Ce travail a été soutenu par le National Center for Research Resources et le Centre national pour l&#39;avancement des sciences translationnelle, National Institutes of Health, par Grant UL1TR000124 (FW); Félix &amp; Mildred Yip Doué chaire et le Fonds famille Barnes (à DTWW), l&#39;Institut national de recherche dentaire et craniofaciale des Instituts nationaux de la santé en vertu Prix Nombre T90DE022734 (MT). Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.

1. Extraction Exosome magnétique à base de perle <ol><li> Pipeter une solution bien mélangée de 5 ul de microparticules magnétiques revêtues de streptavidine dans 495 pl de tampon phosphate salin (PBS) tampon dans un tube de microcentrifugeuse pour remettre en suspension les billes. Lavez et remettre en suspension les perles avec 500 pi de PBS trois fois en utilisant une grille magnétique. Le rack est un ensemble d&#39;aimants sur le côté d&#39;une unité d&#39;habitation qui peuvent maintenir les tubes échantillons à centrifuger. <ol><li> Pour chaque lavage, d&#39;abord laisser les tubes se asseoir sur la grille pendant 1 min, puis utilisez une pointe de pipette pour enlever soigneusement le tampon de surnageant sans déranger les perles. </li><li> Placer les tubes sur une grille régulière sans aimants sur le côté. Ajouter 500 pi de PBS dans les tubes, et utiliser la pipette pour mélanger la solution et de perles ensemble. Ensuite, mettre les tubes de retour sur la grille magnétique pour séparer à nouveau les perles de la solution. </li><li> Effectuez cette élimination de tampon par aimantation et remise en suspension dans un PBStrois fois au total. Ceci effectue un lavage initiale des particules magnétiques. </li></ol></li><li> Remettre en suspension les billes dans 490 pl de tampon PBS, avec le tube placé sur la partie non magnétisée de la crémaillère magnétique. Pipeter 5 ul de l&#39;anticorps CD63 anti-humain de souris biotinylé à 1,0 mg / ml concentration de matière dans le mélange de billes. Utilisez la pipette pour mélanger les perles et l&#39;anticorps en solution. </li><li> Placer les microtubes avec perles et mélange d&#39;anticorps biotinylé sur un échantillon rotateurs. Régler les paramètres des rotateurs pour le dispositif de rotation de l&#39;échantillon pour la rotation réciproque de basculement à 90 ° pendant 5 s et vibrant à 5 ° C pendant 1 sec. Faire tourner les tubes de mélange échantillon-bille à ces paramètres pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Retirer anticorps non lié après conjugaison. <ol><li> Après 30 min de rotation à la température ambiante, placer les tubes de retour dans le rack magnétique pendant 5 min. </li><li> Effectuer trois lavages de perles en supprimant la phase liquide à l&#39;aide d&#39;une micropipette et laver avec 500 μ; L de PBS. Après la triple lavage, remettre en suspension les perles dans 490 ul de caséine-PBS et le lieu sur la partie non magnétisé de la crémaillère. </li></ol></li><li> extraction de Exosome en utilisant des billes revêtues d&#39;anticorps. <ol><li> Étiqueter chaque tube avec ciblée ID de l&#39;échantillon. Pipeter un échantillon de 10 ul de sérum ou de salive dans le tube de microcentrifugeuse. Utilisez la pipette pour mélanger l&#39;échantillon et des billes magnétiques par pipetage à plusieurs reprises. </li><li> Placer les tubes à échantillon et des billes