Alberto Guiggiani pour développer le système de contrôle en temps réel, Evelina Chieregatti et Hanako Tsushima des discussions perspicaces, Giacomo Pruzzo et Alessandro Parodi pour le développement de l&#39;électronique et des logiciels personnalisés et Claudia Chiabrera et Marina Nanni pour leurs conseils d&#39;expert et aide à la préparation de culture cellulaire.

1. Configuration optique Le système optique entier a été décrit précédemment 15. En bref, le système pinces optiques est basé sur une onde continue ytterbium (CW) fibre laser fonctionnant à 1064 nm (IPG Laser GmbH). Un modulateur spatial de lumière (SLM) (LCOS-SLM, modèle X10468-07 - Hamamatsu) fait varier la phase du faisceau laser IR entrant pour commander la position de la tache de focalisation de piégeage sur la boîte de culture par ordinateur hologrammes générés. Les Blue-pinces logiciels (lien web sur la table de l&#39;équipement) hologrammes générés librement disponibles projetées sur le modulateur spatial de lumière. L&#39;interféromètre pour les mesures de spectroscopie de force reposait sur une photodiode à quatre quadrants (DOU, S5980 avec C5460SPL 6041 board - Hamamatsu) et une photodiode (PD, PDA100A-EC - Thorlabs). La source de dissection laser pulsé est un sous-nanoseconde Nd UV: YAG à 355 nm (PNV-001525-040, POWERCHIP nano-Pulse laser UV - Teem Photonics). Un modulateur acousto-Modulateur optique (MQ110-A3-UV, 355 nm, la silice fondue-AA-opto-électronique) contrôle la puissance du laser UV directement à l&#39;échantillon. La pincette optique holographique et le laser micro-dissecteur sont intégrés sur un microscope droit modifié (BX51 - Olympus) équipé d&#39;un 60X, 0,9 NA eau trempage étape objective.The du microscope se compose d&#39;un trois-axes linéaires moteur à courant continu de micro-positionnement Système (M-126.CG1, Physique-Instruments) portant une piézoélectrique étape de nano-positionnement à 3 axes séparés (P-733.3DD, Physique-Instruments) pour combiner le mouvement grossier de l&#39;échantillon avec la résolution inférieure au nanomètre de l&#39;élément piézo- étape. Le système de la platine du microscope est équipé de deux boucles de régulation agissant en synergie pour maintenir le point de mise au point de piégeage à la bonne position, en fonction du mode de fonctionnement sélectionné (ou position de serrage de la main, statique ou dynamique) 16. En particulier, une boucle de rétroaction interne agit sur un étage piézo-électrique, pour garder la perle à la sélectioned distance du centre du piège. L&#39;autre boucle externe commande la position de la platine motorisée pour exploiter la région couverte par l&#39;actionneur piézo-électrique sur une surface plus grande que sa course disponible 17. Lorsque l&#39;élément piézo-phase atteint la limite de la course disponible dans une direction, la boucle externe déplace le micro-étape dans la direction opposée, donc l&#39;élément piézo récupère vers sa position centrale, car elle suit le bourrelet emprisonné collée à l&#39;échantillon. Lorsque l&#39;élément piézo-stade atteint la position centrale de sa gamme de cours, le micro scène arrêtée. D&#39;autres détails du système sont présentés dans Guiggiani et al 16,17. Un dispositif à effet Peltier (QE1 chauffage résistif avec commande de chauffage à deux canaux TC-344B - Warner Instruments) contrôle la température de la culture de cellules sous un microscope (37 ° C). Dans la culture, le pH et l&#39;humidité ont été maintenus à des conditions physiologiques en aérant un polydiméthyle conçu sur mesuresiloxane (PDMS) manchon (intégration de l&#39;objectif de microscope) avec humidifié carbogène (95% O2, 5% CO2). 2. Culture cellulaire Préparation Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le ministère italien de la Santé. Les cultures primaires ont été obtenus à partir de l&#39;hippocampe de souris (C57BL6J, Charles River) au jour embryonnaire 18 (E18). <ol><li> Les neurones ont été étalées à une concentration de 25.000 cellules / ml à fond de verre boîtes de Pétri (P35G-0-14-C - Matek Corporation). La faible concentration des cellules en culture est nécessaire pour éviter la formation d&#39;un réseau dense dès les premiers jours in vitro. A la concentration cellulaire mentionné, la probabilité de trouver des cellules isolées avec un neurites plus pas connecté à d&#39;autres cellules est beaucoup plus élevé. </li></ol> 3. Revêtement perle <ol><li> Microsphères de polymère (Ø 4 pm, laboratoires COOH-fin-Bangs, code produit PC05N/6700) ont été enduites de poly-D-lysine suivant la procédure décrite dans la Polylink Coupling Kit Protein (Polysciences, code produit 19539). Les billes sont recouvertes de la même molécule utilisée pour couvrir le support de la culture et de la faveur cellules adhérence. </li></ol> 4. Choisissez Neuron isolé. Détachez une perle du substrat Culture, Piège et déplacez-côté de la Neuron <ol><li> Mettez la culture boîte de Pétri sur la platine du microscope. Après avoir réglé la mise au point sur l&#39;échantillon par le mouvement de la scène, corriger la position du condenseur objectif éclairant de mettre Kohler-éclairage. Aligner l&#39;optique d&#39;éclairage pour régler l&#39;état Kolher-éclairage est nécessaire pour améliorer la qualité de l&#39;imagerie en champ clair. En utilisant de telles conditions d&#39;alignement, il est également nécessaire pour maximiser l&#39;efficacité de la collecte de laser IR (à travers le condenseur objectif), de la diffusion sonde emprisonné, pour effectuer son suivi interférométrique par le