As Figuras 1, 2, 3, 4, 6, 8 e quadros 2, 3, 10, 15, 16 são modificados a partir de 29 Ref. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (NSF conceder-CCF 1117143 e NSF-CCF 1.162.141 para GS). Y.-JC foi apoiado por bolsas de estudo governamentais de Taiwan. SDR foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciência Programa de Pós-Graduação Research Fellowship (GRFP).

<ol>
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The authors declare no competing financial interests.

Este artigo descreve um método para derivar portões ndsDNA a partir de DNA de plasmídeo muito puro. Além disso, um protocolo é apresentada para caracterizar o desempenho portão utilizando um ensaio de cinética de fluorescência. Os dados experimentais mostram que o sistema de plasmídeo derivado de supera sua contraparte sintética, mesmo se o sistema sintético é montado a partir de fios purificado utilizando electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). Provavelmente, o melhor desempenho de portas derivado do plasmídeo é principalmente devido à muito alta pureza do DNA biológico. ADN sintético contém uma variedade de erros, em particular, deleções que resultam em oligonucleótidos de tais produtos secundários comprimento n-1, e são tipicamente não completamente removido em PAGE ou cromatograf ia líquida de alta eficiência (HPLC) procedimentos de purificação. Também foram observadas melhorias semelhantes aos aqui relatados em um estudo prévio de um amplificador hairpin catalisada que usou DNA derivado de fontes biológicas 21. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; No entanto, mesmo o uso de portas derivado do plasmídeo não pode eliminar completamente os erros no desempenho portão, para as quais existem pelo menos duas razões: em primeiro lugar sobre-digestão ou falta de precisão de corte pode levar a portões com demasiados nicks ou cortes nas posições erradas. Em qualquer caso, as portas são mais susceptíveis de participar em reacções indesejadas. Tais problemas podem ser facilitado através da optimização da quantidade de enzima utilizada (ver Figura 4). Em segundo lugar, nestas experiências, a maioria das entradas e cordões eram auxiliares de ADN sintético e continha assim as supressões e mutações. Em princípio, todas as entradas de cadeia simples e fios auxiliares também poderia ser obtido a partir de ADN de fagemideo por meio de uma digestão com enzimas de nicking do genoma viral M13 pré-codificada 26. Talvez o desempenho do circuito pode ser melhorado utilizando ADNcs derivados do genoma bacteriano. Enquanto o uso de portões derivado de plasmídeo foi encontrada para melhorar o desempenho do circuito, uma análisedos tempos de processamento e custos revelou que, enquanto a produção de portas derivado de plasmídeo é ligeiramente mais barato (Tabela 15), leva-se 2-3 vezes mais em comparação com o tempo de processamento e a purificação da montagem de portas de oligos sintetizados comercialmente (Tabela 16). Os custos primários de portões são derivados do plasmídeo síntese de genes e a utilização de enzimas de restrição. Para 300 pmol de portas (suficiente para 15 reacções em 30 nM), o custo estimado para Junte-se portas é de aproximadamente US $ 170 e US $ 200 para Fork portões, a diferença de custo ser devido ao uso de diferentes enzimas nicking. Em contraste, a síntese química dos fios para os mesmos custos de porta em torno $ 260, incluindo uma taxa de purificação PAGE. O custo do tempo primário para portas derivado do plasmídeo é no procedimento de clonagem, que, assim como a síntese de DNA, pode ser terceirizado para uma empresa de síntese de genes. No entanto, uma vez montado, portas derivado do plasmídeo tem a vantagem de que os plasmídeos hospedeiros podem ser facilmente replicadas de umaND pode ser armazenado na forma de estoques de glicerol bacterianas. Isto faz com que seja possível voltar a utilizar os portões muitas vezes. Olhando para a frente, o melhor desempenho de portas derivado do plasmídeo poderia permitir uma gama muito maior de dinâmica de comportamentos que têm sido experimentalmente demonstrado até agora com DNA CRNs. Por exemplo, recente trabalho teórico 47,48 sugeriu que padrões espaciais auto-organizadas na macro-escala podem ser realizados com DNA CRNs através de um mecanismo de difusão reação. O método aqui apresentado fornece um caminho viável para a construção de componentes moleculares subjacentes a tais materiais de DNA auto-padronização. Apesar de desafiador, desenvolvendo morfologias macro-escala de uma forma programável teria implicações significativas em áreas que vão desde pesquisas em biomateriais para a medicina regenerativa.

