Ce travail a été soutenu subventions du NINDS (NS066071) et le NIAAA. (P50AA017823) à NML. Les auteurs remercient le Dr Robert Quinn et le personnel du ministère des Ressources animales de laboratoire pour le soin des animaux. Nous remercions Judson Belmont pour le support technique, Nicole Belletier de l&#39;aide en tant que chercheur d&#39;été de premier cycle (SURF). Nous remercions également le Dr David Cameron pour les commentaires et les modifications sur une version antérieure du manuscrit.

1. Électroporations ex utero avec Expression Green Fluorescent Protein plasmide <ol><li> Plasmide solutions d&#39;injection d&#39;ADN sont préparés avec CAG-eGFP ADN 27 dilué à la concentration de travail finale de 0,33 mg / ml dans ddH 2 O. Qiagen Endo-Free Maxi-Preps sont utilisés pour purifier le plasmide à partir de bactéries transformées. Rapide colorant vert à ~ 0,02% (p / v final) est ajouté à la solution d&#39;ADN en tant que traceur injection. </li><li> Pour préparer la zone chirurgicale, arroser paillasse et le stade microscope à dissection avec une solution d&#39;éthanol à 70% et essuyez-le. Vaporiser ciseaux chirurgicaux et des pinces d&#39;éthanol à 70% avant la dissection et essuyez-le. </li><li> Timed enceintes suisses / Webster barrages sont sacrifiés sur E13 par transfert dans une chambre remplie de CO 2 d&#39;un cylindre pressurisé et le barrage est surveillé jusqu&#39;à ce que tout mouvement a cessé pendant au moins 1 min. Après sacrifice par inhalation de CO 2 les embryons sont retirés de l&#39;utérus et mis enune boîte de Pétri de 10 cm de glace contenant Hanks froide solution saline équilibrée de Hank (HBSS). </li><li> Disséquer soigneusement chaque embryon à partir des membranes extra-embryonnaires environnantes et garder à l&#39;glacées HBSS. </li><li> Transférer chaque embryon individuellement à un deuxième plat de 10 cm de Petri contenant HBSS froid. Utiliser une seringue pour injecter Hamilton 2-3 pl de l&#39;ADN mélange vert rapide dans le ventricule de l&#39;hémisphère cérébral gauche, en prenant soin d&#39;injecter dans une zone corticale spatialement séparée de la zone corticale pour une analyse ultérieure. </li><li> Pour électroporation, maintenez l&#39;embryon délicatement avec une pince et placez la pagaie légère positive de l&#39;électrode pince sur la ligne médiane dorsale de la tête et légèrement négative placez la pagaie sous le menton embryon. Électroporations sont atteints avec un électroporateur BTX830 programmé pour livrer cinq 30 impulsions V de 50 ms de durée, séparées par des intervalles ms 950. Ces réglages sont pour le modèle BTX830. D&#39;autres systèmes peuvent être utilisés selon les instructio fabricantns. </li></ol> 2. Préparation des explants hémisphère entier <ol><li> Après électroporation les embryons sont replacés dans glacées HBSS. Le cerveau est prélevé au moyen de deux pinces de bijoutier n ° 5 pour enlever la peau et le crâne cartilagineux de la tête de l&#39;embryon. Une pince est ensuite glissé sous le cerveau pour retirer le cerveau intact du crâne. L&#39;hémisphère électroporation (à gauche) est ensuite disséqué loin du cerveau et attaché mi-tissu cérébral est retiré. Tout au long de la prise en charge technique de dissection est prise de ne pas endommager les méninges recouvrant l&#39;hémisphère gauche corticale. </li><li> Une fois disséqué chaque embryon est transféré dans HBSS l&#39;aide d&#39;une pipette avec une pointe de coupe 1 ml pipette. L&#39;hémisphère est ensuite expulsé doucement sur un insert de culture revêtus de collagène. Jusqu&#39;à six explants hémisphère sont disposés côté médial vers le bas sur chaque insert de 24 mm. Une fois disposées, HBSS en excès est éliminé de l&#39;insert et l&#39;insert est ensuite placé dans une 35 mm et d&#39;une boîte à 6 puits. Le bien contient exacte 2,7 ml de médias: DMEM-F12 supports contenant Glutamax et additionné de 2% B-27, 1% et 1% G5 pénicilline-Strep. Quelques gouttes des médias du puits peut être introduit à la pipette au-dessus de chaque explant, mais ne pas ajouter des médias au-delà de l&#39;original 2,7 ml par puits. </li><li> Une fois les explants ont été placés sur des filtres de collagène le plat à 6 puits contenant les explants sont placés dans un Billups Rothenberg (BR) chambre (qui contient également un plat d&#39;humidification de