anti-humains d&#39;anticorps anti-CD63 sur la coiffe et faire tourner pendant 2 heures à température ambiante. Utiliser les mêmes paramètres des rotateurs comme décrit à l&#39;étape 1.2. </li><li> Suite à 2 h de l&#39;échantillon tournant, effectuer un lavage triple en magnétisant à billes séparées de la solution, en éliminant la phase liquide avec la micropipette, et la remise en suspension des billes dans 500 pl de tampon Tris-HCl. Les perles résultantes sont désormais liés aux exosomes et sont prêts pour la libération du champ électrique et de mesure. </li></ol></li></ol> 2. Champ électrique induite publié une Mesure de la teneur exosomales <ol><li> Revêtement préalable initiale de l&#39;électrode avec Primer GADPH <ol><li> Appliquer une matière plastique et à un réseau d&#39;électrodes afin d&#39;éviter la contamination croisée des électrodes individuelles. Pour cette expérience, en utilisant un réseau d&#39;électrodes 16 du capteur à chaque électrode de l&#39;unité dans la matrice constituée d&#39;un travail, le compteur, et l&#39;électrode de référence en or nu. </li><li> Préparer un mélange d&#39;actions de 100 nM sonde d&#39;ADN, 0,3 M de KCl, et 10 mM pyrrole par pipetage des réactifs d&#39;achat d&#39;actions dans un tube avec de l&#39;eau distillée ultra pure. Bien mélanger au vortex. NOTE: Pour cette étude, la sonde d&#39;ADN choisie correspond au gène de référence de GAPDH, qui est connu pour exister dans exosomes. La séquence de la sonde utilisée est: 5&#39;-biotine-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3 &#39;. Utilisez ce mélange sur toutes les électrodes. </li><li> Pipeter 60 ul du mélange de monomère d&#39;ADN-sonde sur la surface de chaque électrode en or. Examinez les électrodes pour se assurer qu&#39;il ya une couverture adéquate du travail, contre, et des électrodes de référence par le mélange liquide. </li><li> Electropolymerize mélange monomère-sonde pour créer une couche de polymère conducteur sur la surface de l&#39;électrode par application d&#39;une onde carrée (CSW) le profil cyclique de champ électrique à la surface de l&#39;électrode. Ce champ électrique consiste à appliquer 350 mV pour 9 sec et de commutation immédiatement 950 mV pour 1 sec. Appliquer ce profil cyclique onde carrée à l&#39;électrode pendant 10 cycles, pour un total de 100 secondes de champ électrique appliqué. </li><li> Rincer la surface du capteur 3 fois à l&#39;eau distillée et on sèche avec de l&#39;azote gazeux pour éliminer le liquide de la surface de l&#39;électrode. Se assurer que le liquide est correctement supprimé de l&#39;électrode. </li></ol></li><li> Exosome déchargement de la cargaison <ol><li> Charge 5 ul de 1 uM d&#39;une sonde de détection dans 495 ul du mélange complexe de bourrelet exosomes et en utilisant une pipette pour mélanger. REMARQUE: La sonde de détection est une séquence d&#39;amorce d&#39;ADN conjugué à une molécule de fluorescéine à l&#39;extrémité 3 &#39;. Le détecteur de probe séquence utilisée pour cette étude correspond à l&#39;ARNm GAPDH trouvés dans exosomes. La séquence de la sonde de détection conjugué à la fluorescéine est la suivante: 5&#39;-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-fluorescéine-3 &#39;. </li><li> Introduire à la pipette 60 ul de la sonde et de perles exosomes mélange complexe sur la surface d&#39;électrode en or avec un