A previsibilidade de bases de Watson-Crick tem permitido nanotecnologia de DNA dinâmico a emergir como uma forma programável para projetar dispositivos moleculares com propriedades dinâmicas 1,2. Em particular, o deslocamento cadeia de DNA -, uma reação de hibridização competitiva programável - provou ser um poderoso mecanismo de engenharia de sistemas dinâmicos de DNA. Em uma reação de deslocamento de cadeia de DNA, um oligonucleï¿½ido de entrada desloca um &quot;output&quot; vertente anteriormente vinculado a partir de um parceiro de ligação complementar. Várias tais reações podem ser encadeados em cascatas de reação de várias etapas com um alto grau de controle sobre a ordem eo tempo de reação individual etapas 3. DNA cascatas de deslocamento de cadeia foram usadas para criar circuitos digitais e analógicos moleculares 4-7, nanoestruturas comutáveis ​​8-10, motores moleculares autónomas 11-15, e amplificadores catalíticos não covalentes 13,16-21. Além disso, DNA dispositivos que utilizam reações de deslocamento de cadeia pode ser simulado e projetado para diversas aplicações utilizando software 22-24 desenho assistido por computador. Atualmente, o DNA sintetizado quimicamente serve como o principal material para a nanotecnologia de DNA. No entanto, os erros no processo de síntese de DNA, e os oligonucleótidos imperfeitos resultantes, são acreditados para limitar o desempenho de dispositivos de ADN dinâmicas, fazendo com que as reacções laterais erradas. Por exemplo, as reacções de &quot;vazamento&quot; pode resultar na libertação de um oligonucleótido de saída, mesmo na ausência de uma reacção de disparo. Tais efeitos são mais óbvias nas cascatas de reacção autocatalítica onde mesmo uma quantidade mínima de vazamento inicial irá eventualmente resultar na activação completa da cascata 19,20. Por outro lado, as reacções muitas vezes não conseguem alcançar o nível esperado de activação porque alguns componentes não provocam, mesmo na presença de 7,25 a entrada pretendida. Para fazer com que o desempenho de DNA com base emnanodispositivos comparáveis ​​com os seus homólogos à base de proteínas biológicas, tais modos de erro precisa ser reduzido drasticamente. Plasmídeos bacterianos ou outro ADN biológica pode servir como uma fonte de ADN altamente puro relativamente barato para aplicações de nanotecnologia. Grandes quantidades de ADN pode ser gerado por replicação em bactérias e as capacidades inerentes de revisão dos sistemas vivos garantir a pureza do ADN resultante. De fato, vários trabalhos recentes têm reconhecido a utilidade potencial de DNA biológico para aplicações de nanotecnologia 21,26-28. No entanto, a natureza totalmente de cadeia dupla de DNA de plasmídeo foi medida proibida a sua utilização como um material para a fabricação de dispositivos de ADN dinâmicas, que consistem tipicamente de vários oligonucleótidos e contêm ambos os domínios de cadeia dupla e de cadeia simples. Em um recente artigo 29 esta questão foi abordada e uma nova arquitetura portão DNA que consiste principalmente de DNA de cadeia dupla entalhado (ndsDNA) foi introduzird. É importante ressaltar que os sistemas de portões ndsDNA pode ser concebido que perceber a dinâmica especificados por qualquer rede de reação química formais (CRN) 29. portões ndsDNA poderia, assim, ser utilizados, em princípio, para criar sistemas dinâmicos que apresentam oscilações e caos, biestabilidade e memória, lógica booleana ou comportamentos algorítmicos 30-38. Por exemplo, Ref. 29 demonstraram uma CRN três reacção que fornecida uma implementação molecular de um protocolo de &quot;consenso&quot;, um tipo de algoritmo de computação distribuída 29,39,40. Este trabalho demonstrou pela primeira vez uma nova utilização para o formalismo CRN como uma &quot;linguagem de programação&quot; para sintetizar rapidamente sistemas moleculares funcionais (Figura 1A). Aqui, um protocolo detalhado para derivar portões ndsDNA de ADN de plasmídeo é fornecida. Primeiro é uma revisão do processo de concepção sequência. Depois segue-se uma explicação de como oligonucleótidos sintéticos que contêmas sequências de porta são clonados em plasmídeos e sequência verificada e amplificado através de cultura bacteriana. Em seguida, é mostrado como ndsDNA portas podem ser derivados a partir dos plasmídeos por tratamento enzimático (ver Figura 2). Por fim, um método para testar o comportamento portão usando a cinética de fluorescência os ensaios é descrita. Mecanismo de reacção Como um exemplo, o protocolo centra-se na reacção química catalítica de A + B&gt; B + C. As espécies de A, B, e C (&quot;sinais&quot;, Figura 