surface supérieure de la formaldéhyde 25 cm au-dessus du niveau de la mouse. Voir Figure 3. Suivant assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas d&#39;air dans le tube de fixation en exécutant fluide hors la fin d&#39;un robinet. Connectez l&#39;extrémité luer de la canule trachéale à la tubulure de réservoir. Ouvrir le robinet pour gonfler les poumons avec le formaldéhyde. Laissez les poumons sous pression pendant au moins 20 min. </li><li> Ouvrir le robinet pour gonfler les poumons avec le formaldéhyde. Laissez les poumons sous pression pendant au moins 20 min. </li><li> Ensuite, attacher la trachée au-delà de l&#39;extrémité de l&#39;aiguille de stub. Il peut être utile de se replier lentement sur l&#39;aiguille pour exposer plus de la trachée uncannulated. Lorsque solidement attaché, retirez le robinet. </li><li> Disséquer soigneusement les poumons. </li><li> Placez les poumons dans la nuit du formaldéhyde. Des durées plus longues sont fines, et quelques taches ou des procédures peuvent spécifier des heures spécifiques. Aussi d&#39;autres fixateurs liquides, telles que z-fix peuvent être utilisées pour l&#39;instillation et l&#39;immersion. </li><li> Avant de poursuivre le traitement histologique, mesurerle volume pulmonaire fixe tel que décrit suivant. </li></ol> 3. Mesure du volume pulmonaire fixe <ol><li> Mesurer le volume du poumon en utilisant le principe d&#39;Archimède, comme illustré sur la figure 4. Retirer le poumon fixe à partir du formaldéhyde et disséquer le cœur et tout autre tissu non-pulmonaire. </li><li> Utilisez un dispositif simple maison construite précédemment de support de fil qui est utilisé pour garder les poumons complètement sous l&#39;eau. NOTE: Cet appareil doit être rendu compatible avec l&#39;équilibre selon est utilisé. Un dispositif typique de la figure 5 est fabriqué à partir de pipettes en plastique et mince (20 G) fil. Ce système fonctionne bien avec la balance utilisée dans la vidéo, mais peut facilement être adapté à la plupart des balances de laboratoire. </li><li> Placez un bécher avec ≈200 ml d&#39;eau sur l&#39;équilibre et la tare de la cage de support en place dans l&#39;eau. Voir la figure 6 Supprimer la cage métallique. placer le poumon sur la surface de l&#39;eau et appuyez sur sous l&#39;eauavec la cage. </li><li> Noter le poids sur la balance. Ce chiffre reflète le volume d&#39;eau déplacé et est donc une mesure directe du volume pulmonaire. Soyez prudent pour vous assurer que le poumon ou une suture ou une partie de la cage de fil ne pas toucher les côtés ou le fond du bécher. </li><li> Pour plus de précision, répéter cette mesure. Retirer le poumon de l&#39;eau, et sécher sur un tissu. Tarer le bécher avec cage en place et répéter la mesure du volume pulmonaire. Les deux mesures de volume devraient ensuite calculer la moyenne. REMARQUE: si les poumons sont laissés dans le formol pendant plus d&#39;une semaine environ, l&#39;air dans les poumons est dissous dans le liquide. Lorsque cela se produit, le poumon coulera, il est donc plus nécessaire d&#39;utiliser un appareil comme dans la Figure 5 pour maintenir le poumon submergée. Dans un tel cas, le volume peut être mesurée par simplement en tenant le poumon par l&#39;une des chaînes de suture jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit complètement immergé, comme illustré sur la figure 4. </li></ol>

<ol>
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M., Wills-Karp, M., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+cellular+profile+and+lung+function+with+repeated+bronchoalveolar+lavage+in+individual+mice.">Assessment of cellular profile and lung function with repeated bronchoalveolar lavage in individual mice.</a> Physiol Genomics. 2, 29-36 (2000).</li><li>Hamacher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+wire+guide-based+orotracheal+mouse+intubation:+description,+evaluation+and+comparison+with+transillumination.">Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination.</a> Laboratory animals. 42, 222-230 (2008).</li><li>Spoelstra, E. 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H., Summers-Torres, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Laryngoscopy+in+Mice.">Direct Laryngoscopy in Mice.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 38, 33-35 (1999).</li><li>Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+official+research+policy+statement+of+the+American+Thoracic+Society/European+Respiratory+Society:+standards+for+quantitative+assessment+of+lung+structure.">An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure.</a> Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).</li><li>Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+the+measurement+of+mucociliary+function+in+the+mouse+by+scintigraphy.">Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy.</a> J Appl Physiol. 90, 1111-1117 (2001).</li><li>Cai, Y., Kimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intratracheal+intubation+to+study+the+pathology+and+physiology+of+mouse+lung.">Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50601 (2013).</li><li>Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+mouse+lung+intubation.">A simple method of mouse lung intubation.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).</li><li>MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+simple+method+of+mouse+lung+intubation.">An improved simple method of mouse lung intubation.</a> J Appl Physiol. 106, 984-987 (2009).</li><li>Lum, H., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+10%+formalin+fixation+on+fixed+lung+volume+and+lung+tissue+shrinkage.">Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage.</a> American Reveiw of Respiratory Diseases. 132, 1078-1083 (1985).</li><li>Bishai, J., Fields, M. J., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Mouse+Lung+Volumes+Inflated+with+Air+and+Instilled+Fixatives.">Comparison of Mouse Lung Volumes Inflated with Air and Instilled Fixatives.</a> Proc Am Thorac Soc. 3, A549 (2006).</li><li>Mitzner, W., Brown, R., Lee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+lung+volumes+in+mice.">In vivo measurement of lung volumes in mice.</a> Physiol Genomics. 4, 215-221 (2001).</li></ol>