réseau d&#39;aimants dessous. Ce réseau d&#39;aimants est constitué de seize 2,54 mm diamètre des aimants en néodyme alignés pour correspondre aux électrodes de travail du capteur. La figure 2A illustre le placement des aimants et solution de bourrelet exosomes. </li><li> Une fois que l&#39;échantillon est chargé sur la surface de l&#39;électrode, appliquer 20 cycles du champ électrique CSW avec neuf secondes à -300 mV et 1 s à 200 mV (200 du total sec). La cargaison de exosomal qui est libérée va se hybrider aux amorces sur la surface de l&#39;électrode. Si des marqueurs de surface de la exosomes sont l&#39;objet d&#39;enquête, sauter cette partie de l&#39;expérience. Figure 2B illustre ce processus. </li> &lt;li&gt; Lavez-off les analytes non liés à la surface de l&#39;électrode par triple rinçage de la surface de l&#39;électrode avec de l&#39;eau distillée. Sécher l&#39;électrode avec de l&#39;azote gazeux. </li></ol></li><li> Reporter anticorps et Lecture <ol><li> Ajouter 60 ul de 150 unité / anticorps anti-fluorescéine ml conjugué à la peroxydase de raifort (HRP en 1: 1000 dilution) dilués dans caséine / PBS. </li><li> Utilisez un champ électrique conjugaison conduit à HRP anti-fluorescéine complexe pour le sandwich de la sonde. Appliquer -200 mV pendant 1 s et 500 mV pendant 1 s à 5 cycles à la surface de l&#39;électrode. La figure 2A montre les complexes de sonde de capture et de détection à la fois une protéine et d&#39;acide nucléique système. </li><li> Surface du capteur de lavage Triple utilisant de l&#39;eau distillée et sécher avec de l&#39;azote gazeux. </li><li> Après le lavage-off de l&#39;excès de l&#39;anticorps anti-fluorescéine non lié, ajouter 60 ul de 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tétraméthylbenzidine (TMB). Chargez ce substrat sur chaque surface de capteur à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux. </li><li> Effectuer une lecture ampérométrique du courant par mesure du courant d&#39;électrode à -200 mV pendant 60 secondes en utilisant un potentiostat capable électrochimique de mesure simultanée de 16 canaux. La figure 2C est un exemple de profil de courant lors de la lecture. </li></ol></li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig2highres.jpg" /> Figure 2. Composants de EFIRM méthode. (A) la méthode d&#39;extraction exosomes de biofluide utilisant CD63 anti-humain revêtu microparticules magnétiques et déchargement de la cargaison de exosomes par ondes carrés cycliques appliquées au complexe de particules exosomes. (B) Schéma de l&#39;électrode biocapteur utilisé pour détecter des cibles ARN / ADN / protéine de la exosomes libérés. (C) un exemple représentatif de lecture ampérométrique de la méthodologie de EFIRM, où plus grande ampleur actuelle correspond to niveaux plus élevés d&#39;une biomolécule. Ce chiffre est de Wei et al. 14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52439/52439fig2large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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M., Bailey, M. 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T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+exosomal+biomarker+by+electric+field-induced+release+and+measurement+(EFIRM).">Detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (EFIRM).</a> Biosensors and Bioelectronics. 44, 115-121 (2013).</li></ol>