DOU et PD. </li><li> Introduire à la pipette un peu pl de la solution mère de microsphères revêtuà la boîte de culture. Microsphères déposer et adhérer au substrat de culture. Le nombre de pi injecté dans la boîte de culture dépend de la concentration des microsphères de la solution mère. La condition idéale est d&#39;avoir entre un et deux microsphères par champ imagerie de vue. Quand trop de microsphères sont ajoutés à la boîte de culture, ils peuvent déjà attacher au hasard dans les neurones en culture. </li><li> Déplacez-vous dans la boîte de culture, la recherche d&#39;un neurone isolé avec un neurites plus (l&#39;axone), et enregistrer la position de la platine du microscope. </li><li> Déplacer et rechercher une perle adhéré au support de culture. </li><li> Allumez le laser de piégeage IR. A ce stade, aucun des hologrammes sont projetés sur SLM, et de la position de la tache laser IR coïncide avec la position du spot laser UV. Régler la position axiale de la tache infrarouge 3.2 um au-dessus de la surface de support de culture, par le mouvement de la platine du microscope. </li><li> Régler la puissance du laser UV directement à l&#39;échantillon de moins de 1 mW. LeUV laser dissection a déjà été calibré 14: 6.5 uW le support en verre est soumis à une ablation 4 mW une connexion neuronale est complètement disséqué 2,5 mW une neurites est partiellement lésé &lt;1 mW une onde de choc est produite dans la boîte de culture. L&#39;onde de choc optique est suffisamment fort pour détacher le talon du support de verre. </li><li> Allumez le laser UV, tout en laissant le laser infrarouge, et déplacez le spot UV au-dessus de la perle respecté par le mouvement de la platine du microscope. Les perles se détache de la surface, et il est piégé par le laser IR. Ensuite, éteignez le laser UV. </li><li> Déplacer les billes piégées plusieurs micromètres au-dessus du support de verre (de 20 à 30 pm). La levée du talon de cette position, on l&#39;empêche de venir au contact d&#39;autres cellules pendant qu&#39;il est déplacé vers le neurone choisi précédemment. Porter le bourrelet à la position de phase enregistrée précédemment. Régler la vitesse de phase à une valeur faible (10 um / sec) de telle sorte la force de traînée du fluide ne dépasse pas le piège optiquevigueur ping. </li></ol> 5. Déplacer la position du piège par rapport au Coin Dissector laser et Axon Position par hologramme généré par ordinateur, et de calibrer la rigidité pinces optiques <ol><li> Déplacer le bourrelet vers le support de verre de visualiser l&#39;axone. Le bourrelet est maintenu au-dessus de la cellule pour éviter le contact avec celui-ci (environ 5 um au-dessus du support de verre). </li><li> Déplacer la platine du microscope pour déplacer le spot de focalisation UV sur le centre de la largeur de l&#39;axone. Enregistrer la position actuelle de la scène. </li><li> Déplacer le focus position au comptant IR par hologramme généré par ordinateur. Dans cette étape, l&#39;étape est arrêtée dans la position choisie à l&#39;étape précédente. Lorsque l&#39;hologramme généré par ordinateur est projeté sur le SLM, la bille piégée est déplacée par rapport à l&#39;axone. Nous déplacer le point laser IR pour avoir le bourrelet emprisonné aligné sur le centre de la neurite, de la tache laser UV centré sur le même neurites aussi. Le spot IR et donc la perle piégée sont positionnés le long de la neurites5-10 um loin de l&#39;endroit UV. Nous passons la position de l&#39;IR par rapport à la tache UV en fonction de la géométrie des neurites. Dans le cas où les pinces optiques ne sont pas équipés d&#39;un système SLM, la position peut être modifiée par des miroirs inclinables ou déflecteurs acoustiques optiques, sur le chemin optique IR. Le spot laser infrarouge peut être positionné à une distance de 5 à 10 um de la tache UV afin d&#39;éviter une interaction optique du faisceau de dissection avec la sonde piège, qui pourraient influencer son mouvement brownien et modifier les traces de spectroscopie de force. </li><li> Après la définition de la nouvelle position de la tache infrarouge par rapport à la tache UV et la position de l&#39;axone, déplacer la platine pour positionner le bourrelet emprisonné loin de l&#39;axone et éviter la collision avec elle. Déplacer la position axiale du bourrelet emprisonné à environ 2 um au-dessus de la vitre de recouvrement. </li><li> Aligner le DOU du centre Les franges d&#39;interférence sur elle: signaux différentiels QPD x et y sont des zéros lorsque le DOU est centrée. Acquérir 5 sec du mouvement brownien de la bille piégée par le interférométriemètre, à la fréquence d&#39;échantillonnage de 50 KHz. Obtenir la rigidité (pN / nm) et la sensibilité (V / nm) du piège optique par la méthode de spectre de puissance 18. </li></ol> 6. Fixez la perle de l&#39;axone. Effectuer la mesure de force axotomie et simultanée <ol><li> Levez la position perle piégée environ 4 um au-dessus du couvercle en verre, et le déplacer vers la position de scène enregistrée précédemment (voir l&#39;étape 3.2). </li><li> Déplacez le bas talon coincé vers l&#39;axone jusqu&#39;à ce qu&#39;il touche le neurites. La collision entre le bourrelet emprisonné et l&#39;axone est contrôlée par le signal DOU z détecter le déplacement de la bille emprisonnée dans le sens axial. </li><li> Attendre 10 sec avec le bourrelet emprisonné poussé contre l&#39;axone pour favoriser son adhérence à la membrane des neurites. </li><li> Déplacer le micro-étape pour déplacer la bille piégée de l&#39;axone, et vérifier