Ce travail a été soutenu par FWO-Vlaanderen, le projet IOF IOF10 / Startt / 027 et l&#39;Université de Gand spécial de recherche Grant BOF12 / GOA / 014.

Remarque: Le protocole de transfection et de co-immunoprécipitation suivante est établie pour un format de boîte de Pétri de 9 cm. D&#39;autres formats sont également possible, après avoir escaladé le protocole. 1. ensemencement des rein embryonnaire humain (HEK) 293T <ol><li> Ensemencer les cellules HEK293T un jour avant la transfection à 1,2 x 10 6 cellules par 9 cm boîte de Pétri dans 12 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal, 2 mM de L-glutamine, 0,4 mM de Na-pyruvate, 0,1 mM d&#39;acides aminés non essentiels, 100 U / ml de pénicilline et 0,1 mg / ml de streptomycine. </li><li> Cultiver les cellules 16 h à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Inspecter visuellement la morphologie et la viabilité des cellules avec un microscope inversé la lumière avant la transfection. Les cellules ont besoin d&#39;être sous-confluentes de l&#39;efficacité de transfection optimale. </li></ol> 2. Le calcium-phosphate Transfection de cellules HEK293T Note: Utilisation 0,5-1 pg de pCAXL-NP ou vide pCAXL plasmide en combinaison avec 1-3 ug de pCAXL-MX1 par 9 cm plat. Utiliser une quantité égale d&#39;ADN total de plasmide dans tous les échantillons; ajuster avec le plasmide vide si nécessaire. <ol><li> Préparer les tampons de transfection suivantes: <ol><li> Préparation de Tris-EDTA (TE) avec des concentrations de 1,0 mM Tris-HCl pH 8,0 et EDTA 0,1 mM pH 8,0. </li><li> Préparer BS / HEPES avec des concentrations de 25 mM de HEPES (5,96 g / l, 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic), 274 mM de NaCl (16 g / L), KCl 10 mM (0,74 g / L), 1,5 mM NaHPO 4 · 12H 2 O (0,5 g / L) et de 11,1 mM de glucose (2 g / L). Ajuster le pH à 7,05. </li><li> Préparer CaCl 2 / HEPES avec des concentrations de 1,25 M CaCl 2 · 2H 2 O (183,8 g / L) et 125 mM de HEPES (29,79 g / L). Ajuster le pH à 7,05 avec du NaOH. </li></ol></li><li> Réchauffez les tampons de transfection à 37 ° C avant utilisation. </li><li> Préparer les échantillons de plasmide par dilution de l&#39;ADN de plasmide dans 600 ul de TE.Préparer ces mélanges dans les puits d&#39;une plaque à 6 puits. </li><li> Ajouter 150 pi de CaCl2 / HEPES d&#39;une manière sage de déposer pour les échantillons de plasmides et mélanger par pipetage 3 fois de haut en bas. </li><li> Préparer la solution de transfection à goutte ajoutant sage la solution de plasmide (TE + DNA + CaCl2 / HEPES; 750 pi) à 750 pi de tampon BS / HEPES prévues dans une plaque à 6 puits frais. Distribuer la solution de plasmide uniformément sur le tampon complète puits contenant de BS / HEPES. </li><li> Agiter la solution de transfection sur un agitateur de plaque pendant 90 secondes à 1000 RPM. </li><li> Incuber le mélange pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Ajouter la solution de transfection (1,5 ml) goutte à goutte aux cellules. Utiliser une micropipette P1000 à goutte la solution de transfection sur les cellules. Disperser le mélange sur le 9 cm plat complet Petri et secouer la plaque très doucement. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 6 heures. Puis retirez le support par aspiration et remplacer immédiatement wie 12 ml du milieu frais, préchauffé. Ajouter doucement le milieu frais aux cellules pour empêcher le détachement des cellules. Pour cela, maintenez la pointe de la pipette contre le côté du puits et poussez doucement sur le milieu. </li><li> Incuber les cellules pendant une 16 heure supplémentaire à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> 3. Co-immunoprécipitation Remarque: Effectuez la co-immunoprécipitation 24 heures après transfection. <ol><li> Préparation du tampon de lyse et de faible teneur en sel du tampon de lavage élevée en sel. <ol><li> Préparer une solution mère de 2 M N-éthylmaléimide (NEM) en pesant la quantité de NEM et le dissolvant dans de l&#39;éthanol absolu. Préparer la solution mère