David Wong est co-fondateur de RNAmeTRIX Inc., une société de diagnostic moléculaire. PeriRx LLC sous-licence de propriété intellectuelle se rapportant aux diagnostics moléculaires de RNAmeTRIX. David Wong est un consultant pour PeriRx.

Comme les résultats l&#39;indiquent, CD63 anti-humain revêtu nanoparticules magnétiques sont capables de capturer spécifiquement les petites particules qui ont une taille allant de 70 à 100 nm. Cette particule capturée est cohérent avec le profil déjà observé des exosomes. En outre, l&#39;utilisation de la CCF basse tension suivant la capture des particules est indiquée pour les retirer de la surface des billes et causer des profils de dégradation d&#39;ADN similaires à celle d&#39;une méthode traditionnel...

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>. The disclosures were updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>.

Errata: Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

recherche Exosome est un domaine émergent de l&#39;enquête qui examine microvésicules lipidiques qui portent une ARN, l&#39;ADN 2, 3 et en protéines cargaison. Enquêtes précédentes de la biologie exosomes ont conduit à l&#39;identification des exosomes dans biofluides tels que le sang 4, 5 urine, le lait maternel 6, 7 et la salive. Des études ont démontré que les exosomes jouent un rôle dans différentes voies cellulaires, méditant à distance communication entre les différents systèmes du corps 8. En raison du rôle exosomes jouent dans la communication intercellulaire, on suppose qu&#39;elles peuvent conditionner biomolécules cibles (protéines, ARN et ADN) corrélés à des états pathologiques. 3 in vitro et de l&#39;animal modèle 9 études semblent confirmer cette hypothèse. En recherchant la teneur exosomal pour la découverte de biomarqueurs, il est nécessaire de développer une méthodologie pour l&#39;isolement de exosome sélective de fluides biologiques, expulsi induiteen charge des cargaisons d&#39;exosomes, et la quantification de biomolécules d&#39;exosomes. Dans la mesure de ce travail, les exosomes seront définis comme une structure ayant un diamètre d&#39;environ 70 à 100 nm et possédant surface marqueur CD63. Les chercheurs généralement abord purifier exosomes par ultracentrifugation 10 puis traiter le contenu exosomal grâce à l&#39;utilisation de kits de tampon de lyse. Utilisation de méthodes de tampon de lyse nécessite des temps d&#39;incubation allant de quelques minutes à quelques heures. Ce processus peut potentiellement nuire fret exosomes et conduire à la dégradation de l&#39;échantillon. Par exemple, un ARN exosomes salivaire libéré par le tampon de lyse dans le milieu extracellulaire entourant possède une demi-vie de moins de 1 min, ce qui rend la mesure de l&#39;ARN exosomal post-Lysis Buffer une tâche particulièrement difficile sans l&#39;addition de réactifs de stabilisation 11. L&#39;effet composé de l&#39;ajout de divers réactifs pour la lyse et la stabilisation peut introduire des agents qui compliquent et interférer avec l&#39;analysis du contenu de exosomal. Une autre approche peut être utile pour décharger rapidement le contenu de exosomal et la préservation de la cargaison en toute sécurité pour la caractérisation. Dans ce travail, nous proposons l&#39;utilisation d&#39;un champ électrique non-uniforme pour la libération de contenu exosomal. Champs électriques ont été connus pour porter la capacité à polariser et perturber la bicouche lipidique qui forme les membranes cellulaires. Notre travail expérimental explore l&#39;utilisation de non-uniformes ondes carrées cycliques (CSW) pour perturber la structure de microvésicule des exosomes et de libérer la cargaison transportée. Cette méthode utilise des tensions dans la gamme de plusieurs centaines de millivolts, ce qui signifie que la plupart des biomolécules ne seront pas perturbés. Nous démontrons que l&#39;utilisation d&#39;une onde cyclique carré est apte à actionner libération des exosomes salivaires contenu de l&#39;ARNm dans l&#39;environnement fluide environnant. Cette version de la teneur en exosomal est parfaitement intégré avec un système d&#39;électrodes qui peut être utilisé pour quantifier les niveaux d&#39;expression de biomarqueur 12,13. Cette méthode proposée permet sensibles, et le tampon de lyse analyse rapide, sans contenu de exosomes. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig1highres.jpg" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble de EFIRM Workflow.. La méthode de EFIRM est globalement divisé en trois grandes phases qui sont nécessaires pour la purification et l&#39;analyse des exosomes. Cette teneur en exosomal libération et l&#39;analyse sur la base de la méthode CSW est utilisé en conjonction avec des microbilles magnétiques spécifiques à CD63 pour l&#39;isolement d&#39;exosomes. Ces billes permettent CD63 affinité pour l&#39;isolement sélectif des exosomes à partir d&#39;échantillons salivaires (et d&#39;autres fluides biologiques). Après incubation et d&#39;extraction des exosomes en utilisant les perles magnétisées, les perles sont migrés vers le système de capteur électrochimique pour la CSW de presse basée contenu et la partie de l&#39;analyse de l&#39;expérience. La figure 1 donne un aperçu du travailse écouler de la méthode de EFIRM.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:132px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Genefluidics, USA</td>
			<td style="width:132px;">&#160;RS-1000-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips</td>
			<td style="width:157px;">Genefluidics, USA</td>
			<td>SC1000-16X-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Biotinylated anti-human CD63 Antibody</td>
			<td style="width:157px;">Ancell, USA</td>
			<td style="width:132px;">215-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Neodynium Magnetics ( 1/10&#34; dia. x 1/32&#34; thick)</td>
			<td style="width:157px;">K&#38;J Magnetics, USA</td>
			<td>DH101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">Ultrapure Distilled Water</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies, USA</td>
			<td>10977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Mettler Toldeo 3M KcL Solution</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific, USA</td>
			<td>1911512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Pyrrole</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:132px;">W338605-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments</td>
			<td style="width:157px;">Roche, Germany</td>
			<td>11426346910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:347px;">3, 3&#8242;, 5, 5&#8242; tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity)&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Neogen, Usa</td>
			<td style="width:132px;">330175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">Phosphate Buffered Saline Solution</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies, USA</td>
			<td align="right" style="width:132px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Casein/PBS</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific, USA</td>
			<td>37532</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (efirm)