l&#39;eau). A 95% / 5% d&#39;oxygène / CO 2 du mélange gazeux est injecté dans la chambre pendant au moins 1 min avant de sceller la chambre fermée et la déconnexion 95% / 5% d&#39;oxygène / CO 2 du tube d&#39;alimentation en gaz. La chambre de BR est ensuite placé dans un 37 ° C incubateur de culture tissulaire pour le reste de la période de culture, 1-2 DIV. </li></ol> 3. Fixation des tissus explantation pour histologie <ol><li> Dans une hotte préparer la solution de fixation Pagano en commençant par solubilisation 8 g de paraformaldéhyde dans 100 ml d&#39;préchauffé (~ 80 &amp; deg, C) ddH 2 O. Ajouter 1-3 gouttes de NaOH concentrée pour favoriser la solubilisation et remuer doucement. Une fois solubilisé mélanger la solution de paraformaldéhyde 8% de 1:1 avec une solution qui est de 500 mM de saccharose, Hepes 100 mM, pH 7,4, 50 mM MgCl 2, 5 mM de KCl pour une concentration finale de paraformaldéhyde 4% de saccharose dans 250 Hepes mm 50 mm , 25 mM MgCl 2, 2,5 mM KCl, pH 7,4. </li><li> Pour fixer les explants réchauffer la solution fix Pagano à 37 ° C. Supprimer rapidement la plupart des DMEM/F12 médias de chaque puits de culture et ajoutez 5 ml de Fix Pagano dans chaque puits d&#39;explants. Assurez-vous de couvrir chaque explant complètement en solution. Fixer pendant 1 heure à température ambiante. Ne retirez pas explants de filtre avant 1 h de fixation. </li><li> Après fixation éliminer la solution de correction Pagano et la remplacer par une solution Pagano sans correction (250 mM HEPES 50 mM de saccharose, 25 mM MgCl2, 2,5 mM de KCl, pH 7,4). Ajouter quelques gouttes d&#39;azoture de sodium à 10% et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à incorporer. </li></ol> 4. Intégration et Sectioning pour histologie <ol><li> Préparer une solution de veau à 10% la gélatine de peau en solubilisant 10 g de gélatine de peau de veau dans 100 ml d&#39;eau tiède (55-60 ° C). Placez une solution de gélatine sur une plaque chauffante réglée à 60 ° C et agiter périodiquement jusqu&#39;à solubilisé. </li><li> Verser environ 10 ml de la solution de gélatine à 10% dans le fond d&#39;une boîte de Petri de 10 cm et 30 min permettre de se solidifier. Cela formera un &quot;pad&quot; pour l&#39;intégration des explants. Ces tampons peuvent être des jours préparés à l&#39;avance et stocké à 4 ° C. Utilisez une règle pour tracer une grille sur le fond de la boîte de Pétri et le transfert des explants individuels dans chaque case de la grille. Enlever les résidus solution Pagano et à l&#39;aide d&#39;une pipette, couvrir chaque explant avec une solution de gélatine chaude 10% et laisser se solidifier. Reprendre l&#39;addition lente d&#39;une solution de gélatine jusqu&#39;à ce que chaque explant est complètement entourée par la gélatine, en prenant soin de ne pas faire fondre le tampon par addition de trop chauffer la gélatine à la fois. Permettre la gélatine à durcir pendant ~ 1 heure. Une fois durci le particulierexplants UAL peut être découpée en petits blocs de gélatine. Les blocs sont ensuite post-fixée dans Pagano fixer pendant 24-48 heures avant la coupe avec un vibratome. </li><li> Explants dans les blocs de gélatine sont positionnés bulbe olfactif et en coupe dans le plan frontal à 100 pm d&#39;épaisseur. Les coupes sont recueillies et stockées dans du PBS + 0,1% d&#39;azoture de sodium à 4 ° C jusqu&#39;à leur traitement immunohistochimique. </li><li> Détection immunohistochimique est réalisée par le transfert de sections dans une plaque à 24 puits (2-3 sections par puits). Premier bloc non spécifique de liaison d&#39;anticorps en ajoutant 0,5 ml de PBST + B (PBS + 0,5% de Triton X 100 et 2% de BSA) à chaque puits, incuber 1 h sous agitation douce. L&#39;anticorps primaire appropriée est ensuite dilué dans du PBST + B et de 0,4 ml par puits est ajouté pour une nuit d&#39;incubation à température ambiante. Le premier est lavé avec du PBS 3X lave pendant au moins 10 minutes chacune. L&#39;anticorps secondaire et 2 pg / ml Hoechst 33342 colorant nucléaire sont ensuite diluées dans du PBST + B et les échantillons sont incubés pendant 2 heures à la température ambianteen agitant doucement. Trois lavages PBS (10 min chacun) sont effectués, puis les coupes sont montées sur des lames à l&#39;aide de 90% de glycérol Tris 50 mM, pH 7,4, milieu de montage. </li></ol>

Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

Nous avons amélioré et évalué un modèle expérimental - explants hémisphère entiers - pour l&#39;étude du développement cortical précoce (E13-E15). Le modèle s&#39;est révélé utile pour l&#39;analyse de la migration et de la différenciation de la lignée neurone excitateur qui constitue la couche 6 du cortex cérébral 25,37. Les principaux avantages du système sont: 1) la croissance organotypique pour 2 DIV, 2) la simplicité de préparation, et 3) l&#39;accès expérimental aux neurones pour...

Les formes de mammifères cortex cérébral à travers la prolifération, la migration concertée et la différenciation des neurones générés successivement. Chaque neurone est né dans la zone ventriculaire (VZ) et migre du VZ dans la zone intermédiaire (IZ), la formation de la plaque corticale (CP) 1. Lors de leur passage à travers les différents domaines corticaux, les neurones migrent afficher de multiples modes de migration 2,3 qui dépendent de l&#39;environnement extracellulaire et d&#39;autres éléments cellulaires (par exemple, la glie radiale) dans le tissu développement. Les neurones corticaux puis arrêter la migration en haut de la plaque de formage corticale dans les processus d&#39;arrêt coïncidant migration neuronale et 4 dendritogénèse. Développement cortical est initiée entre embryonnaires jours 11-13 (E11-13) 5 à travers la couche de mise en place primordiale plexiforme 6 ou preplate (PP), une couche de neurones pionniers qui recouvre le VZ. Éventuelcouche 6 neurones corticaux (c&#39;est à dire les premiers neurones corticaux nés dans le VZ) puis orienter leur corps cellulaire dans un modèle stéréotypé et se fondre en une couche distincte au sein du PP 7. Ces événements diviser le preplate dans une superficielle marginale (future couche corticale 1) et une zone de profondeur, ce dernier composé de cellules sous-plaque (transitoire couche corticale 7). Ce processus, appelé le fractionnement preplate, est un événement fondamental dans la croissance future du cortex cérébral 8. De nombreuses mutations génétiques ont été identifiés qui perturbent les différents aspects du développement cortical 9. Développement cortical peut également être affectée négativement par l&#39;exposition à des toxines ingérées telles que la cocaïne et l&#39;alcool 10 11. Parce que des malformations corticales qui se posent au cours du développement sont probablement contribué à des troubles neurologiques (autisme, par exemple, la schizophrénie), les enquêtes empiriques de perturbations du développement cortical sont inhérentesment important. Il est donc d&#39;une importance considérable pour établir des approches pour étudier le développement cortical qui permet des tests rapides d&#39;effets génétiques ou de la toxine mais aussi de préserver les interactions possibles entre les neurones de différenciation, d&#39;autres types cellulaires et la matrice extracellulaire (ECM) au cours de cette première période de 12 le développement du cerveau . Explants tranche 13 ont fourni un tel système et ont été largement utilisés pour analyser neurone développement cortical 14-16. Toutefois, les essais de tranche peuvent souffrir de l&#39;inconvénient que la migration neuronale et de stratification peut être anormale 17 probablement en raison de dommages aux cellules méningées qui entourent le cerveau en développement et l&#39;ancrage du gliales radiales échafaud. Comme radiales fibres gliales sont un substrat important pour la migration des neurones corticaux 18 rupture de la membrane basale par tranchage peut perturber localement radiale l&#39;architecture des cellules gliales et conduire à la migration corticale altérée. En outre, le sliced surfaces d&#39;explants fournit une région de cellules mortes qui peuvent modifier la composition normale de l&#39;ECM dans ces domaines. Des approches plus récentes ont concentré leur analyse sur les cellules situées au fond de la tranche qui sont entourés par des types de cellules appropriées sains et ECM. Toutefois, dans