ainsi son adhésion à la membrane cellulaire. Si la perle respecté, il s&#39;échappe du piège optique. </li><li> Déplacer en arrière le piège à laser sur le bourrelet colléeet activer la boucle de force avec serrage état de force égale à zéro. De cette façon, les repositionne piézo-scène la perle, attachés à la cellule, au centre du piège optique. Si le système n&#39;a pas de contrôle de la boucle de rétroaction, la position d&#39;interruption du laser peut être déplacé par la platine du microscope pour le centrer sur la sonde collée. Le centre du piège est atteinte lorsque les signaux QPD sont les mêmes que lorsque la bille est coincée et n&#39;est pas collée à la cellule (y QPD signaux égaux à zéro et x et le signal DOU z donne la même tension somme des quatre quadrants que lorsque le talon est coincé loin de toute surface). </li><li> Définir une condition de force la bride sur l&#39;axe z, le positionnement du laser de piégeage légèrement sur le centre de la bille (environ 100 nm), pour générer une précontrainte sur la sonde piège collée. Dans le cas où le système n&#39;est pas équipé d&#39;une commande de force de serrage, la position de piège optique peut être soulevée vers le haut au pas de 25 nm par la platine du microscope. Le signal DOU z permet de surveiller. Par conséquent, utiliser this signal pour régler la position de la trappe de laser par rapport à la sonde collée. Une telle pré-tension est nécessaire pour détecter la pression exercée sur la membrane après la lésion axonale et la diminution conséquente du mouvement brownien de la sonde adhéré. Une approche similaire a été proposée pour mesurer le relâchement de la tension dans un câble d&#39;attache de la membrane par imagerie vidéo 19. </li><li> Déconnexion du retour de force-pince pour mesurer la force sur la sonde adhérant à la condition de position de serrage (l&#39;élément piézo-étape est bloquée). </li><li> Lancer l&#39;enregistrement simultané des positions des sondes piégés par l&#39;interféromètre (20 fréquence d&#39;échantillonnage KHz), et la cellule pendant laser axotomie en accéléré imagerie à champ clair (20 Hz fréquence de trame). </li><li> Allumez le laser UV pour délivrer des impulsions laser jusqu&#39;à une lésion devient visible sur l&#39;image de l&#39;axone (généralement 200-400 impulsions optiques sont nécessaires énergie par impulsion: 25. NJ), puis éteignez le laser UV. </li><li> Continuez l&#39;enregistrement par l&#39;interféromètre pour environ 3 kmn, jusqu&#39;à ce que les coordonnées x, y et z des traces QPD atteindre un plateau. </li></ol> 7. Quantifier le total relâchement de tension <ol><li> Autre les traces enregistrées QPD (en volts) par la sensibilité étalonnée du piège optique, d&#39;obtenir des traces respectives de nanomètres. </li><li> Filtrer la trace de déplacement z x, y, et par un filtre passe-haut avec les couper à 10 Hz. </li><li> Calculer la variance totale des traces filtrées représentant le mouvement brownien de la bille piégée. Calcul de la variance à 25 msec pour recouvrir les fenêtres de temps de 500 ms (10 000 points de données) 20. Le filtrage des traces passe-haut exclut les effets du mouvement brownien en raison de la fluctuation de la membrane ou le mouvement de l&#39;actine corticale. Le mouvement brownien de la bille est réduite par les forces optiques et les forces d&#39;adhérence sur la membrane cellulaire. Lorsque la membrane est tendue en raison de la libération des tensions sa viscosité augmente, et donc le mouvement brownien de la perle, détectée immédiatementdiatement après axotomy, commence à diminuer. </li><li> Définir T0: début de la diminution de la variance du mouvement brownien, après la livraison de l&#39;énergie laser UV. A l&#39;instant t0 le temps indique le début de la déformation de la membrane. </li><li> Définir t1: la fin de la diminution de la variance du mouvement brownien (quand il atteint un plateau). L&#39;instant t1 marque la fin de la déformation de la membrane. </li><li> Effectuer suivi vidéo des débris ou une égratignure sur le support de verre de couverture, afin de mesurer une éventuelle dérive de l&#39;échantillon au cours de la mesure de force. Pour suivre la particule sur le support de verre, nous appliquons d&#39;abord seuils des images brillantes sur le terrain, afin d&#39;obtenir une pile d&#39;images binaires avec la particule en blanc sur un fond noir. Ensuite, on suivre le centre de masse de particules avec une précision sous-pixel (en utilisant le logiciel ImageJ gratuit). </li><li> Soustraire la dérive mesurée à partir des traces QPD déplacement. Multiplier les traces QPD dérive corrigée par la rigidité optique calibré respectif (k x, k <sub&gt; y, z k) afin d&#39;obtenir les traces Fz Fx, Fy, dans piconewtons. </li><li> Calculer la trace de la force totale de F tot = √ (Fx ​​2 + 2 + Fy Fz 2). </li><li> Calculer la libération totale de la force entre T0 et T1 comme F libéré = F tot (t1) - F tot (T0). La force mesurée à l&#39;instant t0 doit être soustraite, car il est dû au déplacement de la sonde à partir du centre de la trappe, lorsque les adhère bourrelet à l&#39;neurites. </li><li> Calculer la surface de contact des neurites entre le bourrelet piégé et la position du spot laser UV: sur la mesure d&#39;image de champ lumineux les longs (L) et à court axes (D) de la neurites entre le bourrelet piégé et la position du spot laser UV. La zone de contact axone est un axone = L x D. </li><li> Normaliser la totale libérée force F publié par la zone de contact axone Un axone. </li></ol>