Les exosomes sont des structures microvésiculaire qui jouent un rôle de médiateur dans la communication intercellulaire. Il est intéressant d&#39;étudier la cargaison interne des exosomes pour déterminer si elles sont porteuses de maladies biomarqueurs discriminatoires. Pour effectuer une analyse de exosomal, il est nécessaire de mettre au point un procédé d&#39;extraction et d&#39;analyse des exosomes à partir de fluides biologiques cibles sans endommager le contenu interne. Libération induite de champ électrique et de mesure (EFIRM) est une méthode pour extraire spécifiquement exosomes de biofluides, le déchargement de leur cargaison, et de tester leur contenu ARN / protéines interne. Utilisation d&#39;un anticorps CD63 spécifique microparticule magnétique anti-humain, les exosomes sont tout d&#39;abord précipités à partir de fluides biologiques. Après extraction, basse tension électriques des ondes carrées cycliques (CCF) sont appliqués à rompre la membrane vésiculaire et provoquer déchargement de marchandises. Le contenu de la exosomes est hybridée à des amorces d&#39;ADN ou des anticorps immobilisés sur une surface d&#39;électrode pour quantification du contenu moléculaire. Procédé de EFIRM est avantageux pour l&#39;extraction des exosomes et déchargement des marchandises pour l&#39;analyse sans tampon de lyse. Ce procédé est capable de réaliser une détection spécifique de deux cibles d&#39;ARN et de protéines biomarqueurs dans le exosomes. EFIRM extrait exosomes spécifiquement en fonction de leurs marqueurs de surface par opposition à des techniques basées sur la taille. Microscopie électronique en transmission (TEM) et le dosage montrent la fonctionnalité du procédé de capture et d&#39;analyse des exosomes. Procédé de EFIRM a été appliqué à exosomales analyse de 9 souris injectées avec des cellules H640 de cancer du poumon humain (une lignée cellulaire transfectée pour exprimer le marqueur d&#39;exosomes CD63-GFP humain) afin de tester leur profil d&#39;exosomes contre 11 souris recevant témoins de sérum physiologique. Des niveaux élevés de biomarqueurs exosomales (GAPDH du gène de référence et de la protéine de surface marqueurs humaine CD63-GFP) ont été trouvé pour le H640 souris injectées dans les deux échantillons de sérum et de salive. En outre, saliVA et des échantillons de sérum ont été démontré que la linéarité (R = 0,79). Ces résultats suggèrent pour la viabilité des biomarqueurs salivaires exosomes pour la détection de maladies distales.

Validation de la capture des exosomes des Perles Utilisation TEM L&#39;isolement d&#39;exosomes à partir de la salive à l&#39;aide de billes magnétiques anti-CD63 humains a été validée en suivant le protocole d&#39;extraction à l&#39;aide de la microscopie électronique à transmission (TEM) d&#39;images. TEM montre billes magnétiques avec 70 à 100 nm granules immédiatement adjacentes (voir la figure 3A, et 3B), compatibles avec le...