NEM frais avant utilisation. ATTENTION: NEM est très toxique, préparer et utiliser cette solution mère dans une hotte. </li><li> Préparer du tampon de lyse faible de sel à des concentrations de 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, acide éthylènediaminetétraacétique 5 mM (EDTA), 1% de NP40 et un cocktail d&#39;inhibiteurs de protease (tableau 1 dissoudret dans un tampon de lyse de 50 ml). Ajouter NEM jusqu&#39;à une concentration finale de 25 mM (ce est-à diluer 1:80). Garder sur la glace après avoir ajouté les inhibiteurs de protéase et NEM. Note: Toujours ajouter les inhibiteurs de protéase et NEM fraîchement avant l&#39;utilisation. </li><li> Préparer une solution de lavage riche en sel à des concentrations de 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 500 mM, EDTA 5 mM et 1% de NP40. Notez que le tampon de lavage en sel élevée ne contient pas de NEM. </li></ol></li><li> Préparation de lysats cellulaires. <ol><li> Retirez le moyen et laver les cellules avec 2 ml de glace froide saline tamponnée phosphate (PBS). Ajouter très doucement le tampon de lavage, les cellules HEK293T se détachent facilement. </li><li> Retirez le PBS et ajouter 600 ul de tampon de lyse de sel de la glace froide bas par 9 cm boîte de Pétri. </li><li> Incuber les plaques pendant 20 minutes sur la glace. Assurez-vous que les plaques sont maintenues horizontal, pour assurer une couverture complète de la surface de la plaque avec du tampon de lyse. Secouer doucement les plaques toutes les 5 min. </li><li> Recueillir le lysat cellulaire dans une microcentrifugeuse de 1,5 mlet centrifuger le tube pendant 3 min à 4 ° C et 16 000 x g pour sédimenter la fraction insoluble. </li><li> Transférer la fraction soluble, ce est à dire le lysat cellulaire à un nouveau tube de 1,5 ml à centrifuger et garder sur la glace. Poursuivra immédiatement le protocole de co-immunoprécipitation, pour empêcher la dissociation des protéines qui interagissent. Effectuez toutes les étapes suivantes autant que possible sur la glace ou à 4 ° C à limiter l&#39;activité protéolytique dans les lysats. </li></ol></li><li> Génération de complexes immuns. Remarque: Dans cette étape, la protéine d&#39;intérêt est liée par l&#39;anticorps approprié. Pour étudier l&#39;interaction NP-MX1, utiliser un anticorps monoclonal anti-NP souris. <ol><li> Pour chaque échantillon, mélanger 135 pi de lysat avec 2 pi d&#39;anticorps monoclonal anti-NP et 113 ul de tampon de lyse faible de sel (volume total de 250 ul). Rangez le lysat restant à -20 ° C pour une analyse ultérieure tels que Western blot, de documenter les niveaux de l&#39;intera supposé d&#39;expressionpartenaires ction dans les cellules transfectées. Remarque: vous pouvez mesurer la concentration de protéines du lysat (par exemple avec le réactif Bradford) et utiliser une quantité fixe de protéines totales, par exemple, 400 mg, pour chaque lysat. </li><li> Incuber le mélange anticorps lysat pendant 3 heures sur une roue tournant à 4 ° C. Cette étape peut être étendue à une incubation pendant une nuit. </li></ol></li><li> Préparation de la protéine G perles. Remarque: Les billes de protéine G sont expédiées et stockées dans 20% d&#39;éthanol pour la conservation. La suspension de perles est normalement constitué de 50% de perles et les perles ont besoin d&#39;être lavé avant d&#39;être utilisés pour immunoprécipiter les complexes immuns. <ol><li> Utilisez 50 ul de billes, soit 100 pi de cordon-boue, pour chaque échantillon. Laver la quantité de billes pour tous les échantillons nécessaires à l&#39;analyse de co-immunoprécipitation dans un tube. Couper l&#39;extrémité d&#39;une pointe de pipette de 1 ml pour faciliter l&#39;ajout de la suspension de perles. </li><li> Centrifuger la protéine G perles suspension à 8000 xg et 4 ° C pendant 30 sec. Retirer la solution d&#39;éthanol et d&#39;ajouter un volume égal de tampon de lyse faible de sel. Centrifugeuse la protéine G perles suspension à 8000 xg et 4 ° C pendant 30 secondes et retirez