Les procédures décrites ici présentent plusieurs avantages. Première le matériel nécessaire est simple et peu coûteuse. Deuxièmement, l&#39;intubation peut être fait rapidement avec peu d&#39;erreurs. Troisièmement, la capacité de fixer les poumons à une pression constante, puis mesurer le volume du poumon fixe permet une bonne quantification des structures ou des cellules dans le poumon 10. Un inconvénient possible de l&#39;intubation est la chirurgie mineure. Cela p...

Pour un certain nombre de raisons, le cancer du poumon n&#39;a pas été largement étudiée chez la souris. Une raison à cela est que l&#39;accès au poumon est très difficile in vivo, et l&#39;analyse quantitative des poumons fixes n&#39;a pas fait couramment. Les méthodes décrites dans le présent document sont conçus pour remédier à cette situation. Les buts ici sont à décrire des méthodes simples qui va grandement aider à la mise en place et l&#39;analyse des poumons de souris avec un cancer du poumon ou d&#39;autres pathologies. Bien qu&#39;aucune de ces approches sont entièrement nouvelle, ils ont pas été présentés ainsi que les méthodes autonomes dans la manière simplifiée telle que décrite ici. Il ya eu un certain nombre de manuscrits qui ont décrit des méthodes pour l&#39;intubation du poumon de la souris principalement dans le but de faire de la fonction pulmonaire répétée ou lavage broncho-alvéolaire chez des souris individuelles dans des études longitudinales. Depuis que le papier d&#39;origine, il ya eu plusieurs autres documents qui ont décrit les différentes approches de protocoles d&#39;ententee intubation 1 -9. Bien que toutes ces méthodes peuvent être utilisées avec succès, ils nécessitent généralement une formation considérable, et ne sont souvent pas sans un taux d&#39;échec non négligeable. En outre, afin d&#39;effectuer des mesures de la fonction pulmonaire, la canule doit adapter la trachée assez serré pour qu&#39;il n&#39;y ait pas de fuites d&#39;air. Cependant, une autre utilisation pratique pour l&#39;intubation est de fournir des agents spécifiques (cellules cancéreuses ou d&#39;autres agressions) ou des médicaments thérapeutiques directement au poumon. Une telle procédure ne nécessite pas une canule hermétique ni aucun équipement de la fonction pulmonaire sophistiqué. La nouvelle caractéristique de cette méthode montré ici implique une procédure chirurgicale mineure qui permet à l&#39;intubation sans aucune possibilité de la canule pénétrer dans l&#39;œsophage. Cette approche simple permet une intubation réussie avec relativement peu de formation ou d&#39;expérience. Autant que 30 souris / h peuvent être traités en utilisant cette approche avec un taux d&#39;échec proche de zéro. Une fois que tIl souris sont prêts à être sacrifiés, les poumons blessés ou cancéreuses peuvent alors être retirés pour analyse histologique et pathologique. Toutefois, afin de quantifier correctement les variables histologiques pour la comparaison avec d&#39;autres poumons, il est essentiel de normaliser les procédures de fixation et bien quantifier le volume du poumon fixe 10. Ce document décrit en détail les procédures simples qui permettent les procédures de fixation standardisés ainsi comme un moyen de mesurer le volume du poumon fixe. Le volume est un indicateur essentiel de la quantification de l&#39;histologie, car sans une telle détermination du volume, seuls les densités relatives peuvent être mesurés 10. Une fois le volume du poumon est connu, cependant, des mesures absolues de cellules et d&#39;autres mesures structurelles dans les poumons peuvent être quantifiés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Laboratory Balance</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>Adventurer Pro Model AV 313&#160;</td>
			<td>Other balances can be used if they have a range of 1 - 300g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 g Luer intravenous catheter</td>
			<td>Insylte</td>
			<td></td>
			<td>Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL laboratory bottle</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>Several other possible vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