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Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Détection de biomarqueurs exosomales par déclenchement électrique induite par champ et évaluation (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

18.3K vues.  University of California, Los Angeles. Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves. 

Vidéo: Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

Développement de ovaire de hamster chinois-hôte dosages de protéines cellulaires utilisant la technologie acoustique microparticules membranaires

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Recherche

Bio-ingénierie

Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium. We have developed tissue surface tensiometry (TST) specifically to measure the surface free energy of interaction between cells. The biophysical concepts underlying TST have been previously described in detail1,2. The method is based on the observation that mutually cohesive cells, if maintained in shaking culture, will spontaneously assemble into clusters. Over time, these clusters will round up to form spheres. This rounding-up behavior mimics the behavior characteristic of liquid systems. Intercellular binding energy is measured by compressing spherical aggregates between parallel plates in a custom-designed tissue surface tensiometer. The same mathematical equation used to measure the surface tension of a liquid droplet is used to measure surface tension of 3D tissue-like spherical aggregates. The cellular equivalent of liquid surface tension is intercellular binding energy, or more generally, tissue cohesivity. Previous studies from our laboratory have shown that tissue surface tension (1) predicts how two groups of embryonic cells will interact with one another1-5, (2) can strongly influence the ability of tissues to interact with biomaterials6, (3) can be altered not only through direct manipulation of cadherin-based intercellular cohesion7, but also by manipulation of key ECM molecules such as FN8-11 and 4) correlates with invasive potential of lung cancer12, fibrosarcoma13, brain tumor14 and prostate tumor cell lines15. In this article we will describe the apparatus, detail the steps required to generate spheroids, to load the spheroids into the tensiometer chamber, to initiate aggregate compression, and to analyze and validate the tissue surface tension measurements generated.

We describe a method of measuring binding energy, expressible as tissue surface tension, between cells within 3D tissue-like aggregates. Differences in tissue surface tension have been demonstrated to correlate with invasiveness of lung, muscle, and brain tumors, and are fundamental determinants of establishing spatial relationships between different cell types.

Mesure de la cohésion globale par tensiométrie surface du tissu

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is subject to chemical and mechanical signals, and the mechanisms by which it senses and responds to mechanical signals are poorly understood. Elucidating the role of forces in cell maturation will enable the design of scaffolds that can promote cell adhesion and cytoskeletal coupling to the substrate, and therefore improve the capacity of different neuronal types to regenerate after injury.
Here, we describe a method to apply simultaneous force spectroscopy measurements during laser induced cell lesion. We measure tension release in the partially lesioned axon by simultaneous interferometric tracking of an optically trapped probe adhered to the membrane of the axon. Our experimental protocol detects the tension release with piconewton sensitivity, and the dynamic of the tension release at millisecond time resolution. Therefore, it offers a high-resolution method to study how the mechanical coupling between cells and substrates can be modulated by pharmacological treatment and/or by distinct mechanical properties of the substrate.

We measured the tension release in an axon that was partially lesioned with a laser dissector by simultaneous force spectroscopy measurement performed on an optically-trapped probe adhered to the membrane of the axon. The developed experimental protocol evaluates the axon adhesion to the culture substrate.

Mesure de la tension de sortie Pendant Laser Induced Axon lésion axonale évaluer l&#39;adhésion au substrat à piconewton et Millisecond Résolution

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Détection optique de<em&gt; E. coli</em&gt; Bactérie par mésoporeux Silicon biocapteurs

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. In this article we outline a valid and reliable technique to prepare and test permeabilized skeletal muscle fibers in vitro.

