Figuren 1, 2, 3, 4, 6, 8 und den Tabellen 2, 3, 10, 15, 16 sind aus Lit. 29 modifiziert. Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (NSF gewähren CCF-1.117.143 und NSF-CCF 1.162.141 auf GS). Y.-JC wurde vom taiwanesischen Regierung Stipendien unterstützt. SDR wurde von der National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP) unterstützt.

<ol>
	<li>Zhang, D. Y., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+nanotechnology+using+strand-displacement+reactions.">Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions.</a> Nat. Chem. 3, 103-113 (2011).</li><li>Krishnan, Y., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+based+molecular+devices.">Nucleic acid based molecular devices.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50, 3124-3156 (2011).</li><li>Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+DNA+strand+displacement+kinetics+using+toehold+exchange.">Control of DNA strand displacement kinetics using toehold exchange.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 17303-17314 (2009).</li><li>Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+network+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades.">Neural network computation with DNA strand displacement cascades.</a> Nature. 475, 368-372 (2011).</li><li>Qian, L., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+digital+circuit+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades.">Scaling up digital circuit computation with DNA strand displacement cascades.</a> Science. 332, 1196-1201 (2011).</li><li>Zadegan, R. M., Jepsen, M. D., Hildebrandt, L. L., Birkedal, V., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+fuzzy+and+boolean+logic+gates+based+on+DNA.">Construction of a fuzzy and boolean logic gates based on DNA.</a> Small. 11, 1811-1817 (2015).</li><li>Seelig, G., Soloveichik, D., Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-free+nucleic+acid+logic+circuits.">Enzyme-free nucleic acid logic circuits.</a> Science. 314, 1585-1588 (2006).</li><li>Zadegan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+4+zeptoliters+switchable+3D+DNA+box+origami.">Construction of a 4 zeptoliters switchable 3D DNA box origami.</a> ACS Nano. 6, 10050-10053 (2012).</li><li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid.">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459, 73-76 (2009).</li><li>Zhang, D. Y., Hariadi, R. F., Choi, H. M., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+DNA+strand-displacement+circuitry+with+DNA+tile+self-assembly.">Integrating DNA strand-displacement circuitry with DNA tile self-assembly.</a> Nat. Commun. 4, (1965).</li><li>Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-fuelled+molecular+machine+made+of+DNA.">A DNA-fuelled molecular machine made of DNA.</a> Nature. 406, 605-608 (2000).</li><li>Green, S. J., Lubrich, D., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+hairpins:+fuel+for+autonomous+DNA+devices.">DNA hairpins: fuel for autonomous DNA devices.</a> Biophys. J. 91, 2966-2975 (2006).</li><li>Venkataraman, S., Dirks, R. M., Rothemund, P. W., Winfree, E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autonomous+polymerization+motor+powered+by+DNA+hybridization.">An autonomous polymerization motor powered by DNA hybridization.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 490-494 (2007).</li><li>Green, S. J., Bath, J., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+chemomechanical+cycles:+a+mechanism+for+autonomous+molecular+motion.">Coordinated chemomechanical cycles: a mechanism for autonomous molecular motion.</a> Phys. Rev. Lett. 101, 238101 (2008).</li><li>Omabegho, T., Sha, R., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bipedal+DNA+Brownian+motor+with+coordinated+legs.">A bipedal DNA Brownian motor with coordinated legs.</a> Science. 324, 67-71 (2009).</li><li>Turberfield, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+fuel+for+free-running+nanomachines.">DNA fuel for free-running nanomachines.</a> Phys. Rev. Lett. 90, 118102 (2003).