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	<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Trapping+and+Manipulation+of+Viruses+and+Bacteria.">Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria.</a> Science. 235, 1517-1520 (1987).</li><li>Berns, M. W., Aist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+cell+and+developmental+biology.">Laser microsurgery in cell and developmental biology.</a> Science. 213, 505-513 (1981).</li><li>Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery+with+molecular+fluorescence+imaging+using+activatable+cell-penetrating+peptides+decreases+residual+cancer+and+improves+survival.">Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).</li><li>Stiess, M., Maghelli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+extension+occurs+independently+of+centrosomal+microtubule+nucleation.">Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation.</a> Science. 327, 704-707 (2010).</li><li>Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+induced+cell+fusion+in+combination+with+optical+tweezers:+the+laser+cell+fusion+trap.">Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap.</a> Cytometry. 12, 505-510 (1991).</li><li>Pinato, G., Raffaelli, T., D'Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+delivery+of+liposome+encapsulated+chemical+stimuli+to+neuronal+cells.">Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells.</a> J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).</li><li>Kress, H., Park, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+stimulation+with+optically+manipulated+microsources.">Cell stimulation with optically manipulated microsources.</a> Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).</li><li>Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+history+of+laser+scissors+(microbeams).">A history of laser scissors (microbeams).</a> Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).</li><li>Difato, F., Dal, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+optical+tweezers+and+laser+dissector+for+controlled+ablation+of+functional+connections+in+neural+networks.">Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks.</a> Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).</li><li>Goslin, K., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+observations+on+the+development+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture.">Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).</li><li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction.">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li><li>O'Toole, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+stretching+in+slow+axonal+transport.">The role of stretching in slow axonal transport.</a> Biophys. J. 100, 351-360 (2011).</li><li>O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physical+model+of+axonal+elongation:+force,+viscosity,+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth.">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).</li><li>Difato, F., Tsushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+actin+waves+during+regeneration+after+axonal+lesion+is+enhanced+by+BDNF.">The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF.</a> Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).</li><li>Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+optical+manipulation+and+electrophysiological+tools+to+modulate+and+record+activity+in+neural+networks.">Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks.</a> International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).</li><li>Guiggiani, A., Torre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+and+long-term+interferometric+tracking+by+static+and+dynamic+force-clamp+optical+tweezers.">Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers.</a> Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).</li><li>Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RealTime+Suite:+a+step-by-step+introduction+to+the+world+of+real-time+signal+acquisition+and+conditioning.">RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning.</a> 3rd Real Time Linux Workshop. , (2011).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Review of Scientific Instruments. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decrease+in+membrane+tension+precedes+successful+cell-membrane+repair.">A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair.</a> Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).</li><li>Kress, H., Stelzer, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+act+as+phagocytic+tentacles+and+pull+with+discrete+steps+and+a+load-dependent+velocity.">Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).</li><li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site.">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li><li>Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+mechanotransduction:+pathways,+probes,+and+physiology.">Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).</li><li>Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+surgery+and+optical+trapping+in+a+laser+scanning+microscope.">Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope.</a> Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).</li><li>Carter, A. R., King, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+an+optical+microscope+to+0.1+nm+in+three+dimensions.">Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions.</a> Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications.">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).</li><li>Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+strategies+for+control+of+neuronal+cell+adhesion:+A+review.">Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review.</a> Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Nous décrivons dans ce travail une méthode quantitative pour comparer l&#39;adhérence des neurites au substrat de culture, en effectuant une mesure par spectroscopie de force simultanée pendant lésion cellulaire induite par laser. La libération mesurée de tension est liée au degré d&#39;adhésion de la cellule au substrat: les cellules avec un plus grand nombre d&#39;adhésions focaux devraient libérer moins de tension. Mesure de la libération de la tension en fonction de piconewtons fournit une quantité phy...