délicatement le surnageant. Répétez cette étape de lavage 3 fois. Remarque: Le tampon de lyse faible de sel utilisée pour laver les billes ne ont pas besoin de contenir des inhibiteurs de la protéase ou de NEM. </li><li> Estimer le volume des billes de protéine G et ajouter un volume égal de tampon de lyse faible de sel pour faire une nouvelle suspension de billes à 50% dans du tampon de lyse faible de sel. </li><li> Pour chaque échantillon, transférer 100 pi de perles suspension dans un nouveau tube de 1,5 ml à centrifuger et stocker sur la glace jusqu&#39;à utilisation. Faire attention à remettre en suspension la suspension de billes avant de se diviser, comme ces billes sédimentent rapidement au fond du tube. </li></ol></li><li> Immunoprécipitation des complexes immuns par la protéine G perles et leur élution. <ol><li> Avant d&#39;utiliser les billes de protéine G pour l&#39;immunoprécipitation, centrifuger les tubes 30 secondes à 8000 x g et 4 ° C etvérifier par examen visuel qu&#39;il existe un nombre égal de billes présentes dans tous les échantillons. Si nécessaire, ajuster la quantité de perles dans certains des échantillons et centrifuger à nouveau. Jeter les surnageants. Veillez à ne pas déranger les protéines G perle granulés. </li><li> Centrifuger brièvement les complexes immuns (ie., Lysats avec un anticorps, 250 pi) pendant 30 secondes à 8000 xg et 4 ° C pour recueillir l&#39;échantillon complet au fond du tube. Transférez les complexes immuns aux perles de protéines G (50 pi). </li><li> Incuber 60 min sur une roue tournant à 4 ° C. Ne pas incuber ces complexes immuns plus de 75 min avec les billes pour réduire la liaison non spécifique des protéines à la protéine G perles. </li><li> Centrifuger les perles de protéines G (avec complexes immuns liés) pendant 30 secondes à 8000 xg et 4 ° C et enlever les surnageants. Veillez à ne pas déranger les protéines G perle granulés. Facultatif: stocker ces surnageants à 4 ° C ou -20 ° C pour analyse ultérieure,par exemple, pour estimer la quantité de protéine non liée. </li><li> Laver les billes de protéine G pendant environ 5 min avec 900 ul de tampon de lyse élevée en sel. Assurez-vous que les perles sont complètement remises en suspension dans le tampon de lavage pour le lavage optimal. Centrifuger les protéines G perle pour 30 secondes à 8000 xg et 4 ° C et jeter le surnageant. Répétez cette étape de lavage 4 fois. Veillez à ne pas déranger les perles culot de protéine G pour éviter la perte de matériel immunoprécipité. </li><li> Après la dernière étape de lavage, ajouter 50 ul de tampon d&#39;échantillon Laemmli 2x aux billes et chauffer la suspension pendant 10 min à 95 ° C pour éluer les (co) protéines immunoprécipitées. <ol><li> Préparer 10 ml de tampon Laemmli 6x avec 1 g de sulfate de dodécyle de sodium, 3,5 ml de glycerol, 3,5 ml de 1 M Tris-HCl pH 6,8 et 420 ul de β-mercaptoéthanol. Ajuster à un volume total de 10 ml par addition d&#39;eau distillée. Diluer trois fois à l&#39;eau distillée pour obtenir un tampon de Laemmli 2x. ATTENTION: &amp;# 946; mercaptoéthanol est toxique, préparer et utiliser un tampon Laemmli dans une hotte. </li></ol></li><li> Après chauffage, centrifuger les protéines G perle pour 30 secondes à 8000 xg et stocker les échantillons à 4 ° C (à court terme) ou -20 ° C (à long terme). </li></ol></li></ol> 4. Analyser le (co-) immunoprécipités Protéines <ol><li> Visualiser les protéines présentes dans le lysat cellulaire et l&#39;éluat de la co-immunoprécipitation par SDS-PAGE et transfert de Western 20 21,22. Charger généralement la moitié de l&#39;éluat Laemmli sur gel. Veillez à ne pas déranger les billes de protéine G granulés lors de la prise d&#39;échantillons pour le chargement du gel. MX1 et expression NP ont été révélés avec un anticorps anti-anticorps MX1 et NP-anti, 14 respectivement. Les bandes ont été détectées avec une chimioluminescence à base de HRP et un révélateur de film radiographique. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.

