The authors would like to thank Janelle Ryals, Rachel Supple, and Frank Wang for technical assistance. This work was supported by NIH grants R03 DK080182 (JAC), R01 DK099611 (JAC), R01 DK103872 (JAC), Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) grant P20 GM104936 (JAC), start-up funds and core support from the Kansas Institutional Development Award (IDeA) P20 GM103418, core support from the Kansas IDDRC P30 HD002528, and The Madison and Lila Self Fellowship Program (ANP).

Todos los experimentos descritos en este protocolo se ajustan a las directrices del NIH de conformidad con las directrices especificadas por la Universidad de Kansas Medical Center Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión. 1. Separación Materno Neonatal (SMN) <ol><li> Monitorear las presas embarazadas diaria para los nacimientos de basura. Nota: El día de la camada nace se considera P0. </li><li> En P1, retire la presa de la jaula y coloque en un recipiente secundario limpio. </li><li> Frote un puñado de ropa de cama entre manos limpias enguantada para mantener la esencia de la jaula. </li><li> Añadir una profundidad de 1-2 cm de la ropa de cama jaula en un lugar limpio, debidamente etiquetado 2 vaso de precipitados L vidrio. Añadir aproximadamente la mitad de cualquier material adicional de enriquecimiento de ropa de cama que está presente en la jaula de alojamiento, por ejemplo, papel de la arruga nestlet, al vaso de precipitados de vidrio. </li><li> Colocar suavemente todos los cachorros de una sola camada, de forma individual, en el mismo vaso de precipitados. </li><li> Inmediatamente coloqueel vaso de precipitados en una incubadora a cabo en 33 ° C y 50% de humedad durante 180 min. </li><li> Retire la presa desde el recipiente secundario y su regreso a la jaula. Devuelva la jaula a su ubicación vivienda adecuada dentro del vivero. </li><li> Repita este procedimiento para cada camada de someterse NMS, utilizando guantes limpios y contenedores secundarios para cada camada / presa. </li><li> Al final del período de separación de 180 min, devolver las camadas a sus jaulas en el mismo orden en que fueron retirados. </li><li> Recuperar la jaula de la primera camada que fue separado al principio del día. Retire la presa de la jaula y coloque en un recipiente secundario limpio. </li><li> Retire el primer vaso de la incubadora y frotar un puñado de ropa de cama entre las manos enguantadas limpias para mantener el olor de la jaula durante la manipulación de los cachorros. </li><li> Mueva suavemente los cachorros, de forma individual, desde el vaso a la jaula. </li><li> Vuelva cualquier enriquecimiento y la ropa de cama que queda en el vaso de precipitados ala jaula. </li><li> Vuelva la presa del recipiente secundario a la jaula y devolverlo a su ubicación vivienda adecuada dentro del vivero. </li><li> Enjuague el vaso con agua y devolverla a la incubadora. Utilice el mismo vaso para cada camada durante todo el procedimiento de separación. </li><li> Repita este procedimiento para cada camada de someterse NMS en el mismo orden en que se colocaron en la incubadora. </li><li> Repita este procedimiento para cada sometido camada NMS todos los días a través de P21. </li><li> Destete cachorros NMS e ingenuos en P22 colocando camada del mismo sexo juntos en jaulas limpias completos con los alimentos y el agua. Cachorros Naïve deben nacer y alojados en las mismas condiciones que los ratones NMS, pero se someten a ninguna manipulación adicional fuera de las tareas normales de cría de animales. </li></ol> 2. perigenital Sensibilidad mecánica <ol><li> Configuración Aparato von Frey <ol><li> Llevar los ratones a la sala de pruebas y permitir que se aclimaten a 30min mientras permanecen en sus jaulas. </li><li> Preparar la zona de pruebas mediante la colocación de una almohadilla inferior absorbente debajo de una mesa de alambre de malla superior elevada (79 cm x 28 cm) que proporciona espacio suficiente para permitir que el investigador para acercarse desde la parte inferior sin sobresaltando los ratones, aproximadamente 55 cm de altura. </li><li> Coloque hasta 12 ratones, en forma individual, bajo, cámaras de plástico perforadas claras (11 cm x 5 cm x 3,5 cm) en la parte superior de la tabla de malla de alambre. Coloque un objeto pesado en la parte superior de las cámaras para evitar que los ratones se escape. </li><li> Aclimatar los ratones durante 