La microscopie optique est l&#39;un du système de formation d&#39;image moins invasive disponible pour observer les cellules vivantes. Avec l&#39;exploitation des effets tels que la pression de radiation (comme pinces optiques 1), ou flux de photons de haute énergie (comme dans dissection laser 2), cette technologie a été étendue aux nano-manipulation. Le système d&#39;imagerie optique fournit un contrôle précis de visualiser et de manipuler les cibles cellulaires sous 3. Dans le même temps, grâce à l&#39;étalonnage précis de la puissance du laser livré, outils optiques accomplir soit la manipulation de l&#39;échantillon mou ou invasive avec une reproductibilité sans précédent. Plusieurs laboratoires intégrés, dans le même dispositif expérimental, pinces optiques et dissecteur laser afin de réaliser l&#39;ablation organites 4, à fusionner les différentes cellules 5, ou pour stimuler les cellules par entraîné optiquement cargaisons 6,7. Bien pinces optiques, après étalonnage de la rigidité optique, permettent dele contrôle de la force appliquée à la cellule sur une échelle piconewton, les systèmes de dissection laser peut moduler la manipulation optique, qui va de la membrane photo-ration à l&#39;ablation des organites simples ou dissection des structures sub-cellulaires. Cependant, l&#39;étalonnage de dissection laser repose sur l&#39;évaluation qualitative de l&#39;entité de manipulation optique par rapport à l&#39;énergie fournie à l&#39;échantillon, principalement basée sur l&#39;analyse d&#39;images illustrant les changements morphologiques dus à l&#39;échantillon 8. Dans la méthode présentée, nous montrons comment effectuer la mesure de la spectroscopie de force au cours de la dissection axonale laser d&#39;un neurone en développement, pour quantifier, sur l&#39;échelle piconewton, la force produite par un équilibre altération de la structure du cytosquelette d&#39;un compartiment subcellulaire 9. Des neurones en culture adhèrent au substrat, et polarisent au cours du développement. La phase de polarisation se produit durant les cinq premiers jours in vitro. À la deuxième étape de la polarisation, l&#39;un des Extrudment neurites est long, et il faudra différencier pour devenir l&#39;axone 10. Élongation des axones en réponse à la force de traction au niveau du cône de croissance a déjà été modélisé par le modèle de Dennerl 11. Récemment, ce modèle a été étendu pour inclure 12 le rôle de l&#39;adhésion neurites sur les substrats de la matrice extracellulaire. Ce modèle biophysique, proposé après les observations expérimentales 13, a montré que les forces de traction sur le cône de croissance, se propageant le long de la neurites, sont modulés par des adhérences focales au substrat. De même, lésion axonale produit une libération locale de tension se propageant en direction du corps de la cellule. Ainsi, nous avons proposé que la mesure de cette tension libérée dans un emplacement le long de l&#39;axone entre la lésion et le corps cellulaire offre la possibilité d&#39;évaluer l&#39;issue d&#39;amortissement des adhésions focales ne sont pas touchés. Nous calibrer l&#39;énergie nécessaire photons flux de la dissection laser pour contrôler l&#39;étendue de l&#39;avarie de axonale infligéee, de la section complète de la lésion partielle. Après la calibration, nous avons répété lésion partielle des axones des neurones plusieurs différenciation et développé le protocole de quantifier le relâchement de la tension, et obtient ainsi un paramètre quantitatif pour estimer l&#39;adhérence de l&#39;axone au substrat 14. Dans le présent travail, nous décrivons en détail le protocole mis au point, ce qui représente une procédure expérimentale précise pour évaluer et comparer avec sensibilité piconewton l&#39;adhésion axonale au substrat dans différentes conditions expérimentales telles que le traitement chimique 14, ou différents types de support de culture cellulaire.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer microspheres, &Oslash; 4 &mu;m, COOH coated</td>
			<td>Bangs laboratories</td>
			<td>PC05N/6700</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyLink Protein Coupling Kit</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>19539</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR laser</td>
			<td>IPG Laser GmbH</td>
			<td>YLM-5-SC-LP</td>
			<td>ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatial light modulator</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>LCOS-SLM 10468-07</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue-tweezers software</td>
			<td>Optics group, University of Glasgow</td>
			<td>Free downloadable software</td>
			<td><a href="http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/" target="_blank">http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Free downloadable software</td>
			<td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/ </a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPD</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S5980 with C5460SPL 6041 board</td>
			<td>Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD</td>
			<td>Teem Photonics</td>
			<td>PDA100A-EC</td>
			<td>Photodiode to measure z trapped probe displacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nano-Pulse UV laser</td>
			<td>AA-optoelctronics</td>
			<td>PNV-001525-040</td>
			<td>Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acoustic Optic Modulator</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>V887ECSUVB EMCCD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier device</td>
			<td>Physic Instruments</td>
			<td>QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage: micro+piezo stage</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daq</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>NI PCI-6229</td>
			<td>Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of tension release during laser induced axon lesion to evaluate axonal adhesion to the substrate at piconewton and millisecond resolution