</li><li>Dirks, R. M., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+amplification+by+hybridization+chain+reaction.">Triggered amplification by hybridization chain reaction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 15275-15278 (2004).</li><li>Seelig, G., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalyzed+relaxation+of+a+metastable+DNA+fuel.">Catalyzed relaxation of a metastable DNA fuel.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 12211-12220 (2006).</li><li>Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+entropy-driven+reactions+and+networks+catalyzed+by+DNA.">Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA.</a> Science. 318, 1121-1125 (2007).</li><li>Yin, P., Choi, H. M., Calvert, C. R., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+biomolecular+self-assembly+pathways.">Programming biomolecular self-assembly pathways.</a> Nature. 451, 318-322 (2008).</li><li>Chen, X., Briggs, N., McLain, J. R., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stacking+nonenzymatic+circuits+for+high+signal+gain.">Stacking nonenzymatic circuits for high signal gain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 5386-5391 (2013).</li><li>Phillips, A., Cardelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programming+language+for+composable+DNA+circuits.">A programming language for composable DNA circuits.</a> J. R. Soc. Interface. 6, S419-S436 (2009).</li><li>Lakin, M. R., Youssef, S., Polo, F., Emmott, S., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+DSD:+a+design+and+analysis+tool+for+DNA+strand+displacement+systems.">Visual DSD: a design and analysis tool for DNA strand displacement systems.</a> Bioinformatics. 27, 3211-3213 (2011).</li><li>Lakin, M. R., Youssef, S., Cardelli, L., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abstractions+for+DNA+circuit+design.">Abstractions for DNA circuit design.</a> J. R. Soc. Interface. 9, 470-486 (2012).</li><li>Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+and+modularity+properties+of+a+non-covalent+DNA+catalytic+reaction.">Robustness and modularity properties of a non-covalent DNA catalytic reaction.</a> Nucleic Acids Res. 38, 4182-4197 (2010).</li><li>Ducani, C., Kaul, C., Moche, M., Shih, W. M., Hogberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+production+of+'monoclonal+stoichiometric'+single-stranded+DNA+oligonucleotides.">Enzymatic production of 'monoclonal stoichiometric' single-stranded DNA oligonucleotides.</a> Nat. Methods. 10, 647-652 (2013).</li><li>Lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cloning+of+artificial+DNA+nanostructures.">In vivo cloning of artificial DNA nanostructures.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 17626-17631 (2008).</li><li>Bhatia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icosahedral+DNA+nanocapsules+by+modular+assembly.">Icosahedral DNA nanocapsules by modular assembly.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 4134-4137 (2009).</li><li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+chemical+controllers+made+from+DNA.">Programmable chemical controllers made from DNA.</a> Nat. Nanotechnol. 8, 755-762 (2013).</li><li>Arkin, A., Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+functions+in+biochemical+reaction+networks.">Computational functions in biochemical reaction networks.</a> Biophys. J. 67, 560-578 (1994).</li><li>&#201;rdi, P., T&#243;th, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mathematical models of chemical reactions: theory and applications of deterministic and stochastic models. , (1989).</li><li>Magnasco, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+kinetics+is+Turing+universal.">Chemical kinetics is Turing universal.</a> Phys. Rev. Lett. 78, 1190 (1997).</li><li>Oishi, K., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+implementation+of+linear+I/O+systems.">Biomolecular implementation of linear I/O systems.</a> IET Syst. Biol. 5, 252-260 (2011).</li><li>Senum, P., Riedel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate-independent+constructs+for+chemical+computation.">Rate-independent constructs for chemical computation.