L&#39;étude de l&#39;interaction entre les protéines antivirales et leurs cibles virales est très important de comprendre les détails du mécanisme antiviral de ces protéines. Cela peut donner de nouvelles perspectives sur la façon dont les virus et leurs hôtes co-évolué et être la base pour le développement de nouvelles stratégies antivirales. Le protocole de co-immunoprécipitation optimisé décrit ici permet d&#39;étudier l&#39;interaction entre la protéine de la souris MX1 et sa cible virale, la prot?...

Protéines résistance Myxovirus (Mx) sont un élément important de la défense immunitaire innée contre les pathogènes viraux. Ces protéines sont de grandes GTPases dynamine-like qui sont induits par les interférons de type III I et de type. Les gènes Mx correspondantes sont présentes dans pratiquement tous les vertébrés en une ou plusieurs copies et leurs produits géniques inhibent une large gamme de virus, y compris les Orthomyxoviridae (par ex., Virus de la grippe), des Rhabdoviridae (par ex., Virus de la stomatite vésiculaire), Bunyaviridae (par ex. , le virus de la crosse) et Retroviridae (par exemple, virus d&#39;immunodéficience humaine-1) 1-4. On ne sait pas comment ces protéines reconnaissent une telle large éventail de virus, sans aucune séquence primaire partagé apparente motifs de ces virus. Analyser l&#39;interaction des protéines Mx avec leurs cibles virales, impliquant potentiellement complexes d&#39;ordre supérieur avec d&#39;autres facteurs de la cellule hôte, aidera à comprendre les mécanismes moléculaires tHat ont évolué dans la course aux armements entre les virus et leurs hôtes. L&#39;interaction entre les protéines de mammifères Mx et cibles virales a été le plus étudié pour MxA humaine. MxA humaine peut inhiber la replication de nombreux virus, y compris l&#39;orthomyxovirus virus influenza A et Thogoto. MxA lie les complexes de ribonucléoprotéine (virus Thogoto vRNPs), empêchant ainsi leur entrée nucléaire, ce qui entraîne l&#39;infection de 5 bloc. Cette interaction entre MxA et Thogoto vRNPs de virus a été démontrée avec le co-sédimentation et des expériences de co-immunoprécipitation 6-9. Comment protéines Mx entravent virus de la grippe A est moins clair. Un problème majeur est qu&#39;il ne est pas aisé de démontrer une interaction entre une protéine Mx et un produit du gène de la grippe. Un rapport a montré une interaction entre MxA humaine et la protéine NP de la grippe A cellules infectées par le virus 10. Cette interaction ne peut être représenté par la co-immunoprecipitation si les cellules avaient été traités avec les réticulants réactifs dithiobis (propionate de succinimidyle) avant la lyse, ce qui suggère que l&#39;interaction est transitoire et / ou faible. Des études plus récentes ont montré que l&#39;écart-Mx sensibilité de différentes souches de la grippe A est déterminée par l&#39;origine de la protéine NP 11,12. Dans cette ligne, les virus grippaux A peuvent en partie échapper au contrôle Mx par mutation des résidus spécifiques dans la protéine NP 13. Cela suggère que la principale cible de virus influenza A pour l&#39;hôte Mx est la protéine NP, probablement NP assemblé dans les complexes vRNP. Cependant, aucune de ces études plus récentes ont démontré une interaction entre l&#39;influenza NP ou vRNPs et MxA soit humain ou de souris Mx1. Récemment, nous avons montré, pour la première fois, une interaction entre la grippe et la protéine NP de souris MX1 avec une co-immunoprécipitation protocole optimisé 14, qui est décrit ici en détail. En général, les co-immunoprecipitation est l&#39;une des approches biochimiques les plus fréquemment utilisés pour étudier les interactions protéine-protéine. Cette technique est souvent préférée à d&#39;autres techniques, par exemple, deux hybrides de levure, car il permet d&#39;étudier les interactions protéine-protéine dans leur environnement naturel. Co-immunoprécipitation peut être effectuée sur des protéines exprimées de manière endogène si des anticorps contre les protéines d&#39;intérêt sont disponibles. En variante, les protéines d&#39;intérêt peuvent être exprimés dans la cellule par transfection ou infection et une étiquette d&#39;affinité peuvent être utilisés. En plus des avantages mentionnés ci-dessus, la co-immunoprécipitation protocole décrit permet la détection des interactions faibles de protéines et / ou transitoires. Le composant principal de ce protocole optimisé est l&#39;addition de N-éthylmaléimide (NEM) dans le tampon de lyse des