La formation des connexions fonctionnelles dans un réseau de neurones en développement est influencée par des signaux extrinsèques. La croissance des neurites des neurones en développement est soumis à des signaux chimiques et mécaniques, et les mécanismes par lesquels il détecte et réagit aux signaux mécaniques sont mal compris. L&#39;élucidation du rôle des forces dans la maturation des cellules permettra à la conception des échafaudages qui peut favoriser l&#39;adhérence cellulaire et l&#39;accouplement du cytosquelette au substrat, et donc d&#39;améliorer la capacité de différents types de neurones pour régénérer après une blessure. Ici, nous décrivons une méthode pour appliquer des mesures de spectroscopie de force simultanés pendant lésion cellulaire induite par laser. Nous mesurons relâchement de la tension dans l&#39;axone partiellement lésé par simultané suivi interférométrique d&#39;une sonde optique piégé adhéré à la membrane de l&#39;axone. Notre protocole expérimental détecte le relâchement de la tension avec sensibilité piconewton, et la dynamique de la libération de tension aurésolution de la milliseconde. Par conséquent, il propose une méthode à haute résolution pour étudier comment le couplage mécanique entre les cellules et les substrats peut être modulée par un traitement pharmacologique et / ou par des propriétés mécaniques distinctes du substrat.

La cellule génère des forces de traction sur le substrat par ses points d&#39;adhésion. Force générée par les éléments du cytosquelette sont en équilibre avec la force antagoniste du substrat de culture. Après lésion induite par laser de la neurite, une partie des câbles tendus de cytosquelette sont perturbés et leur tension équilibrée est libéré en raison de la force antagoniste de l&#39;adhérence du substrat est éliminé. La tension libérée est partiellement diffusé sur les adhésions focales ne ...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution at JoVE.

