Les figures 1, 2, 3, 4, 6, 8 et Tableaux 2, 3, 10, 15, 16 sont modifiés à partir de 29 Réf. Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation (NSF-CCF accorder 1.117.143 et 1.162.141 NSF-CCF à GS). Y.-JC a été soutenu par des bourses du gouvernement taiwanais. DTS a été soutenu par le Programme National Science Foundation Graduate Research Fellowship (de GRFP).

<ol>
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The authors declare no competing financial interests.

Ce document décrit une méthode pour dériver portes ndsDNA d&#39;ADN plasmidique très pur. En outre, un protocole est présentée pour caractériser la performance de porte en utilisant un essai de cinétique de fluorescence. Les données expérimentales montrent que le système de plasmide dérivé surpasse son homologue synthétique même si le système de synthèse est assemblé à partir des brins purifiés en utilisant une électrophorèse sur gel de Polyacrylamide (PAGE). Probablement, l&#39;amélioration de la performance des portes dérivées du plasmide est principalement due à la très haute pureté de l&#39;ADN biologique. ADN synthétique contient un certain nombre d&#39;erreurs, en particulier des deletions qui se traduisent par des oligonucleotides d&#39;une longueur de tels produits secondaires n-1, et ne sont généralement pas complètement éliminé PAGE ou Chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) des procédures de purification. Des améliorations similaires à ceux rapportés ici ont également été observées dans une étude précédente d&#39;un amplificateur en épingle à cheveux catalysée qui a utilisé de l&#39;ADN provenant de sources biologiques 21. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Cependant, même l&#39;utilisation de portes dérivées du plasmide ne peut pas éliminer totalement les erreurs dans l&#39;exécution de la porte, pour lesquels il existe au moins deux raisons: d&#39;abord plus de digestion ou le manque de précision de coupe peut conduire à des portes avec un trop grand nombre entailles ou des entailles dans les mauvaises positions. Dans les deux cas, les portes sont plus susceptibles de participer à des réactions indésirables. Ces problèmes peuvent être assouplies en optimisant la quantité d&#39;enzyme utilisée (voir la figure 4). D&#39;autre part, dans ces expériences, la plupart des entrées auxiliaires et des brins de l&#39;ADN synthétique et sont donc contenues deletions et mutations. En principe, toutes les entrées et simple brin des brins auxiliaires peuvent également être obtenus à partir d&#39;ADN de phagemide à travers une digestion enzymatique coupure simple brin du génome viral m13 pré-codé 26. Peut-être que la performance du circuit peut être encore améliorée en utilisant ADNsb dérivé du génome bactérien. Bien que l&#39;utilisation de portes de plasmides dérivés n&#39;a été trouvée pour améliorer les performances du circuit, une analysedes temps de coût et de traitement a révélé que, bien que la production de portes de plasmide dérivé est légèrement meilleur marché (tableau 15), il prend 2-3 fois plus long temps de traitement par rapport à l&#39;assemblage et la purification des portes de oligos de synthèse dans le commerce (tableau 16). Les coûts primaires de portes de plasmides sont dérivés du gène de synthèse et l&#39;utilisation d&#39;enzymes de restriction. Pour 300 pmol de portes (suffisant pour 15 réactions à 30 nM), le coût estimé pour Rejoignez portes est d&#39;environ 170 $ et 200 $ pour Fork portes, la différence de coût étant due à l&#39;utilisation de différentes enzymes entailler. En revanche, la synthèse chimique des brins pour les mêmes coûts de grille autour de 260 $ y compris un supplément de purification PAGE. Le coût principal de l&#39;heure pour les portes dérivées du plasmide est dans la procédure de clonage, qui, tout comme la synthèse d&#39;ADN, peut être confiée à une société de synthèse de gènes. Cependant, une fois assemblées, les portes de plasmides dérivés présentent l&#39;avantage que les plasmides hôtes peuvent facilement être reproduits une peut être stocké sous forme de stocks de glycérol bactériennes. Cela permet de réutiliser les portes à plusieurs reprises. Pour l&#39;avenir, l&#39;amélioration de la performance des portes dérivées du plasmide pourrait permettre à un plus grand éventail de comportements dynamiques que d&#39;avoir été démontré expérimentalement à ce jour avec l&#39;ADN RRC. Par exemple, la récente 47,48 de travail théorique a suggéré que la répartition spatiale auto-organisés à la macro-échelle peuvent être réalisées avec les ADN RRC à travers un mécanisme de diffusion de réaction. La méthode présentée ici fournit un chemin viable pour la construction des composants moléculaires sous-jacents de ces matériaux d&#39;ADN auto-structuration. Bien que difficile, le développement de morphologies macro-échelle d&#39;une manière programmable aurait des implications importantes dans des domaines allant de la recherche sur les biomatériaux à la médecine régénératrice.