30 minutos adicionales en la pantalla antes de la evaluación umbral de retirada. </li></ol></li><li> Evaluación perigenital sensibilidad mecánica <ol><li> Lleve a cabo el método de arriba-abajo utilizando un conjunto estándar de graduadas monofilamentos de von Frey 43. Utilice los siguientes monofilamentos: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g, y 4,74 g. <ol><li> Sostenga la base del 3,22 g de monofilamento y exponer el mono retraídafilamento. Nota: Algunos modelos pueden no tener un monofilamento retraída. </li><li> Situar la sonda para que el monofilamento se orienta en sentido vertical y cuando el ratón está alerta, inmóvil, y su peso corporal se distribuye en partes iguales entre las patas traseras aplicarlo ya sea a la izquierda oa la derecha del escroto, evitando la línea media, hasta un ligero curva se observa en el filamento. </li><li> Mantenga el monofilamento en su lugar durante 10 segundos o hasta que el animal muestra una respuesta positiva. Nota: Una respuesta positiva se considera que es un tirón rápido o saltar en respuesta a la aplicación de monofilamento o lamer o morder el comportamiento dirigido hacia el monofilamento. Si se mueve el ratón durante la aplicación monofilamento 10 seg sin mostrar estas conductas, el monofilamento deben ser reexaminados después de un período de descanso de 1 minuto de longitud mínima. Si un ratón ni se mueve ni presenta cualquiera de los anteriores comportamientos enumerados durante la aplicación de monofilamento de 10 seg, se considera una respuesta negativa. </li><html><li> Registre la respuesta, ya sea positiva o negativa, en un cuaderno de laboratorio o portátil y repita este procedimiento en todos los ratones restantes utilizando el 3,22 g de monofilamento. </li><li> Prueba de todos los ratones de nuevo utilizando la siguiente monofilamento apropiado. Nota: Si el ratón exhibió una respuesta negativa a la 3,22 g de monofilamento, se aplica la 3,61 g de monofilamento de la misma manera y registrar la respuesta. Si el ratón mostró una respuesta positiva a la 3,22 g de monofilamento, aplicar el 2.83 g monofilamento y registrar la respuesta. </li></ol></li><li> Continúe probando cada ratón utilizando la siguiente monofilamento mayor o menor, según el caso, durante 4 aplicaciones adicionales después de que se observó la primera respuesta positiva. </li><li> Ratones Regreso a jaulas. </li><li> Utilice el valor de la final de monofilamento de von Frey aplicada en la serie de ensayo en unidades logarítmicas para calcular un umbral de retirada del 50% g como se describe en Chaplan et al. 43. </li></ol></li></ol>título &quot;. Acidificados azul de toluidina Mástil tinción celular&gt; 3 <ol><li> Procesamiento de tejidos <ol><li> Diseccionar tejido prostático 44 de los ratones que han sido intracardially perfundidos con helada paraformaldehído al 4% 45. Postfix el tejido en paraformaldehído al 4% durante 1 hora a RT y luego cryoprotect en 30% de sacarosa en 1x PBS a 4 ° CO / N. </li><li> Preparar una pequeña (30 ml) Baño de heptano y colocarlo en hielo seco. </li><li> Enjuague el tejido de la próstata en 1x PBS y seque utilizando un trabajo liviano limpie. </li><li> Introduce el tejido de la próstata en el heptano frío hasta que se congela. </li><li> Inmediatamente coloque el tejido prostático congelado en un criomolde contiene medios de montaje y lugar en hielo seco hasta congelado. </li><li> Tienda criomoldes a -20 ° C. </li><li> Transversalmente cortar el tejido de la próstata en 7 cryosections micras de espesor usando un criostato. </li><li> Coloque 8 - 12 cryosections no de serie que abarcan la longitud del tejido, en portaobjetos de microscopio cargados positivamente. </li><li> Tienda terminó diapositivas a -20 ° C hasta su posterior procesamiento. </li></ol></li><li> Preparación Acidificados azul de toluidina <ol><li> Añadir 1 g de azul de toluidina O a 100 ml de etanol 70% y agitar hasta en solución para preparar una solución madre 1%. La solución madre se puede almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de tres semanas. </li><li> Añadir 1 g de NaCl a 100 ml de agua en un vaso de precipitados colocado en la parte superior de una placa de agitación. </li><li> Ajustar el pH de la solución de NaCl usando HCl 12 M hasta un intervalo de pH de 0,5 - 1.0 se logra. </li><li> Preparar la solución de trabajo de azul de toluidina 0,25% combinando 8 ml de la solución madre de azul de toluidina y 32 ml de la solución de NaCl 1%. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para asegurar la incorporación total de la solución madre azul de toluidina y mezclar utilizando un vórtice. La solución de trabajo debe estar recién hecho y se desecha después de usar. </li></ol></li><li> La tinción de próstata criosecciones <ol><li> Retire las transparencias para ser procesados ​​del congelador y deje que se equilibre a la temperatura ambiente durante aproximadamente 30 men. </li><li> Lavar las secciones de tejido por inmersión individualmente las diapositivas durante aproximadamente 1 seg en un tubo cónico de 50 ml que contiene un volumen suficiente de 1x PBS para asegurar que las secciones de tejido de deslizamiento montado serán completamente sumergidos. Permitir que las diapositivas se sequen al aire sobre una toalla de papel. </li><li> Colocar los portaobjetos en un tarro de tinción de vidrio que contiene suficiente solución de trabajo azul de toluidina 0,25% para asegurar que los cortes de tejido de diapositivas montadas serán completamente sumergidos y se incuban durante 10 - 15 min, mientras que en una mecedora plataforma fijado en 15 rpm. </li><li> Diapositivas Dip en 1x PBS durante aproximadamente 1 segundo para lavar el exceso de azul de toluidina. </li><li> Colocar los portaobjetos en una caja de portaobjetos o un estante de tal manera que las diapositivas están en sus lados para permitir el drenaje. </li><li> Secar los portaobjetos en un horno a 37 ° C durante un mínimo de 2 horas o O / N a temperatura ambiente. </li><li> Deshidratar diapositivas rápidamente usando el alcohol, lo que permite a las diapositivas completamente seco entre las exposiciones de alcohol. Diapositivas en seco por el drenaje en una toalla de papel unnd espaldas de limpieza y bordes con un trabajo ligero limpie. <ol><li> Sumergir los portaobjetos en EtOH al 95% durante aproximadamente 1 segundo y deje que se seque completamente. Repita este procedimiento 1 - 10 veces hasta que el tejido se seca más azul que violeta. </li><li> Sumergir los portaobjetos en EtOH al 100% durante aproximadamente 1 segundo y deje que se seque completamente. Repita este procedimiento 1 - 10 veces hasta que el tejido es oscuro al azul medio, pero no de color púrpura. </li></ol></li><li> Fijar la mancha incubando las diapositivas de 100% xileno durante 3 min. Deje que se seque. </li><li> Cubreobjetos las diapositivas con glicerol, PBS, o medio de montaje permanente a base de xileno. Escurrir el exceso de medios de comunicación y almacenar a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Las células cebadas Cuantificación <ol><li> Visualice las secciones de tejido teñidas de azul de toluidina al 20X de aumento utilizando microscopía de luz (Figura 2). </li><li> Cuente el número total de los mastocitos presentes en la zona visualizada y diferenciar entre los mastocitos no degranulados y degranulados. 40X magnífication puede ser necesario para confirmar el estado de granulación en algunos mastocitos. Nota: Los mastocitos no degranulados exhiben metacromasia densa con ninguna o leve contorno nuclear y / o sin extrusión granular alrededor de la celda. Mastocitos desgranulados exhibir menos intensa metacromasia y tener un esquema claro obvio del núcleo y / o gránulos libres en el citoplasma y el exterior del borde de la celda. </li><li> Continuar para evaluar el número total de los mastocitos no degranulados y degranulados en la totalidad de la sección de tejido actual. Repita este procedimiento en al menos 7 secciones separadas adicionales, que abarca la longitud de cada tejido. </li><li> Calcular el porcentaje de degranulated (DG) a las células cebadas totales para cada tejido / ratón de acuerdo a la siguiente ecuación: (mastocitos dg / Total de mastocitos) x 100. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Este protocolo proporciona la metodología para el uso de estrés neonatal, en forma de NMS, para inducir sintomatología indicativa de CP / CPPS en ratones machos adultos. Como adultos, los ratones muestran NMS alodinia mecánica perigenital significativa, así como pruebas de desgranulación de los mastocitos en el tejido prostático. El uso de NMS es un nuevo enfoque para el desarrollo de un modelo preclínico de CP / CPPS en que replica el estrés de la vida temprana que a menudo se informó por los pacientes con do...