cellules. NEM est un réactif d&#39;alkylation qui réagit avec les groupes thiol libres, tels que présents dans cysteines, à un pH de 6.5 à 7.5 pour former un thio-ester stable(Figure 1). A pH plus élevé, NEM peut également réagir avec des groupes amino ou 15 subir une hydrolyse. NEM est généralement utilisé pour bloquer les groupes thiol libres, afin d&#39;empêcher la formation de liaisons disulfure ou inhiber l&#39;activité enzymatique. Par exemple, NEM est souvent utilisé pour bloquer les enzymes, qui sont desumoylating proteases cysteine. Dans le protocole décrit co-immunoprécipitation, NEM a été inscrite dans le tampon de lyse car il a été rapporté que la sumoylation de protéines de la grippe peut influencer l&#39;interaction entre des protéines virales 16. De façon inattendue, l&#39;addition de NEM se est avéré être la clé pour documenter l&#39;interaction entre l&#39;influenza NP et Mx1 souris par co-immunoprécipitation. Il est difficile de comprendre pourquoi l&#39;addition de NEM est crucial pour détecter l&#39;interaction NP-MX1. Peut-être l&#39;interaction est trop transitoire et / ou faible. NEM pourrait stabiliser l&#39;interaction, par exemple, en conservant une conformation spécifique de Mx1, une protéine virale ou même une troisième compo inconnuenent. Un tel effet stabilisant de NEM a été observé précédemment, par exemple, par l&#39;interaction entre la ribonucléotide réductase M1 et son inhibiteur de gemcitabine (F2dC) 17. NP MX1 et deux contiennent de multiples résidus de cysteine ​​qui pourraient être modifiés par NEM. Par exemple, une étude récente de Rennie et al. A démontré qu&#39;un sessiles MxA variante contient trois résidus de solvants cystéine exposés qui peuvent être modifiés par l&#39;iodoacétamide. La mutation de ces résidus serines ne influence pas l&#39;activité enzymatique de MxA, mais empêche l&#39;agrégation à médiation par 18 disulfure. Étant donné que ces cysteines sont conservées dans Mx1, cela suggère que les cysteines dans Mx1 analogues peuvent être modifiées par NEM et en tant que tel ou sa conformation influence la solubilité. En outre, NEM peut également affecter l&#39;activité GTPase de Mx1, ce qui est essentiel pour l&#39;activité anti-influenza de Mx1, et ainsi stabiliser l&#39;interaction entre MX1 et NP. Cependant, un effet direct de NEM sur la GTPase activité de Mx1 est peu probable, car NEM est également nécessaire pour détecter l&#39;interaction entre la grippe NP et GTPase mutants inactifs de la protéine Mx1 14. De toute évidence, plus de recherche est nécessaire pour démêler l&#39;effet de NEM sur l&#39;interaction NP-MX1. En résumé, la co-immunoprécipitation protocole décrit permet d&#39;étudier l&#39;interaction entre la protéine antivirale MX1 et sa cible virale, la protéine NP grippe. Ce protocole peut également être utilisé pour étudier d&#39;autres interactions faibles ou transitoires qui dépendent de la stabilisation des conformations de protéines spécifiques. Interaction protéine-protéine qui dépendent de conformations spécifiques ont été décrits auparavant, par exemple, pour les protéines liant le calcium, tels que 19 la calmoduline. Enfin, le rôle bénéfique de NEM pourrait également être utilisé dans d&#39;autres procédés qui permettent de détecter les interactions protéine-protéine, telles que les essais de co-sédimentation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52100-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-3876</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-30212</td>
			<td>also known as NP40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 873 580 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NP monoclonal antibody</td>
			<td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td>
			<td>NR-4282</td>
			<td>ascites blend of clones A1 and A3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RNP polyclonal serum</td>
			<td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td>
			<td>NR-3133</td>
			<td>directed against A/Scotland/840/74 (H3N2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose 4FF</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0618-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperfilm ECL 18 x 24 cm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9068-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>32106</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation of the mouse mx1 protein with the influenza a virus nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