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Soloveichik, D., Cook, M., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computation+with+finite+stochastic+chemical+reaction+networks.">Computation with finite stochastic chemical reaction networks.</a> Natural Computing. 7, 615-633 (2008).</li><li>Soloveichik, D., Seelig, G., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+as+a+universal+substrate+for+chemical+kinetics.">DNA as a universal substrate for chemical kinetics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 5393-5398 (2010).</li><li>Tyson, J. J., Chen, K. C., Novak, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sniffers,+buzzers,+toggles+and+blinkers:+dynamics+of+regulatory+and+signaling+pathways+in+the+cell.">Sniffers, buzzers, toggles and blinkers: dynamics of regulatory and signaling pathways in the cell.</a> Curr. Opin. Cell. Biol. 15, 221-231 (2003).</li><li>Cardelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-domain+DNA+strand+displacement.">Two-domain DNA strand displacement.</a> Math. Struct. Comput. Sci. 23, 247-271 (2013).</li><li>Angluin, D., Aspnes, J., Eisenstat, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+population+protocol+for+fast+robust+approximate+majority.">A simple population protocol for fast robust approximate majority.</a> Distrib. Comput. 21, 87-102 (2008).</li><li>Cardelli, L., Csikasz-Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+switch+computes+approximate+majority.">The cell cycle switch computes approximate majority.</a> Sci. Rep. 2, 656 (2012).</li><li>Zadeh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUPACK:+Analysis+and+design+of+nucleic+acid+systems.">NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems.</a> J. Comput. Chem. 32, 170-173 (2011).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J. Vis. Exp. , e253 (2007).</li><li>Lessard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+E.+coli+via+electroporation.">Transformation of E. coli via electroporation.</a> Methods Enzymol. 529, 321-327 (2013).</li><li>Nasri, M., Thomas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+specificity+of+PvuII+restriction+endonuclease.">Alteration of the specificity of PvuII restriction endonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 15, 7677-7687 (1987).</li><li>Dalchau, N., Seelig, G., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+design+of+reaction-diffusion+patterns+using+DNA-based+chemical+reaction+networks.">Computational design of reaction-diffusion patterns using DNA-based chemical reaction networks.</a> DNA Computing and Molecular Programming. , 84-99 (2014).</li><li>Scalise, D., Schulman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+modular+reaction-diffusion+programs+for+complex+pattern+formation.">Designing modular reaction-diffusion programs for complex pattern formation.</a> Technology. 2, 55-66 (2014).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zum Ableiten ndsDNA Gates aus hochreiner Plasmid-DNA. Darüber hinaus wird ein Protokoll zur Charakterisierung Gate Leistung durch einen Fluoreszenz-Assay-Kinetik dargestellt. Experimentelle Daten zeigen, dass das Plasmid stammSystem trifft sein synthetisches Gegenstück, selbst wenn das synthetische System ist aus Strängen mit Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gereinigt, montiert. Wahrscheinlich ist die verbesserte Leistung von Plasmid stammende Gates vor allem auf die hohe Reinheit der biologischen DNA. Synthetische DNA enthält eine Vielzahl von Fehlern, insbesondere Deletionen, die Oligonukleotide mit einer Länge von n-1, und solche Nebenprodukte entstehen, werden in der Regel nicht vollständig PAGE oder Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) Reinigungsverfahren entfernt. Ähnliche Verbesserungen bei den hier berichteten wurden in einer früheren Studie von einer katalysierten Haarnadel-Verstärker, der aus biologischen Quellen 21 abgeleitete DNA verwendet beobachtet. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Aber auch die Verwendung von Plasmid-abgeleitete Gatter können nicht vollständig beseitigen Fehler in der Gate Leistung, für die es mindestens zwei Gründe: Erstens über Verdauung oder Mangel an Schnittgenauigkeit können die Gates mit zu vielen führen Einschnitte oder Kerben in den falschen Positionen. In jedem Fall sind Gates eher in unerwünschter Reaktionen teilzunehmen. Solche Probleme können durch eine Optimierung der Menge des verwendeten Enzyms (siehe Abbildung 4) gelockert werden. Zweitens, in diesen Experimenten am Ein- und Hilfsstränge wurden synthetische DNA und enthielt Deletionen und Mutationen bei. Prinzipiell sind alle Einzelstrang Antriebs- und Hilfs Stränge könnte auch aus Phagemid-DNA durch eine Nicking-Enzym-Verdauung des vorcodierten m13 Virusgenom 26 erhalten werden. Vielleicht die Leistungsfähigkeit der Schaltung kann ferner unter Verwendung von ssDNA aus dem Bakteriengenom abgeleitet verbessert werden. Während die Verwendung von Plasmid-abgeleitete Gattern wurde gefunden, daß die Schaltungsleistung zu verbessern, eine Analyseder Kosten und Bearbeitungszeiten ergeben, dass, während die Herstellung von Plasmid stammende Gates etwas günstiger ist (Tabelle 15), dauert es 2-3 mal längere Verarbeitungszeit im Vergleich zur Montage und Reinigung von Gattern aus kommerziell synthetisiert Oligos (Tabelle 16). Die primären Kosten von Plasmid stammende Gates Gensynthese und die Verwendung von Restriktionsenzymen. 300 pmol von Gattern (ausreichend für 15 Reaktionen bei 30 nM), die geschätzten Kosten für die Join-Gatter ist ungefähr $ 170 und $ 200 für Gabel Tore, die Kostendifferenz wobei aufgrund der Verwendung von unterschiedlichen Nicking-Enzyme. Im Gegensatz dazu ist die chemische Synthese der Stränge für die gleiche Gate kostet rund 260 $ einschließlich einer PAGE Reinigungsgebühr. Die primären Zeitkosten für Plasmid stamm Toren ist in der Klonierung, die, genau wie die DNA-Synthese, kann zu einer Gensynthese Unternehmen ausgelagert werden. Haben jedoch nach der Montage Plasmid stamm Gatter den Vorteil, dass der Host-Plasmide können leicht zu einem replizierendennd in Form von bakteriellen Glycerinstamm gespeichert werden. Dadurch ist es möglich, um die Gates mehrfach wieder verwenden. Wir freuen uns, könnte die verbesserte Leistung von Plasmid stamm Toren einen wesentlich größeren Dynamikbereich als Verhaltensweisen sind experimentell bisher mit DNA CRNs gezeigt zu ermöglichen. Zum Beispiel schlug den letzten theoretischen Arbeit 47,48, dass selbstorganisierte räumliche Muster auf der Makroskala kann mit DNA CRNs durch eine Reaktionsdiffusionsmechanismus realisiert werden. Die hier vorgestellte Methode bietet eine praktikable Weg zum Aufbau der zugrunde liegenden molekularen Komponenten für solche Selbst Strukturieren DNA Materialien. Obwohl anspruchsvoll, die Entwicklung Makromaßstab Morphologien in einer programmierbaren Weise würde erhebliche Auswirkungen in Bereichen wie Biomaterialforschung an der regenerativen Medizin haben.

Die Vorhersehbarkeit der Watson-Crick-Basenpaarung konnten dynamischen DNA-Nanotechnologie als eine programmierbare Weg zu molekularen Geräte mit dynamischen Eigenschaften 1,2 entwerfen entstehen. Insbesondere DNA Strangverdrängung - eine programmierbare, wettbewerbsfähige Hybridisierungsreaktion - hat sich als leistungsfähigen Mechanismus für das Engineering dynamischer DNA Systeme sein. In einem DNA-Strang Verdrängungsreaktion, verdrängt ein eingehender Oligonukleotid eine zuvor gebunden &quot;output&quot; Strang aus einem komplementären Bindungspartner. Mehrere solche Reaktionen können zusammen in mehrstufigen Reaktorkaskaden mit einem hohen Grad an Kontrolle über die Reihenfolge und das Timing der einzelnen Reaktionsschritte 3 verkettet werden. DNA-Strangverdrängungs Kaskaden verwendet worden, um digitale und analoge Schaltungen Molekular 4-7, umschaltbar Nanostrukturen 8-10 autonome molekulare Motoren 11-15, und nicht-kovalente katalytischer Verstärker 13,16-21 erstellen. Außerdem DNA Geräte mit Strangverdrängungsreaktionen können simuliert und für vielfältige Anwendungen unter Verwendung von computergestützten Design-Software 22-24 