instillation and fixation methods useful in mouse lung cancer research

La capacité d&#39;inculquer agents vivants, cellules ou de produits chimiques directement dans les poumons sans blesser ou de tuer les souris est un outil important dans la recherche sur le cancer du poumon. Bien qu&#39;il existe un certain nombre de méthodes qui ont été publiées montrant comment intuber souris pour les mesures de la fonction pulmonaire, aucun ne sans problèmes potentiels pour l&#39;instillation trachéale rapide dans les grandes cohortes de souris. Dans le présent document, une méthode simple et rapide est décrit qui permet un enquêteur pour mener à bien ces instillations d&#39;une manière efficace. La méthode ne nécessite pas d&#39;outils spéciaux ou de l&#39;éclairage et peut être appris avec très peu de pratique. Elle implique une anesthésie de la souris, une petite incision dans le cou pour visualiser la trachée, puis l&#39;insertion d&#39;un cathéter intraveineux directement. La petite incision est rapidement fermé avec un adhésif tissulaire, et les souris sont autorisés à récupérer. Un étudiant qualifié ou technicien peuvent faire instillations à un taux moyen de 2 min / souris. Une fois que til le cancer est établi, il est souvent une nécessité pour l&#39;analyse quantitative des histologique des poumons. Pathologistes Traditionnellement généralement pas la peine de normaliser l&#39;inflation du poumon lors de la fixation, et les analyses sont souvent basées sur un système de notation qui peut être très subjective. Bien que cela puisse parfois être suffisamment adéquate pour les estimations brutes de la taille d&#39;une tumeur du poumon, tout stéréologique quantification correcte de la structure du poumon ou des cellules nécessite une procédure de fixation reproductible et la mesure du volume pulmonaire ultérieure. Ici, nous décrivons des procédures simples et fiables pour les deux fixant les poumons sous pression, puis en mesurant avec précision le volume du poumon fixe. La seule exigence est une balance de laboratoire qui est précis sur une plage de 1 mg-300 g. Les procédures présentées ici pourraient donc grandement améliorer la capacité de créer, traiter et analyser les cancers du poumon chez les souris.

La procédure décrire dans le premier protocole n&#39;a pas par lui-même conduire à aucun résultat généralisées. Il décrit seulement un moyen très fiable pour inculquer substances directement dans la trachée. La figure 7 montre un exemple d&#39;un poumon, dans lequel le bleu trypan a été instillé avec le procédé décrit ici. Il ya une large diffusion du colorant, similaire à ce qui a été vu avec d&#39;autres colorants ou traceurs données directement dans la trachée o...

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Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

Le but de cet article est de décrire les méthodes simples qui va grandement aider dans la configuration et l&#39;analyse des poumons de souris avec le cancer du poumon ou d&#39;autres pathologies. Nous présentons 3 protocoles d&#39;effectuer simplement et de manière fiable sur instillations pulmonaires, la fixation, et les mesures de volume pulmonaire.

Instillation et la fixation méthodes utiles en recherche sur le cancer du poumon de souris

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

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Research

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28.1K vues.  Johns Hopkins University.  Le but de cet article est de décrire les méthodes simples qui va grandement aider dans la configuration et l'analyse des poumons de souris avec le cancer du poumon ou d'autres pathologies. Nous présentons 3 protocoles d'effectuer simplement et de manière fiable sur instillations pulmonaires, la fixation, et les mesures de volume pulmonaire. 

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Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-photon imagerie de l&#39;invasion des cellules tumorales dans un modèle de souris orthotopique du carcinome épidermoïde oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Recherche

Médecine

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Une méthode simple d&#39;intubation poumon de souris

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

Non invasive Intratrachéal intubation pour étudier la pathologie et la physiologie des souris poumon

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Diagnostic Ultrasound Imaging of Mouse Diaphragm Function

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive surgical procedures. Although this is an effective method of assessing in vitro diaphragm activity, it involves non-survival surgery. The application of non-invasive ultrasound imaging as an in vivo procedure is beneficial since it not only reduces the number of animals sacrificed, but is also suitable for monitoring disease progression in live mice. Thus, our ultrasound imaging method may likely assist in the development of novel therapies that alleviate muscle injury induced by various respiratory diseases. Particularly, in clinical diagnoses of obstructive lung diseases, ultrasound imaging has the potential to be used in conjunction with other standard tests to detect the early onset of diaphragm muscle fatigue. In the current protocol, we describe how to accurately evaluate diaphragm contractility in a mouse model using a diagnostic ultrasound imaging technique.