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Nous avons mesuré la sortie de tension dans un axone qui a été partiellement lésé avec un dissecteur laser en mesure de spectroscopie de force simultanées effectuées sur une sonde optiquement piégé collée à la membrane de l&#39;axone. Le protocole expérimental développé évalue l&#39;adhérence des axones au substrat de culture.

Mesure de la tension de sortie Pendant Laser Induced Axon lésion axonale évaluer l&#39;adhésion au substrat à piconewton et Millisecond Résolution

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

measurement-tension-release-during-laser-induced-axon-lesion-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K vues.  National Research Council of Italy. Nous avons mesuré la sortie de tension dans un axone qui a été partiellement lésé avec un dissecteur laser en mesure de spectroscopie de force simultanées effectuées sur une sonde optiquement piégé collée à la membrane de l'axone. Le protocole expérimental développé évalue l'adhérence des axones au substrat de culture.

Vidéo: Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Conception d&#39;un bioréacteur pour la pression cyclique Ex Vivo Étude des valves cardiaques aortiques

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Recherche

Bio-ingénierie

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1. The main difficulty of this assay is the perceived cost ($25-100K) and technical expertise required for implementing a laser ablation system2,3. However, solid-state pulse lasers of modest costs (&lt;$10K) can provide robust performance for laser ablation in transparent preparations where target axons are "close" to the tissue surface. Construction and alignment of a system can be accomplished in a day. The optical path provided by light from the focused condenser to the ablation laser provides a convenient alignment guide. An intermediate module with all optics removed can be dedicated to the ablation laser and assures that no optical elements need be moved during a laser ablation session. A dichroic in the intermediate module allows simultaneous imaging and laser ablation. Centering the laser beam to the outgoing beam from the focused microscope condenser lens guides the initial alignment of the system. A variety of lenses are used to condition and expand the laser beam to fill the back aperture of the chosen objective lens. Final alignment and testing is performed with a front surface mirrored glass slide target. Laser power is adjusted to give a minimum size ablation spot (&lt;1um). The ablation spot is centered with fine adjustments of the last kinematically mounted mirror to cross hairs fixed in the imaging window. Laser power for axotomy will be approximately 10X higher than needed for the minimum ablation spot on the target slide (this may vary with the target you use). Worms can be immobilized for laser axotomy and time-lapse imaging by mounting on agarose pads (or in microfluidic chambers4). Agarose pads are easily made with 10% agarose in balanced saline melted in a microwave. A drop of molten agarose is placed on a glass slide and flattened with another glass slide into a pad approximately 200 um thick (a single layer of time tape on adjacent slides is used as a spacer). A "Sharpie" cap is used to cut out a uniformed diameter circular pad of 13mm. Anesthetic (1ul Muscimol 20mM) and Microspheres (Chris Fang-Yen personal communication) (1ul 2.65% Polystyrene 0.1 um in water) are added to the center of the pad followed by 3-5 worms oriented so they are lying on their left sides. A glass coverslip is applied and then Vaseline is used to seal the coverslip and prevent evaporation of the sample.

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse imaging is a sensitive way to assay the effects of mutations in C. elegans on axon regeneration. A high quality, but inexpensive, laser ablation system can be easily added to most microscopes. Time lapse imaging over 15 hours requires careful immobilization of the worm.

Construire un petit budget laser axotomie système pour étudier la régénération des axones dans le C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration and cell-cell interactions. The two key parameters of cellular biomechanics are cellular deformability or stiffness and the ability of the cells to contract and generate force. Here we describe a quick and simple method to estimate cell stiffness by measuring the degree of membrane deformation in response to negative pressure applied by a glass micropipette to the cell surface, a technique that is called Micropipette Aspiration or Microaspiration.
Microaspiration is performed by pulling a glass capillary to create a micropipette with a very small tip (2-50 &mu;m diameter depending on the size of a cell or a tissue sample), which is then connected to a pneumatic pressure transducer and brought to a close vicinity of a cell under a microscope. When the tip of the pipette touches a cell, a step of negative pressure is applied to the pipette by the pneumatic pressure transducer generating well-defined pressure on the cell membrane. In response to pressure, the membrane is aspirated into the pipette and progressive membrane deformation or "membrane projection" into the pipette is measured as a function of time. The basic principle of this experimental approach is that the degree of membrane deformation in response to a defined mechanical force is a function of membrane stiffness. The stiffer the membrane is, the slower the rate of membrane deformation and the shorter the steady-state aspiration length.The technique can be performed on isolated cells, both in suspension and substrate-attached, large organelles, and liposomes.
Analysis is performed by comparing maximal membrane deformations achieved under a given pressure for different cell populations or experimental conditions. A "stiffness coefficient" is estimated by plotting the aspirated length of membrane deformation as a function of the applied pressure. Furthermore, the data can be further analyzed to estimate the Young's modulus of the cells (E), the most common parameter to characterize stiffness of materials. It is important to note that plasma membranes of eukaryotic cells can be viewed as a bi-component system where membrane lipid bilayer is underlied by the sub-membrane cytoskeleton and that it is the cytoskeleton that constitutes the mechanical scaffold of the membrane and dominates the deformability of the cellular envelope. This approach, therefore, allows probing the biomechanical properties of the sub-membrane cytoskeleton.