ausgelegt sein. Derzeit ist chemisch synthetisierte DNA als Hauptmaterial für die DNA-Nanotechnologie. Jedoch Fehler in der DNA-Syntheseverfahren und die so erhaltenen unvollkommen Oligonukleotiden wird angenommen, dass die Leistung von dynamischen DNA von Geräten durch fehlerhafte Nebenreaktionen zu begrenzen. Zum Beispiel &quot;Leck&quot; Reaktionen können in der Freisetzung eines Ausgangs Oligonucleotid selbst in der Abwesenheit eines Reaktionstrigger führen. Solche Effekte werden in autokatalytischen Reaktionskaskaden, wo auch nur eine minimale Menge von anfänglichen Leck wird schließlich in die vollständige Aktivierung des Kaskaden 19,20 führen offensichtlichsten. Umgekehrt Reaktionen oft nicht zu dem erwarteten Ausmaß der Aktivierung zu erreichen, da einige Komponenten nicht einmal in Anwesenheit von die beabsichtigte Eingabe 7,25 auszulösen. Um die Leistung zu machen DNA basierendenNanovorrichtungen vergleichbar zu biologischen Proteinbasis benötigen solche Fehlerarten, drastisch reduziert werden. Bakterielle Plasmide oder andere biologische DNA konnte als relativ billige Quelle für hochreine DNA für Nanotechnologie-Anwendungen dienen. Große Mengen von DNA können durch Replikation in Bakterien erzeugt werden, und die Grenzkorrekturlesen Fähigkeiten lebender Systeme sorgen für die Reinheit des erhaltenen DNA. In der Tat haben einige neue Papiere den potenziellen Nutzen der biologischen DNA für Nanotechnologie-Anwendungen 21,26-28 anerkannt. Jedoch die vollständig doppelsträngige Art der Plasmid-DNA hat bisher die Verwendung als Material zur Herstellung von dynamischen DNA-Geräte, die typischerweise aus mehreren Oligonukleotiden und enthalten sowohl doppelsträngige und einzelsträngige Bereiche gestattet. In einem kürzlich erschienenen Papier 29 wurde diese Frage angesprochen und eine neue DNA-Gate-Architektur, die in erster Linie aus geklaut doppelsträngige DNA (ndsDNA) aus war einzuführend. Wichtig ist, dass Systeme der ndsDNA Tore ausgelegt sein, dass die durch jede formale chemische Reaktion Netzwerk (CRN) 29 angegeben Dynamik zu realisieren. ndsDNA Gates könnte also verwendet werden, grundsätzlich auf dynamische Systeme, die Schwingungen und Chaos, Bistabilität und Gedächtnis, Boolesche Logik oder algorithmische Verhaltensweisen 30-38 aufweisen erstellen. Zum Beispiel 29 Ref. Gezeigt, eine dreiReaktions CRN, die ein Molekular Implementierung eines &quot;Konsensus&quot; Protokoll an, das der verteilten Rechenalgorithmus 29,39,40 vorgesehen. Diese Arbeit erstmals gezeigt werden eine neue Verwendung für die CRN-Formalismus als eine &quot;Programmiersprache&quot; zur schnellen Synthese von funktionalen molekularen Systemen (Abbildung 1A). Hier ist ein detailliertes Protokoll zum Ableiten ndsDNA Gates von Plasmid-DNA ist. Zunächst ist eine Überprüfung der Sequenz Design-Prozess. Es folgt eine Erläuterung, wie synthetische Oligonukleotide enthaltendie Gate-Sequenzen in Plasmide kloniert und die Sequenz verifiziert und durch Bakterienkultur amplifiziert. Als nächstes wird gezeigt, wie ndsDNA Tore können aus den Plasmiden durch enzymatische Verarbeitung abgeleitet werden (siehe Abbildung 2). Schließlich wird ein Verfahren zum Testen von Gate Verhaltens mit Fluoreszenzkinetiken Assays beschrieben. Reaktionsmechanismus Als ein Beispiel setzt das Protokoll auf die katalytische chemische Reaktion A + B-&gt; B + C. Die Arten A, B und C (&quot;Signale&quot;, 1B) entsprechen alle einem anderen Einzelstrang-DNA-Moleküls. Die Sequenzen dieser Moleküle sind völlig unabhängig und die Stränge nicht direkt miteinander reagieren. Die Sequenzen aller Signale weisen zwei verschiedene funktionelle Domänen, das heißt, Teilsequenzen, die in Strangverdrängungsreaktionen zusammenwirken: 1) eine kurze toehold Domäne (labels ta, tb, tc), die für die Initiation der Strangverdrängung r verwendet wirdeAction, und 2) eine lange Domain (Etiketten a, b, c), die das Signal Identität bestimmt. Wechselwirkungen zwischen Signalstränge durch geklaut doppelsträngige DNA (ndsDNA) Gate-Komplexe vermittelte (genannt anmelden AB und Gabel BC) und