1B) correspondem todas a uma molécula diferente de cadeia simples de ADN. As sequências destas moléculas são completamente independentes e os fios não reagem um com o outro directamente. As sequências de todos os sinais têm dois domínios funcionais diferentes, ou seja, subsequências que agem em conjunto em reacções de deslocamento de cadeia: 1) um ponto de apoio de domínio curto (etiquetas TA, TB, TC) que é usado para a iniciação da cadeia deslocamento reaction, e 2) um domínio longo (etiquetas a, b, c) que determina a identidade do sinal. Interações entre fios de sinal são mediados por ADN (ndsDNA) Complexos de porta de cadeia dupla com entalhe (chamados Adira AB e Fork BC) e as espécies de cadeia simples auxiliares (&lt;tr r&gt;, &lt;b tr&gt;, &lt;c tb&gt; e &lt;i tc &gt;). A reacção de formal de A + B&gt; B + C é executada através de uma série de passos de reacção de deslocamento de cadeia, em que cada passo reaccional expõe um ponto de apoio para uma reacção subsequente (Figura 1B). Neste exemplo, os sinais A e B são inicialmente livre em solução enquanto o sinal de C está ligado ao portão forquilha. No final da reacção, B e C estão em solução. De modo mais geral, os sinais que estão vinculados a um portão estão inativos, enquanto os sinais que são livres em solução são ativos, isto é, eles podem participar de uma reação de deslocamento de cadeia comouma entrada. O curso do tempo da reacção é seguido usando uma estratégia repórter fluorescente (Figura 1C). Em trabalho anterior 29, demonstrou-se que este mecanismo de reacção, não só realiza a estequiometria correcta, mas também a cinética da reacção alvo.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0531S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PvuII-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3151L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PstI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3140S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth, Modified</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0918-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Hispeed Maxi-prep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nb.BsrDI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0648L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nt.BstNBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0607L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-stranded Genomic Blocks</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horiba Jobin-Yvon Spex Fluorolog-3 Fluorimeter</td>
			<td>Horiba/Jobin Yvon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Quartz Cells&#160;</td>
			<td>Starna</td>
			<td>23-5.45-S0G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Backbones</td>
			<td>BioBrick</td>
			<td>E0240-pSB1A2</td>
			<td>High copy number plasmid with Ampicillin resistance. Sequence can be found from http://parts.igem.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plasmid-derived dna strand displacement gates for implementing chemical reaction networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high fidelity, is readily amplified through bacterial culture and can be stored indefinitely in the form of bacterial glycerol stocks. However, the double-stranded nature of plasmid DNA has so far hindered its efficient use for construction of DNA nanostructures or devices that typically contain single-stranded or branched domains. In recent work, it was found that nicked double stranded DNA (ndsDNA) strand displacement gates could be sourced from plasmid DNA. The following is a protocol that details how these ndsDNA gates can be efficiently encoded in plasmids and can be derived from the plasmids through a small number of enzymatic processing steps. Also given is a protocol for testing ndsDNA gates using fluorescence kinetics measurements. NdsDNA gates can be used to implement arbitrary chemical reaction networks (CRNs) and thus provide a pathway towards the use of the CRN formalism as a prescriptive molecular programming language. To demonstrate this technology, a multi-step reaction cascade with catalytic kinetics is constructed. Further it is shown that plasmid-derived components perform better than identical components assembled from synthetic DNA.

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Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language.

Strand DNA Deslocamento Portas para redes de reação de Execução químicos derivados do plasmídeo

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.0K visualizações.  University of Washington. This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language. 