Diagnostic ultrasound imaging has proven to be effective in diagnosing various respiratory diseases in human and animal subjects. We demonstrate a comprehensive ultrasound protocol utilized by Dr. Zuo's lab to analyze diaphragm kinetics specifically in mouse models. This is also a non-invasive research technique which can provide quantitative information on mouse respiratory muscle function.

L&#39;échographie diagnostique de souris membrane Fonction

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive ...

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as models of pulmonary disease often resemble the situation of the human lung much better than mice do. Working with large animals also offers the opportunity to sample the same animal repeatedly over a certain course of time, which allows long-term studies without sacrificing the animals.
The aim was to establish in vivo sampling methods for the use in a bovine model of a respiratory Chlamydia psittaci infection. Sampling should be performed at various time points in each animal during the study, and the samples should be suitable to study the host response, as well as the pathogen under experimental conditions.
Bronchoscopy is a valuable diagnostic tool in human and veterinary medicine. It is a safe and minimally invasive procedure. This article describes the intrabronchial inoculation of calves as well as sampling methods for the lower respiratory tract. Videoendoscopic, intrabronchial inoculation leads to very consistent clinical and pathological findings in all inoculated animals and is, therefore, well-suited for use in models of infectious lung disease. The sampling methods described are bronchoalveolar lavage, bronchial brushing and transbronchial lung biopsy. All of these are valuable diagnostic tools in human medicine and could be adapted for experimental purposes to calves aged 6-8 weeks. The samples obtained were suitable for both pathogen detection and characterization of the severity of lung inflammation in the host.

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

This article describes bronchoscopic techniques in the bovine lung under experimental conditions, i.e. bronchoscopically guided inoculation, bronchoalveolar lavage, bronchial brushing, and transbronchial lung biopsy.

Le bovine poumon dans la recherche biomédicale: visuellement guidée bronchoscopie, intrabronchique vaccination et<em&gt; In Vivo</em&gt; Techniques d&#39;échantillonnage

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

Intubation médiation intratrachéale (GI-TI) instillation: un système de distribution non invasive, Lung-spécifique

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Echocardiographic Measurement of Right Ventricular Diastolic Parameters in Mouse

Diastolic dysfunction is a prominent feature of right ventricular (RV) remodeling associated with conditions of pressure overload. However, the RV diastolic function is rarely quantified in experimental studies. This might be due to technical difficulties in the visualization of the RV in the apical four-chamber view in rodents. Here we describe two positions facilitating the visualization of the apical four-chamber view in mice to assess the RV diastolic function.
The apical four-chamber view is enabled by tilting the mouse fixation platform to the left and caudally (LeCa) or to the right and cranially (RiCr). Both positions provide images of comparable quality. The results of the RV diastolic function obtained from two positions are not significantly different. Both positions are comparably easy to perform. This protocol can be incorporated into published protocols and enables detailed investigations of the RV function.

Here we describe and compare two positions for obtaining the apical four-chamber view in mice. These positions enable the quantification of the right ventricular function, provide comparable results, and can be used interchangeably.

Mesure échocardiographique des paramètres diastoliques ventriculaires droits dans la souris

Diastolic dysfunction is a prominent feature of right ventricular (RV) remodeling associated with conditions of pressure overload. However, the RV ...

Lung Fixation under Constant Pressure for Evaluation of Emphysema in Mice

Emphysema is a significant feature of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Studies involving an emphysematous mouse model require optimal lung fixation to produce reliable histological specimens of the lung. Due to the nature of the lung&rsquo;s structural composition, which consists largely of air and tissue, there is a risk that it collapses or deflates during the fixation process. Various lung fixation methods exist, each of which has its own advantages and disadvantages. The lung fixation method presented here utilizes constant pressure to enable optimal tissue evaluation for studies using an emphysematous mouse lung model. The main advantage is that it can fix many lungs with the same condition at one time. Lung specimens are obtained from chronic cigarette smoke-exposed mice. Lung fixation is performed using specialized equipment that enables the production of constant pressure. This constant pressure maintains the lung in a reasonably inflated state. Thus, this method generates a histological specimen of the lung that is suitable to evaluate cigarette smoke-induced mild emphysema.

Presented here is a useful protocol for lung fixation that creates a stable condition for histological evaluate of lung specimens from a mouse model of emphysema. The main advantage of this model is that it can fix many lungs with the same constant pressure without lung collapse or deflation.

Fixation pulmonaire sous pression constante pour l'évaluation de l'emphysème chez les souris

Emphysema is a significant feature of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Studies involving an emphysematous mouse model require optimal lung ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

Induire une lésion pulmonaire aigue chez la souris par instillation directe du lipopolysaccharide intratrachéal

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...