図1、2、3、4、6、8及び表2、3、10、15、16は、参考文献29から変更されています。この作品は、国立科学財団（NSF-GSにCCF 1117143およびNSF-CCF 1162141を付与する）によってサポートされていました。 Y.-JCは、台湾政府のフェローシップによってサポートされていました。 SDRは、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラム（GRFP）によってサポートされていました。

<ol>
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The authors declare no competing financial interests.

本論文では、高純度のプラスミドDNAからndsDNAゲートを導出するための方法を説明します。また、プロトコルは、蛍光動力学アッセイを用いて、ゲート性能を特徴付けるために提示されています。実験データは、プラスミド由来の系、合成系は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を用いて精製したストランドから組み立てられていても、その合成対応物よりも優れていることを示しています。多分、プラスミド由来のゲートの性能の改善は、主に生物学的DNAの非常に高純度に起因するものです。合成DNAは、さまざまなエラーが含まれ、特に、長さN-1のオリゴヌクレオチド、およびそのような副生成物を生じる欠失は、典型的には、完全PAGEまたは高速液体クロマトグラフィー（HPLC）精製手順で除去されません。ここで報告されたものと同様の改善はまた、生物学的供給源21に由来するDNAを使用した触媒ヘアピン増幅器の以前の研究で観察されました。 <p clお尻= &quot;jove_content&quot;&gt;しかし、プラスミド由来のゲートを用いても、完全に少なくとも2つの理由がありますするためのゲート性能のエラー、排除することはできません。あまりにも多くてゲートにつながることができ、最初の過消化またはカット精度の欠如を間違った位置にニックまたはニック。いずれの場合においても、ゲートが望ましくない反応に関与する可能性が高いです。このような問題は、（ 図4を参照）を使用する酵素の量を最適化することにより緩和することができます。第二に、これらの実験では、ほとんどの入力および補助鎖合成DNAであり、したがって、欠失および変異を含みました。原則として、すべての一本鎖入力と補助鎖はまた、事前符号化M13ウイルスゲノム26のニッキング酵素消化を介してファージミドDNAから得ることができます。おそらく回路性能は、さらに、細菌ゲノムに由来​​する一本鎖DNAを用いて改善することができます。 プラスミド由来のゲートの使用は、回路性能を改善することが見出されたが、分析コストや処理時間のプラスミド由来のゲートの製造がやや安い（ 表15）であるが、それは商業的に合成されたオリゴ（ 表16）からゲートのアセンブリおよび精製に比べて2~3倍長い処理時間を要することが明らかになりました。プラスミド由来のゲートの主要コストは、遺伝子合成、制限酵素の使用です。 （30 nmで15の反応のために十分な）ゲートの300ピコモルのために、参加ゲートの推定コストはフォークゲート、違いによるニッキング酵素の使用にいるコストの差は約$ 170と$ 200です。これとは対照的に、PAGE精製料込み$ 260の周りに同じゲー​​ト費用鎖の化学合成。プラスミド由来のゲートのための主要な時間コストは、単にDNA合成と同様に、遺伝子合成会社に委託することができ、クローニング手順、です。しかし、一旦組み立て、プラスミド由来のゲートは、宿主プラスミドを容易に複製することができるという利点を有しますND細菌のグリセロールストックの形で保存することができます。これは、上にゲートを何度も再利用することができます。 楽しみにして、プラスミド由来のゲートの改良された性能を実験的にDNA CRNsで、これまでに実証されているよりも、力学挙動のはるかに大きな範囲を可能にすることができます。例えば、最近の理論的研究47,48は、マクロスケールでの自己組織化の空間パターンは、反応拡散機構を介してDNA CRNsで実現することができることを示唆しました。ここで紹介する方法は、自己パターニングDNA材料の基礎となる分子成分を構築するための実行可能なパスを提供します。挑戦が、プログラム可能な方法で、マクロスケールの形態を開発するバイオマテリアルの研究から再生医療に至るまでの分野で重要な意味を持っているでしょう。