Hilfseinzelstrang-Arten (&lt;tr r&gt;, &lt;b tr&gt;, &lt;c tb&gt; und &lt;i tc &gt;). Die formale Reaktions A + B-&gt; B + C wird durch eine Reihe von Strangverdrängungsreaktionsschritten, wobei jeder Reaktionsschritt setzt einen Ansatzpunkt für eine anschließende Reaktion (1B) ausgeführt. In diesem Beispiel werden Signale A und B sind anfänglich frei in Lösung, während das Signal C dem Gabel Gate gebunden. Am Ende der Reaktion B und C sind in Lösung. Allgemeiner Signale, die an ein Gate gebunden sind inaktiv, während Signale, die frei in Lösung aktiv sind, das heißt, sie können in einer Strangverdrängungsreaktion als teilnehmenein Eingang. Der zeitliche Verlauf der Reaktion wird unter Verwendung eines fluoreszierenden Reporterstrategie (Abbildung 1C), gefolgt. In früheren Arbeiten 29 wurde gezeigt, dass diese Reaktion Mechanismus realisiert sowohl die korrekte Stöchiometrie als auch die Kinetik der Zielreaktion.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0531S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PvuII-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3151L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PstI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3140S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth, Modified</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T0918-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Hispeed Maxi-prep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nb.BsrDI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0648L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nt.BstNBI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0607L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-stranded Genomic Blocks</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horiba Jobin-Yvon Spex Fluorolog-3 Fluorimeter</td>
			<td>Horiba/Jobin Yvon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Quartz Cells&#160;</td>
			<td>Starna</td>
			<td>23-5.45-S0G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Backbones</td>
			<td>BioBrick</td>
			<td>E0240-pSB1A2</td>
			<td>High copy number plasmid with Ampicillin resistance. Sequence can be found from http://parts.igem.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plasmid-derived dna strand displacement gates for implementing chemical reaction networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high fidelity, is readily amplified through bacterial culture and can be stored indefinitely in the form of bacterial glycerol stocks. However, the double-stranded nature of plasmid DNA has so far hindered its efficient use for construction of DNA nanostructures or devices that typically contain single-stranded or branched domains. In recent work, it was found that nicked double stranded DNA (ndsDNA) strand displacement gates could be sourced from plasmid DNA. The following is a protocol that details how these ndsDNA gates can be efficiently encoded in plasmids and can be derived from the plasmids through a small number of enzymatic processing steps. Also given is a protocol for testing ndsDNA gates using fluorescence kinetics measurements. NdsDNA gates can be used to implement arbitrary chemical reaction networks (CRNs) and thus provide a pathway towards the use of the CRN formalism as a prescriptive molecular programming language. To demonstrate this technology, a multi-step reaction cascade with catalytic kinetics is constructed. Further it is shown that plasmid-derived components perform better than identical components assembled from synthetic DNA.

Watch this Scientific Journal Video about Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks at JoVE.com

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language.

Plasmid stammende DNA-Strand Displacement Gatter zum Implementieren Chemical Reaction Networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

plasmid-derived-dna-strand-displacement-gates-for-implementing

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Aufrufe.  University of Washington. This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language. 