N-éthylmaléimide est un composé organique qui peut être utilisé pour modifier de manière irréversible des groupes thiol libres, par exemple pour inhiber les proteases cysteine ​​(figure 1). La protéine antiviral inhibe la grippe A Mx1 la replication du virus en interagissant avec la nucléoprotéine virale. Le protocole de co-immunoprécipitation optimisé décrit ici permet d&#39;étudier cette interaction NP-MX1. des cellules HEK293T ont été transfec...

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Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-immunoprécipitation de la protéine souris Mx1 avec le virus Influenza A nucléoprotéine

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.6K vues.  VIB. This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Génération de virus recombinants de la grippe des ADN plasmidique

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Recherche

Immunologie et infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utiliser l&#39;imagerie Bioluminescent chargé d&#39;enquêter sur une synergie entre Streptococcus pneumoniae Et virus Influenza A de souriceaux

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Purification par affinité des complexes virus de la grippe ribonucléoprotéiques de la chromatine des cellules infectées

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Virus de la grippe Propagation dans embryonnés de poulet Oeufs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Lingettes nasal pour la grippe détection d&#39;un virus et l&#39;isolement des porcs

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

A miniaturisé Glycan Microarray Assay pour l&#39;évaluation Avidité et Spécificité du virus grippal A Hémagglutinines

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro désassemblage du virus grippal A capsides par Centrifugation Gradient

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Basées sur la fluorescence neuraminidase Essai d&#39;inhibition pour évaluer la sensibilité des virus de la grippe à la neuraminidase Inhibiteur Classe de Antiviraux

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.