ワトソン-クリック塩基対の予測可能性は、動的なDNAのナノテクノロジーは、動的特性1,2と分子デバイスを設計するためのプログラム可能な方法として出現することができました。特に、DNA鎖置換 - プログラム可能な、競合ハイブリダイゼーション反応は - 動的DNAシステムを操作するための強力な機構であることが判明しました。 DNAの鎖置換反応では、入ってくるオリゴヌクレオチドは、相補的結合パートナーか​​らの以前に結合した「出力」鎖を置換します。複数のそのような反応は、個々の反応3ステップの順序やタイミングを制御度の高い多段階反応カスケードに一緒に連鎖させることができます。 DNA鎖変位カスケードは4-7、切り替え可能なナノ構造体8-10、自律分子モーター11-15、および非共有結合触媒アンプ13,16-21デジタルとアナログの分子回路を生成するために使用されています。また、D鎖置換反応を用いてNAデバイスをシミュレートし、コンピュータ支援設計ソフトウェア22-24を使用して 、多様な用途のために設計することができます。 現在、化学的に合成されたDNAは、DNAナノテクノロジーのための主材料として機能します。しかし、DNA合成プロセスにおけるエラー、そして得られた不完全なオリゴヌクレオチドは、誤った副反応を引き起こすことにより、動的DNAデバイスの性能を制限すると考えられています。例えば、「リーク」反応も反応トリガーの非存在下での出力オリゴヌクレオチドの放出をもたらすことができます。このような効果は、最初のリークであっても最小限の量は、最終的にカスケード19,20の完全な活性化につながる自己触媒反応のカスケードに最も明白です。一部のコンポーネントが意図した入力7,25の存在下でさえも誘発しないので逆に、反応はしばしば活性化の期待されるレベルに到達することができません。 DNAベースの性能を作成するにはそれらの生物学的なタンパク質ベースの対応物に匹敵するナノデバイスは、エラーモードが劇的に低減する必要があります。 細菌プラスミドまたは他の生物学的DNAは、ナノテクノロジーのアプリケーションのための高純度のDNAの比較的安価な供給源として働く可能性があります。 DNAの大量の細菌中で複製することにより生成することができ、生物系の固有の校正能力は、得られたDNAの純度を確保します。実際には、いくつかの最近の論文は、ナノテクノロジーのアプリケーション21,26-28のための生物学的DNAの潜在的な有用性を認識しています。しかしながら、プラスミドDNAの完全に二本鎖の性質は、これまで一般的に複数のオリゴヌクレオチドからなり、二本鎖および一本鎖ドメインの両方を含む動的DNAデバイスを製造するための材料としての使用を禁止しています。最近の論文29この問題が対処された、主にニックの入った二本鎖DNA（ndsDNA）で構成されて新たなDNAのゲートアーキテクチャでは紹介しましたD。 重要なことには、ndsDNAゲートのシステムは、正式な化学反応ネットワーク（CRN）29で指定されたダイナミクスを実現するように設計することができます。 ndsDNAゲートは、このように振動とカオス、双安定性とメモリ、ブール論理またはアルゴリズムの挙動30-38を示 ​​す動的システムを作成するには、原則として、使用することができます。例えば、参考文献29は、「コンセンサス」プロトコル、分散コンピューティングアルゴリズム29,39,40のタイプの分子の実装を提供三反応CRNを示しました。この作品は、最初に急速に機能性分子システムを合成するための「プログラミング言語」（ 図1A）などのCRNの形式化のための新規な使用を実証しました。 ここでは、プラスミドDNAからndsDNAゲートを導出するための詳細なプロトコルが提供されます。最初のシーケンス設計プロセスのレビューです。そして、どのように含む合成オリゴヌクレオチドの説明を次のゲート配列は、細菌培養物を介して検証され、増幅されたプラスミドとの配列中にクローニングされます。 ndsDNAゲートは、酵素処理によりプラスミドから誘導することができる方法を次に、それが示されている（ 図2参照）。最後に、蛍光動力学アッセイを用いてゲートの動作をテストするための方法を概説します。 反応機構 例として、プロトコルは、触媒化学反応A + B-&gt; B + Cに焦点を当てています。種A、B、およびC（「シグナル」、 図1B）は、すべての異なる一本鎖DNA分子に対応します。これらの分子の配列は完全に独立しており、鎖は互いに直接反応しません。すべての信号のシーケンス、すなわち二つの異なる機能的ドメイン、鎖置換反応において一緒に作用する部分配列を有する：1）短い足掛かりドメイン（ラベル鎖置換rの開始のために使用され、TB、TC）TA信号の同一性を決定するeaction、及び2）長いドメイン（A、B、Cのラベル）。 信号鎖間の相互作用は、ニックの入った二本鎖DNA（ndsDNA）ゲート複合体（ABとフォークBCに参加呼ばれる）と補助一本鎖種（&lt;TR R&gt;、&lt;BのTR&gt;、&lt;CのTB&gt;と&lt;私のTCによって媒介されます&gt;）。正式な反応A + B-&gt; B + Cは、各反応工程は、その後の反応（ 図1B）のための足掛かりを公開鎖置換反応の一連のステップを介して実行されます。信号Cは、フォークゲートに結合している間に、この例では、信号A及びBは、最初に溶液中で遊離しています。反応BとCの終了時に溶液中にあります。より一般的には、ゲートにバインドされた信号は、溶液中で遊離している信号がアクティブな間に、つまり、彼らは鎖置換反応などに参加することができ、非アクティブです入力。反応の時間経過は、蛍光レポーター戦略（ 図1C）を使用して続いています。以前の研究29には、この反応機構は、正しい化学量論だけでなく、目的とする反応の速度を実現するだけでなく、ことが示されました。

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0531S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PvuII-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3151L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PstI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3140S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth, Modified</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0918-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Hispeed Maxi-prep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nb.BsrDI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0648L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nt.BstNBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0607L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-stranded Genomic Blocks</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horiba Jobin-Yvon Spex Fluorolog-3 Fluorimeter</td>
			<td>Horiba/Jobin Yvon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Quartz Cells&#160;</td>
			<td>Starna</td>
			<td>23-5.45-S0G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Backbones</td>
			<td>BioBrick</td>
			<td>E0240-pSB1A2</td>
			<td>High copy number plasmid with Ampicillin resistance. Sequence can be found from http://parts.igem.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plasmid-derived dna strand displacement gates for implementing chemical reaction networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high fidelity, is readily amplified through bacterial culture and can be stored indefinitely in the form of bacterial glycerol stocks. However, the double-stranded nature of plasmid DNA has so far hindered its efficient use for construction of DNA nanostructures or devices that typically contain single-stranded or branched domains. In recent work, it was found that nicked double stranded DNA (ndsDNA) strand displacement gates could be sourced from plasmid DNA. The following is a protocol that details how these ndsDNA gates can be efficiently encoded in plasmids and can be derived from the plasmids through a small number of enzymatic processing steps. Also given is a protocol for testing ndsDNA gates using fluorescence kinetics measurements. NdsDNA gates can be used to implement arbitrary chemical reaction networks (CRNs) and thus provide a pathway towards the use of the CRN formalism as a prescriptive molecular programming language. To demonstrate this technology, a multi-step reaction cascade with catalytic kinetics is constructed. Further it is shown that plasmid-derived components perform better than identical components assembled from synthetic DNA.

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Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language.

実装化学反応ネットワーク用プラスミド由来のDNA鎖置換ゲイツ

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.0K ビュー.  University of Washington. This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language. 