El dolor pélvico crónico no es en sí una enfermedad, sino más bien un término asociado con el dolor continuo espontáneo y / o evocado que sufren los pacientes con diagnóstico de síndrome de intestino irritable (SII), cistitis / síndrome de vejiga dolorosa intersticial (IC / PBS), la vulvodinia, o el síndrome de dolor pélvico prostatitis crónica / crónica (CP / CPPS). Estos síndromes son a menudo comórbida y comparten muchas características en que no tienen ninguna patología asociada o etiología subyacente identificado, aunque la disfunción en el sistema inmunológico, sistema nervioso central, sistema nervioso periférico y se ha demostrado que contribuyen al mantenimiento y la progresión de estos trastornos 1 -3. Los pacientes con dolor pélvico crónico son más propensos a presentar síntomas de adicional, trastornos de dolor funcionales y trastornos del estado de ánimo, incluyendo la ansiedad, la depresión y el trastorno de pánico 4-6, que se ha asociado con el funcionamiento alterado de la hipotálamo no relacionados con pélvico- pituitarioadrenal (HPA) 7-10. La exposición al estrés de la vida temprana o trauma es un factor de riesgo importante para el desarrollo de anomalías HPA y asociados síndromes de dolor crónico 10,11 y, como tal, un subconjunto significativo de pacientes con trastornos de dolor pélvico funcionales reportan haber experimentado eventos adversos de la infancia como el abuso o negligencia 12-14. Modelos de roedores de la separación materna neonatal (SMN), que consiste en la eliminación de las crías de su presa por un período determinado de tiempo durante el período predestete, se han utilizado durante las últimas dos décadas a estudiar los resultados del estrés de la vida temprana. En general, NMS se ha demostrado que aumenta la activación del eje HPA, y comportamientos similares a la ansiedad resultantes, afectando directamente la expresión génica en el hipotálamo, así como la interrupción de la regulación aguas abajo de las estructuras límbicas 15-18. La interrupción de funcionamiento adecuado del eje HPA se ha demostrado que contribuyen a una mayor colorrectal 19-22 </sup&gt; Y vaginal 16 sensibilidad representada por los modelos NMS roedores, pero a pesar de una amplia caracterización de los efectos a largo plazo de la inflamación de la vejiga después del parto 23-25, el impacto del estrés primeros años de vida ha pasado casi sin estudiar en los órganos urogenitales. Por lo tanto, el siguiente estudio describe cómo realizar NMS en ratones y posteriormente evaluar la sensibilidad mecánica perigenital y la infiltración de mastocitos / activación en la próstata para validar el uso de ratones NMS masculinos como un modelo preclínico para CP / CPPS. De todos los trastornos de dolor pélvico crónico diagnosticados, CP / CPPS es tal vez el síndrome de menos bien reconocida y caracterizada, a pesar de tener una prevalencia de aproximadamente el 14% 26 y los costos anuales de pacientes estimados en $ 4,400 (el doble que el de la lumbalgia o reumatoide artritis 27). Los pacientes con CP / CPPS informe dolor en el perineo, el recto, próstata, pene, testículos, y / o el abdomen 28, experimentan una altagrado gher de estrés psicológico que los pacientes de control 29, y por lo general se presentan con síntomas de o son diagnosticados con el dolor o el estado de ánimo trastornos pélvicos crónicos comórbidas 5,29-31. Infección recurrente, el epitelio que gotea, inflamación neurogénica, y autoinmunidad han sido conjeturado como posibles causas subyacentes de la CP / CPPS 2,32,33, así como la activación de los mastocitos y degranulación 34. Las secreciones prostáticas expresadas a partir de los hombres con CP / CPPS habían aumentado los niveles de triptasa de mastocitos y factor de crecimiento nervioso (NGF) 34, y un estudio posterior confirmado que la triptasa y carboxipeptidasa A (CPA3), un marcador de la activación de los mastocitos, también se incrementaron en el orina de pacientes CP / CPPS 35. El papel potencial de los mastocitos en el inicio y mantenimiento de la CP / CPPS ha sido un foco importante de la investigación con animales en este síndrome hasta el momento. El modelo de roedor más comúnmente empleada utilizado para estudiar CP / CPPS es una prostatitis autoinmune experimental (EAP) modelo de generaciónnerada por inyección subcutánea de antígeno de próstata en adyuvante completo de Freund, lo que resulta en variados grados de inflamación prostática dependiendo de la especie y cepa utilizada 34,36-39. Infiltración de células de mástil y la activación / desgranulación se ha demostrado que aumenta después de la inducción de la PEA 34,35,40. Los ratones transgénicos deficientes en cualquiera de los mastocitos 34 o el receptor de triptasa PAR2 35 no desarrollan la sensibilidad táctica prostática siguiente EAP, a diferencia de los ratones de tipo salvaje de EAP. Si bien este modelo preclínico replica muchas de las características del CP humana / CPPS, el protocolo de inducción no es indicativo de la condición humana, que tiene una etiología diversa y muchas veces no implica inflamación directa, infección o lesión de la próstata. La influencia del estrés de la vida temprana en el desarrollo de CP / CPPS en los seres humanos en gran medida ha ido sin investigar; Sin embargo, un estudio realizado por Hu, et al. 41, demostró que men que reportaron una historia de la infancia física, emocional y / o abuso sexual fueron significativamente más propensos a experimentar síntomas sugestivos de CP / CPPS. Además, demostraron que tanto el dolor y las puntuaciones urinarios se incrementaron en los pacientes con antecedentes de abuso físico y emocional. Hemos demostrado anteriormente que el mismo paradigma NMS en hembra C57BL / 6 ratones produce hipersensibilidad vaginal y la expresión génica anormal tanto en la vagina y la vejiga sugestivo de HPA disfuncional eje de salida 16. Esta evidencia combinada con la alta prevalencia de pacientes CP / CPPS que presentan otras comorbilidades 42, incluyendo IC / PBS y los trastornos del estado de ánimo, que más claramente han demostrado estar relacionado con la exposición al estrés de la vida temprana 12-14, proporciona la justificación para el uso de un modelo NMS para investigar CP / CPPS en ratones.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pregnant C57BL/6 female mice&#160;</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L glass beaker(s)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS10002L</td>
			<td>Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Forced Air Incubator, Basic</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>414005-124</td>
			<td>The incubator should be held at 33&#176;C and 50% humidity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>58011</td>
			<td>The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Enclosure (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>435</td>
			<td>Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>410</td>
			<td>Place stand on a stable table top for comfortable access.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4&#176;C overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>246654</td>
			<td>Chill heptane on dry ice to freeze tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Cryomold&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4557</td>
			<td>To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>12 x 125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Superfrost Plus Micro Slide</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>75 x 25 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198161</td>
			<td>Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate Sterile 50 mL Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>C-3394</td>
			<td>Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-815</td>
			<td>Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Histological)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P</td>
			<td>Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Boxes, 100-Place</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003</td>
			<td>Boxes can be used for storage and transportation of slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Slide Box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-400</td>
			<td>These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Glycerol is a traditional mounting medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium, Richard-Allan Scientific</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4111</td>
			<td>Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48393-106</td>
			<td>A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation

La prostatitis crónica / síndrome de dolor pélvico crónico (CP / CPPS) tiene una prevalencia de vida del 14% y es el diagnóstico urológico más común para los hombres menores de 50, sin embargo, es el trastorno de dolor pélvico crónico menos comprendido y estudiado. Un subconjunto significativo de pacientes con dolor pélvico crónico reporte haber experimentado estrés de la vida temprana o abuso, lo que puede afectar notablemente el funcionamiento y la regulación del eje hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA). Activación de los mastocitos, que se ha demostrado ser aumentado tanto en orina y expresó secreciones prostáticas de pacientes CP / CPPS, está parcialmente regulada por la activación aguas abajo del eje HPA. Separación materna neonatal (SNM) se ha utilizado durante más de dos décadas a estudiar los resultados del estrés de la vida temprana en modelos de roedores, incluyendo cambios en el eje HPA y la sensibilidad visceral. Aquí le ofrecemos un protocolo detallado para el uso de NMS como un modelo preclínico de CP / CPPS en machos C57BL / 6 ratones. Se describe la metodologíapara la realización de NMS, la evaluación de la alodinia mecánica perigenital, y evidencia histológica de activación de los mastocitos. También proporcionamos evidencia de que el estrés psicológico temprana puede tener efectos a largo plazo sobre el sistema urogenital masculina en ratones.