Here we describe a quick and simple method to measure cell stiffness. The general principle of this approach is to measure membrane deformation in response to well-defined negative pressure applied through a micropipette to the cell surface. This method provides a powerful tool to study biomechanical properties of substrate-attached cells.

Aspiration par micropipette des cellules au substrat joints pour estimer la rigidité cellulaire

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Utilisant une impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes pour mesurer les changements en temps réel dans adhésion cellulaire et De-adhérence induites par Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Détection de biomarqueurs exosomales par déclenchement électrique induite par champ et évaluation (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and adverse effects1,2,3,4,5,6,7. However, several challenges remain before these treatments can be applied more widely. The development and validation of intraductal therapeutics in an appropriate animal model facilitate the development of intraductal therapeutic strategies for patients. While the mouse mammary gland has been widely used as a model system of mammary development and tumorigenesis, the anatomy is distinct from the human gland. A larger animal model, such as the rabbit, may serve as a better model for mammary gland structure and intraductal therapeutic development. In contrast to mice, in which ten ductal trees are spatially distributed along the body axis, each terminating in a separate teat, the rabbit mammary gland more closely resembles the human gland, with multiple overlapping ductal systems that exit through separate openings in one teat. Here, we present minimally invasive methods for the delivery of reagents directly into the rabbit mammary duct and for visualization of the delivery itself with high-resolution ultrasound imaging.

Here, we describe a technique for the localized delivery of reagents to the rabbit mammary gland via an intraductal injection. In addition, we describe a protocol for visualization and the confirmation of delivery by high-resolution ultrasound imaging of contrast agents.

Livraison Intracanalaire le lapin glande mammaire

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

Analyse mécanique dynamique environnementale pour prédire le comportement de ramollissement des Implants neurones

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many cell functions and behaviors. To calibrate and image integrin tension with high force sensitivity and spatial resolution, we developed an integrative tension sensor (ITS), a DNA-based fluorescent tension sensor. The ITS is activated to fluoresce if sustaining a molecular tension, thus converting force to fluorescent signal at the molecular level. The tension threshold for ITS activation is tunable in the range of 10&#8211;60 pN that well covers the dynamic range of integrin tension in cells. On a substrate grafted with an ITS, the integrin tension of adherent cells is visualized by fluorescence and imaged at submicron resolution. The ITS is also compatible with cell structural imaging in both live cells and fixed cells. The ITS has been successfully applied to the study of platelet contraction and cell migration. This paper details the procedure for the synthesis and application of the ITS in the study of integrin-transmitted cellular force.

Integrin tension plays important roles in various cell functions. With an integrative tension sensor, integrin tension is calibrated with picoNewton (pN) sensitivity and imaged at submicron resolution.

D’imagerie intégrine Tension et Force cellulaire à résolution submicronique avec un capteur de Tension intégrative

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical for regulating many processes ranging from development to immunology. Therefore, developing the tools to study these forces at the molecular scale is critical. Our group developed a suite of molecular tension sensors to quantify and visualize the forces generated by cells and transmitted to specific ligands. The most sensitive class of molecular tension sensors are comprised of nucleic acid stem-loop hairpins. These sensors use fluorophore-quencher pairs to report on the mechanical extension and unfolding of DNA hairpins under force. One challenge with DNA hairpin tension sensors is that they are reversible with rapid hairpin refolding upon termination of the tension and thus transient forces are difficult to record. In this article, we describe the protocols for preparing DNA tension sensors that can be "locked" and prevented from refolding to enable "storing" of mechanical information. This allows for the recording of highly transient piconewton forces, which can be subsequently "erased" by the addition of complementary nucleic acids that remove the lock. This ability to toggle between real-time tension mapping and mechanical information storing reveals weak, short-lived, and less abundant forces, that are commonly employed by T cells as part of their immune functions.

This paper describes a detailed protocol for using DNA-based tension probes to image the receptor forces applied by immune cells. This approach can map receptor forces &gt;4.7pN in real-time and can integrate forces over time.

Sondes de tension de l’ADN pour cartographier les forces transitoires du récepteur Piconewton par les cellules immunitaires

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...