Mesure de la force maximale isométrique généré par perméabilisées fibres du muscle squelettique

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Détection d’endotoxines dans les Nano-formulations utilisant la Limulus Amébocytes Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell culture system that was used for a long-term cell differentiation study using microscopy. The microfluidic system consists of the following major components: an optically transparent electrotactic chip, a transparent indium-tin-oxide (ITO) heater, a culture media-filling pump, an electrical power supply, a high-frequency power amplifier, an EF multiplexer, a programmable X-Y-Z motorized stage, and an inverted phase-contrast microscope equipped with a digital camera. The microfluidic system is beneficial in simplifying the overall experimental setup and, in turn, the reagent and sample consumption. This work involves the differentiation of neural stem and progenitor cells (NPCs) induced by direct current (DC) pulse stimulation. In the stem cell maintenance medium, the mouse NPCs (mNPCs) differentiated into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes after the DC pulse stimulation. The results suggest that simple DC pulse treatment could control the fate of mNPCs and could be used to develop therapeutic strategies for nervous system disorders. The system can be used for cell culture in multiple channels, for long-term EF stimulation, for cell morphological observation, and for automatic time-lapse image acquisition. This microfluidic system not only shortens the required experimental time, but also increases the accuracy of control on the microenvironment.

In this study, we present a protocol for the differentiation of neural stem and progenitor cells (NPCs) solely induced by direct current (DC) pulse stimulation in a microfluidic system.

Différenciation des cellules précurseurs neuronales induites par le champ électrique dans les appareils microfluidiques

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell ...

Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the mechanisms of cell response when exposed to electrical fields can therefore guide the optimization of clinical applications. In vitro experiments aim to help uncover those, offering the advantage of wider input and output ranges that can be ethically and effectively assessed. However, the advancements in in vitro experiments are difficult to reproduce directly in clinical settings. Mainly, that is because the ES devices used in vitro differ significantly from the ones suitable for patient use, and the path from the electrodes to the targeted cells is different. Translating the in vitro results into in vivo procedures is therefore not straightforward. We emphasize that the cellular microenvironment's structure and physical properties play a determining role in the actual experimental testing conditions and suggest that measures of charge distribution can be used to bridge the gap between in vitro and in vivo. Considering this, we show how in silico finite element modelling (FEM) can be used to describe the cellular microenvironment and the changes generated by electric field (EF) exposure. We highlight how the EF couples with geometric structure to determine charge distribution. We then show the impact of time dependent inputs on charge movement. Finally, we demonstrate the relevance of our new in silico model methodology using two case studies: (i) in vitro fibrous Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) (PEDOT-PSS) scaffolds and (ii) in vivo collagen in extracellular matrix (ECM).

This paper presents a strategy for building finite element models of fibrous conductive materials exposed to an electric field (EF). The models can be used to estimate the electrical input that cells seeded in such materials receive and assess the impact of changing the scaffold's constituent material properties, structure or orientation.

Modélisation par éléments finis d’un microenvironnement électrique cellulaire

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Dispositifs électriques et magnétiques de champ pour la stimulation des tissus biologiques

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical communities. The resolution of results obtained from current methods of measuring certain biomarkers can take several days or weeks to obtain, as they can be limited in resolution both spatially and temporally (e.g., fluid compartment microdialysis of interstitial fluid analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA], high-performance liquid chromatography [HPLC], or mass spectrometry); thus, their guidance of timely diagnosis and treatment is disrupted. In the present study, a unique technique for detecting and measuring peptide transmitters in vivo through the use of a capacitive immunoprobe biosensor (CI probe) is reported. The fabrication protocol and in vitro characterization of these probes are described. Measurements of sympathetic stimulation-evoked neuropeptide Y (NPY) release in vivo are provided. NPY release is correlated to the sympathetic release of norepinephrine for reference. The data demonstrate an approach for the fast and localized measurement of neuropeptides in vivo. Future applications include intraoperative real-time assessment of disease progression and minimally invasive catheter-based deployment of these probes.

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Established immunochemical methods to measure peptide transmitters in vivo rely on microdialysis or bulk fluid draw to obtain the sample for offline analysis. However, these suffer from spatiotemporal limitations. The present protocol describes the fabrication and application of a capacitive immunoprobe biosensor that overcomes the limitations of the existing techniques.