Ce protocole décrit une stratégie thérapeutique potentiellement nouvelle qui peut être facilement modifiée pour des applications humaines. Cette technique améliore directement l’induction des lymphocytes T régulation gut-homing dans les tissus lymphoïdes périphériques et peut être habilement mis en œuvre, même dans des environnements hautement pro-inflammatoires. Ces techniques peuvent également être utilisées pour étudier le rôle de la vitamine D active et de la vitamine A dans le système immunitaire périphérique.
Cette démonstration visuelle fournira des instructions étape par étape pour la génération de cellules dendritiques d’ingénierie de haute qualité qui sont essentielles au succès de cette technique. Commencez par ensemencer une fois 10 aux sept cellules 293T dans 20 millilitres de milieu de culture cellulaire CM-10-D en 150 par 25 plaques de culture millimétriques pour une incubation de 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, ajoutez 1,62 millilitres de solution HBS fraîchement préparée à deux concentrés, 9,5 microgrammes de plasmide d’enveloppe, 17,5 microgrammes de plasmide d’emballage et 27 microgrammes du plasmide LENTI-CYP-ALDH à un tube conique de 50 millilitres.
Porter le volume final du contenu du tube jusqu’à 3,0375 millilitres avec de l’eau, suivi de l’ajout de 202,5 microlitres de deux molaires de chlorure de calcium dans le sens de la goutte. Laissez le mélange de précipitations d’ADN à température ambiante pendant 20 minutes avec un mélange occasionnel avant d’ajouter 3,24 millilitres de la solution dropwise par culture 293T tout en tourbillonnant doucement le plat. Placez les assiettes dans l’incubateur pendant 24 heures avant de laver doucement chaque assiette avec du PBS et de nourrir les cellules avec un milieu de culture CM-4-D.
Après encore 24 heures de culture, récolter les supernatants dans des bouteilles stériles pour le stockage à quatre à huit degrés Celsius et nourrir les cellules avec cm-4-D moyen frais pendant encore 24 heures. Le quatrième jour, récolter à nouveau les supernatants et filtrer les supernatants des trois jours et quatre à un filtre de 0,45 micromètre. Ensuite, concentrez le virus pseudotypé VSV-G par centrifugation pendant 24 heures.
Le lendemain décanter les supernatants. Laissez les tubes s’écouler sur une serviette en papier dans une armoire stérile de bio-sécurité pendant plusieurs minutes, puis résuspendez les granulés dans 33,3 microlitres de PBS stérile contenant 5% de glycérol par plat de culture. Pour la génération de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse, placez les tibias et les fémurs, récoltés à partir de souris BALB/c, dans un plat de culture de 100 x 20 millimètres contenant un milieu de culture frais.
Utilisez des ciseaux et des forceps disséquants pour enlever les tissus des os. Lorsque tous les os ont été nettoyés, utilisez les ciseaux pour couper les deux extrémités de chaque os pour exposer les cavités de la moelle osseuse. Utilisez une seringue de 10 millilitres munie d’une aiguille de calibre 30 pour rincer chaque os avec 10 millilitres de milieu de culture frais, en recueillant la moelle osseuse dans un tube de 15 millilitres.
Lorsque toute la moelle osseuse a été recueillie, sédimenter la moelle osseuse par centrifugation et resuspendre la pastille en deux millilitres de tampon de lyse des globules rouges. Après quatre à cinq minutes à température ambiante avec des secousses occasionnelles, arrêter la réaction avec 10 millilitres de milieu de culture cellulaire et de recueillir les cellules par centrifugation. Resuspendez la pastille en 10 millilitres de milieu de culture CM-10-R pour compter et ajuster les cellules pendant une fois 10 aux six cellules par millilitre de concentration moyenne de culture CM-10-R.
Ensuite, ajoutez 100 unités par millilitre de murine recombinante GM-CSF et 10 unités par millilitre d’IL-4 aux cellules. Plaque quatre millilitres de cellules dans les puits individuels d’une plaque de culture de six puits pour leur incubation à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 48 heures. À la fin de l’incubation, aspirer doucement les cellules non adhérentes.
Ajouter un milieu frais complété par GM-CSF et IL-4 aux cultures avant de retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pour un supplément de 48 heures. À la fin de la deuxième incubation, récolter les cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse non adhérentes en tube conique de 50 millilitres pour leur centrifugation. Pour générer des cellules BMDC-CYP-ALDH, résuspendez les cultures à une fois dix à la sixième cellule dendritique par 500 microlitres de CM-10-R moyen par concentration de puits, et plaquez 500 microlitres de cellules dans chaque puits d’une nouvelle plaque de culture de six puits.
Ajouter 50 microlitres de virus LENTI-CYP-ALDH et 8 microgrammes par millilitre de protamine à chaque puits, puis placer la plaque dans l’incubateur pendant 24 heures. Le lendemain, remplacez les supernatants par un milieu de culture frais et retournez les assiettes à l’incubateur de culture cellulaire pendant encore 24 heures. À la fin de la deuxième incubation, les cellules peuvent être activées avec 100 nanogrammes par millilitre de lipopolysaccharide par puits pendant 24 heures avant la récolte pour des analyses fonctionnelles.
Comparées aux cellules dendritiques dérivées de moelle parentale, les cellules de BMDC-CYP-ALDH affichent une expression améliorée de 1-alpha-hydroxylase. Les concentrations de la forme active de vitamine D dans les supernatants de culture des cellules BMDC-CYP et BMDC-CYP-ALDH sont environ 20 fois plus élevées que celles observées dans les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse parentale et les cultures cellulaires BMDC-ALDH. Les intensités fluorescentes moyennes des cellules BMDC-CYP-ALDH traitées avec le substrat sont environ six fois plus élevées que celles des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse parentale traitées avec le substrat.
Ceci suggère que les cellules BMDC-CYP-ALDH expriment l’activité enzymatique rétinienne sensiblement améliorée dehydehydrogenase-2. Les cellules DC2.4 traitées avec de la vitamine D 25 hydroxy et rétiniennes n’induisent pas un changement significatif dans l’abondance des lymphocytes T positifs CCR9 positifs CCR9 foxp3. En revanche, dc2.4 cellules CYP-ALDH traitées avec la vitamine D 25 hydroxy et rétinienne induisent des nombres sensiblement plus élevés de cellules T régulation gut-homing d’une manière dépendante de concentration.
En outre, comparées aux cellules de contrôle intraperitoneally injectées, les cellules CYP-ALDH de DC induisent également une augmentation significative du nombre de cellules T positives positives de CD4 de CCR9 de foxp3 après injection intraperitoneal dans les animaux destinataires de BALB/c. Le succès de la procédure dépend de la préparation de cellules T saines et d’un mélange d’ADN correctement préparé.