La prévisibilité de Watson-Crick a permis l&#39;ADN dynamique nanotechnologie à émerger comme un moyen programmable de concevoir des dispositifs moléculaires avec des propriétés dynamiques 1,2. En particulier, le déplacement de brin d&#39;ADN -, une réaction d&#39;hybridation compétitive programmable - est révélée être un mécanisme puissant pour l&#39;ingénierie des systèmes d&#39;ADN dynamiques. Dans une réaction de déplacement de brin d&#39;ADN, un oligonucléotide entrant déplace une &quot;sortie&quot; brin précédemment lié à un partenaire de liaison complémentaire. Plusieurs de ces réactions peuvent être enchaînés en plusieurs étapes cascades de réactions avec un degré élevé de contrôle sur l&#39;ordre et le moment de réaction individuelle étapes 3. ADN cascades de déplacement de brin ont été utilisées pour créer des circuits numériques et analogiques moléculaires 4-7, 8-10 nanostructures commutables, moteurs moléculaires autonomes 11-15, et amplificateurs catalytiques non-covalentes 13,16-21. En outre, DNA dispositifs utilisant des réactions de déplacement de brin peuvent être simulés et conçus pour des applications diverses en utilisant un logiciel de conception assistée par ordinateur 22-24. Actuellement, l&#39;ADN synthétisé chimiquement sert comme matériau principal pour nanotechnologie de l&#39;ADN. Toutefois, des erreurs dans le processus de synthèse de l&#39;ADN, et les oligonucléotides imparfaits qui en résultent, sont soupçonnés de limiter la performance des dispositifs dynamiques d&#39;ADN en provoquant des réactions erronées secondaires. Par exemple, des réactions «fuite» peuvent donner lieu à la libération d&#39;un oligonucléotide de sortie même en l&#39;absence d&#39;un déclencheur de réaction. Ces effets sont plus évidents dans cascades de réactions autocatalytiques où même une quantité minimale de fuite initial finira par conduire à la pleine activation de la cascade de 19,20. Inversement, les réactions ne parviennent souvent pas à atteindre le niveau attendu de l&#39;activation parce que certains composants ne déclenchent pas, même en présence de l&#39;entrée prévue de 7,25. Base d&#39;ADN pour faire la performance denanodispositifs comparables à leurs homologues biologiques à base de protéines, ces modes d&#39;erreur doivent être considérablement réduit. Plasmides bactériens ou autre ADN biologique pourraient servir de source relativement pas cher de l&#39;ADN de haute pureté pour les applications de la nanotechnologie. De grandes quantités d&#39;ADN peuvent être générés par la réplication dans les bactéries et les capacités intrinsèques de relecture des systèmes vivants assurer la pureté de l&#39;ADN résultant. En fait, plusieurs études récentes ont reconnu l&#39;utilité potentielle de l&#39;ADN biologique pour les applications des nanotechnologies 21,26-28. Cependant, la nature entièrement double brin de l&#39;ADN plasmidique a jusqu&#39;ici interdit son utilisation en tant que matériau pour la fabrication de dispositifs dynamiques de l&#39;ADN, qui se composent généralement de plusieurs oligonucleotides et contiennent à la fois des domaines double brin et simple brin. Dans un récent article 29 de cette question a été abordée et une nouvelle architecture de la porte d&#39;ADN qui se compose principalement de l&#39;ADN double brin entaillé (ndsDNA) était d&#39;introduireré. Surtout, systèmes de portes ndsDNA peuvent être conçus qui réalisent la dynamique spécifiées par tout réseau de réaction chimique formelle (CRN) 29. portes ndsDNA pourraient ainsi être utilisés, en principe, de créer des systèmes dynamiques qui présentent des oscillations et le chaos, bistabilité et de la mémoire, la logique booléenne ou comportements algorithmiques 30-38. Par exemple, Réf. 29 ont démontré une CRN trois réaction qui a fourni une mise en œuvre d&#39;un protocole moléculaire &quot;de consensus&quot;, un type d&#39;algorithme de calcul distribué 29,39,40. Ce travail d&#39;abord démontré une nouvelle utilisation pour le formalisme CRN comme un &quot;langage de programmation&quot; pour synthétiser rapidement les systèmes moléculaires fonctionnels (figure 1A). Ici, un protocole détaillé pour dériver portes ndsDNA de l&#39;ADN de plasmide est fourni. Le premier est un examen du processus de conception de la séquence. Puis suit une explication de la façon dont oligonucléotides synthétiques contenantles séquences de grille sont clonées dans des plasmides et la séquence vérifiées et amplifiés par culture bactérienne. Ensuite, il est montré comment ndsDNA portes peuvent être obtenues à partir des plasmides par traitement enzymatique (voir la figure 2). Enfin, un procédé pour tester le comportement de grille en utilisant les dosages cinétiques de fluorescence est décrite. Mécanisme réaction A titre d&#39;exemple, le protocole met l&#39;accent sur ​​la réaction chimique catalytique A + B-&gt; B + C. Les espèces A, B, et («signaux», figure 1B) C correspondent toutes à une autre molécule d&#39;ADN simple brin. Les séquences de ces molécules sont totalement indépendants et les brins ne réagissent pas directement avec l&#39;autre. Les séquences de tous les signaux ont deux domaines fonctionnels différents, à savoir, séquences qui agissent ensemble dans des réactions de déplacement de brins: 1) un domaine de prendre pied court (étiquettes TA, TB, TC) qui est utilisé pour l&#39;initiation de déplacement de brin reaction, et 2) un domaine de temps (étiquettes a, b, c) qui détermine l&#39;identité du signal. Interactions entre les brins de signaux sont médiés par ADN (ndsDNA) complexes de porte à double brin entaillés (appelé jointure AB et Fork BC) et les espèces simple brin auxiliaires (&lt;tr r&gt;, &lt;b tr&gt;, &lt;c tb&gt; et &lt;i tc &gt;). La réaction A + B- formel&gt; B + C est exécutée par une série d&#39;étapes de réaction de déplacement de brin, où chaque étape de réaction expose un pied pour une réaction ultérieure (figure 1B). Dans cet exemple, les signaux A et B sont d&#39;abord libre en solution tandis que le signal C est lié à la grille fourche. A la fin de la réaction B et C sont en solution. Plus généralement, les signaux qui sont liés à une porte sont inactifs alors que les signaux qui sont libres en solution sont actifs, ce qui signifie qu&#39;ils peuvent participer à une réaction de déplacement de brin queune entrée. L&#39;évolution dans le temps de la réaction est suivi en utilisant une stratégie de rapporteur fluorescent (figure 1C). 29 Dans des travaux antérieurs, il a été démontré que ce mécanisme de réaction ne réalise pas la stoechiométrie correcte mais également la cinétique de la réaction visée.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0531S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PvuII-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3151L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PstI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3140S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth, Modified</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0918-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Hispeed Maxi-prep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nb.BsrDI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0648L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nt.BstNBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0607L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-stranded Genomic Blocks</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horiba Jobin-Yvon Spex Fluorolog-3 Fluorimeter</td>
			<td>Horiba/Jobin Yvon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Quartz Cells&#160;</td>
			<td>Starna</td>
			<td>23-5.45-S0G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Backbones</td>
			<td>BioBrick</td>
			<td>E0240-pSB1A2</td>
			<td>High copy number plasmid with Ampicillin resistance. Sequence can be found from http://parts.igem.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plasmid-derived dna strand displacement gates for implementing chemical reaction networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high fidelity, is readily amplified through bacterial culture and can be stored indefinitely in the form of bacterial glycerol stocks. However, the double-stranded nature of plasmid DNA has so far hindered its efficient use for construction of DNA nanostructures or devices that typically contain single-stranded or branched domains. In recent work, it was found that nicked double stranded DNA (ndsDNA) strand displacement gates could be sourced from plasmid DNA. The following is a protocol that details how these ndsDNA gates can be efficiently encoded in plasmids and can be derived from the plasmids through a small number of enzymatic processing steps. Also given is a protocol for testing ndsDNA gates using fluorescence kinetics measurements. NdsDNA gates can be used to implement arbitrary chemical reaction networks (CRNs) and thus provide a pathway towards the use of the CRN formalism as a prescriptive molecular programming language. To demonstrate this technology, a multi-step reaction cascade with catalytic kinetics is constructed. Further it is shown that plasmid-derived components perform better than identical components assembled from synthetic DNA.

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Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language.

Plasmide dérivé d&#39;ADN Strand Displacement Gates Réseaux de réaction d&#39;exécution chimiques

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

plasmid-derived-dna-strand-displacement-gates-for-implementing

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K vues.  University of Washington. This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language. 