certains cas, ces nouvelles approches peuvent exiger que l&#39;original tranche épaisse culture cryo-être sectionné ou de la paraffine après fixation de section afin que l&#39;intérieur relativement normal de la tranche est mis à disposition pour l&#39;analyse de 19-21. À la fois l&#39;origine vibratome sectionnement pour préparer les tranches en direct pour la culture, ainsi que la découpe au cryostat ultérieur de tranches fixes pour l&#39;analyse nécessitent des soins et de l&#39;effort de ces dosages à travailler. Pour assurer une approche simple et complémentaires pour les études du développement cortical début, nous avons modifié l&#39;approche d&#39;une tranche existante de 13 à faciliter les études du développement cortical précoce. Nous avons développé un whmodèle ole explant hémisphère semblable à un modèle existant E14 hémisphère qui a impliqué cultures secousses à 65 rotations par minute et permet la croissance organotypique pour 16-18 heures 22,23. Dans notre approche, les explants hémisphère entières sont placées sur membrane semi-perméable 13 avec la culture, dans une atmosphère d&#39;oxygène à haute 21,24 organotypique de prolonger la croissance corticale pendant 48 heures. Cette approche permet également d&#39;électroporation cohérente de développement des neurones corticaux. Les embryons sont retirés de l&#39;utérus et une électroporation pour introduire l&#39;ADN plasmidique et le télencéphale est ensuite découpé. Chaque hémisphère est isolé et placé côté médial vers le bas sur un filtre revêtu de collagène. L&#39;explant est ensuite mis en culture pour une période de 48 heures, une période qui englobe 8 fractionnement preplate. Au cours de la période de culture, les neurones L6 développer à partir de précurseur de neurone différencié 25, correctement positionnée à l&#39;intérieur de la plaque corticale. Tout au long de cette période, le développement deneurone est entouré par l&#39;ECM approprié et des types de cellules qui face la cellule correspondant in vivo. Ce système a déjà avéré utile pour déchiffrer les événements cellulaires qui sous-tendent toxicité de l&#39;éthanol 26, couche 6 formation et diviser preplate 7,25.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

Développement cortical implique des interactions complexes entre les neurones et les non-neuronales, y compris des éléments précurseurs de cellules, des vaisseaux sanguins, les méninges et associé matrice extracellulaire. Parce qu&#39;ils fournissent un environnement propice organotypique, les explants tranches corticales sont souvent utilisées pour étudier ces interactions qui contrôlent la différenciation neuronale et le développement. Bien que bénéfiques, le modèle d&#39;explant tranche peuvent souffrir d&#39;inconvénients, y compris stratification cellulaire aberrante et la migration. Nous rapportons ici l&#39;ensemble du système cérébral explant hémisphère pour les études du développement cortical précoce qui est plus facile à préparer que les tranches de cortex et spectacles cohérente de migration organotypique et le laminage. Dans ce système modèle, la stratification précoce et les schémas de migration se dérouler normalement pour une période de deux jours in vitro, y compris la période de séparation preplate, au cours de laquelle prospective couche corticale six formes. Nous avons ensuite développé une électroporation ex utero (EUEP)approche qui connaît un succès ~ 80% dans le ciblage expression de la GFP pour les neurones en développement dans le cortex dorsal médial. Le modèle hémisphère explant rend développement précoce corticale accessibles pour l&#39;électroporation, une intervention pharmacologique et des approches d&#39;imagerie en direct. Cette méthode permet d&#39;éviter la chirurgie de survie nécessaire d&#39;électroporation in utero (IUEP) des approches tout en améliorant à la fois la transfection et la cohérence de surface de ciblage. Cette méthode facilitera les études expérimentales de la prolifération, la migration neuronale et de la différenciation.

Le rongeur embryonnaire cortex présente un gradient de neurogénétique transversale tout au long de la période de développement, tels que le néocortex latéral est d&#39;environ 1 jour plus mature que dorsale médiale néocortex 28. Le nombre de neurones couche 6 est ainsi généré (c&#39;est à dire présenter leur dernière phase S) sur E12 dans le cortex latéral (également appelé champ 40 5) et à E13 dans le cortex médial dorsale (également appelé champ 1 5). Fra...

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Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ce protocole décrit une procédure d&#39;explantation amélioré qui implique<em&gt; Ex utero</em&gt; Électroporation, la dissection et la culture de tout hémisphères cérébraux de l&#39;embryon de souris. La préparation facilite les études pharmacologiques et des essais de la fonction des gènes au cours du développement cortical précoce.

Ex utero électroporation et explants hémisphère: Une méthode simple expérimental pour les études du développement cortical précoce

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

12.8K vues.  SUNY Upstate Medical University. Ce protocole décrit une procédure d'explantation amélioré qui implique Ex utero Électroporation, la dissection et la culture de tout hémisphères cérébraux de l'embryon de souris. La préparation facilite les études pharmacologiques et des essais de la fonction des gènes au cours du développement cortical précoce.

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In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero électroporation suivie par la culture neuronale primaire pour étudier la fonction des gènes dans un sous-ensemble des neurones corticaux

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Recherche

Neurosciences

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Souris dans Utero électroporation: contrôlé Transefection Gene spatio-temporelle

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisation et la manipulation génétique des dendrites et des épines dans le cortex cérébral et l&#39;hippocampe de souris à l&#39;aide<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Génération de rats transgéniques par voie topique<em&gt; In utero</em&gt; L&#39;électroporation et<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescence dépistage

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF differentiates from the amniotic fluid upon closure of the anterior neural tube. CSF volume then increases over subsequent days as the neuroepithelial progenitor cells lining the ventricles and the choroid plexus generate CSF. The embryonic CSF contacts the apical, ventricular surface of the neural stem cells of the developing brain and spinal cord. CSF provides crucial fluid pressure for the expansion of the developing brain and distributes important growth promoting factors to neural progenitor cells in a temporally-specific manner. To investigate the function of the CSF, it is important to isolate pure samples of embryonic CSF without contamination from blood or the developing telencephalic tissue. Here, we describe a technique to isolate relatively pure samples of ventricular embryonic CSF that can be used for a wide range of experimental assays including mass spectrometry, protein electrophoresis, and cell and primary explant culture. We demonstrate how to dissect and culture cortical explants on porous polycarbonate membranes in order to grow developing cortical tissue with reduced volumes of media or CSF. With this method, experiments can be performed using CSF from varying ages or conditions to investigate the biological activity of the CSF proteome on target cells.

The ventricular cerebrospinal fluid (CSF) bathes the neuroepithelial and cerebral cortical progenitor cells during early brain development in the embryo. Here we describe the method developed to isolate ventricular CSF from rodent embryos of different ages in order to investigate its biological function. In addition, we demonstrate our cerebral cortical explant dissection and culture technique that allows for explant growth with minimal volumes of culture medium or CSF.

Isolement du liquide céphalo-rachidien à partir d&#39;embryons de rongeurs pour une utilisation avec des explants cérébraux corticaux disséqué

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Sous-sélective électroporation corticaux Interneurones

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

Une stratégie novatrice alliant CGH-Array, séquençage de l’exome-ensemble et électroporation de In Utero chez les rongeurs afin d’identifier les gènes pour les Malformations du cerveau

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

In Utero électroporation approches pour étudier l&#39;excitabilité des neurones sous - populations et connectivité unicellulaire

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

Méthode électrophysiologique pour les enregistrements de la pince à tension intégrale à partir de<em&gt; Drosophila</em&gt; Photorécepteurs

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

Imagerie confocale à haute résolution de la barrière hémato - encéphalique : imagerie, Reconstruction 3D et la Quantification de la transcytose

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...