Los ratones que han sido sometidos a NMS mostró evidencia de comportamiento indicativos de CP / CPPS. Cuando se prueba con una serie graduada de monofilamentos de von Frey, ratones NMS 8 semanas de edad (n = 4) que se muestra la alodinia mecánica perigenital en comparación con homólogos no tratados (n = 5, Figura 2). Esto se evidencia como una reducción significativa (p &lt;0,01; prueba t de Student) en el umbral de retirada mecánica que provocó una respuesta de comportamiento positivo, ...

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Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

Estamos midiendo la sensibilidad y la activación de las células mástil mecánica perigenital en la próstata de macho C57BL / 6 ratones que se sometieron a un paradigma principios de estrés de la vida - la separación materna neonatal, con el fin de inducir un modelo preclínico de síndrome de dolor pélvico / crónica prostatitis crónica.

Evaluación de perigenital Sensibilidad y Prostática mástil activación celular en un modelo de ratón de la separación materna neonatal

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

9.2K vistas.  University of Kansas Medical Center.  Estamos midiendo la sensibilidad y la activación de las células mástil mecánica perigenital en la próstata de macho C57BL / 6 ratones que se sometieron a un paradigma principios de estrés de la vida - la separación materna neonatal, con el fin de inducir un modelo preclínico de síndrome de dolor pélvico / crónica prostatitis crónica. 

Video: Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Un modelo de ratón En el útero Trasplante

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Investigación

Medicina

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

A Swine Model of Neonatal Asphyxia

Annually more than 1 million neonates die worldwide as related to asphyxia. Asphyxiated neonates commonly have multi-organ failure including hypotension, perfusion deficit, hypoxic-ischemic encephalopathy, pulmonary hypertension, vasculopathic enterocolitis, renal failure and thrombo-embolic complications. Animal models are developed to help us understand the patho-physiology and pharmacology of neonatal asphyxia. In comparison to rodents and newborn lambs, the newborn piglet has been proven to be a valuable model. The newborn piglet has several advantages including similar development as that of 36-38 weeks human fetus with comparable body systems, large body size (&tilde;1.5-2 kg at birth) that allows the instrumentation and monitoring of the animal and controls the confounding variables of hypoxia and hemodynamic derangements.
We here describe an experimental protocol to simulate neonatal asphyxia and allow us to examine the systemic and regional hemodynamic changes during the asphyxiating and reoxygenation process as well as the respective effects of interventions. Further, the model has the advantage of studying multi-organ failure or dysfunction simultaneously and the interaction with various body systems. The experimental model is a non-survival procedure that involves the surgical instrumentation of newborn piglets (1-3 day-old and 1.5-2.5 kg weight, mixed breed) to allow the establishment of mechanical ventilation, vascular (arterial and central venous) access and the placement of catheters and flow probes (Transonic Inc.) for the continuously monitoring of intra-vascular pressure and blood flow across different arteries including main pulmonary, common carotid, superior mesenteric and left renal arteries. Using these surgically instrumented piglets, after stabilization for 30-60 minutes as defined by Z&lt;10% variation in hemodynamic parameters and normal blood gases, we commence an experimental protocol of severe hypoxemia which is induced via normocapnic alveolar hypoxia. The piglet is ventilated with 10-15% oxygen by increasing the inhaled concentration of nitrogen gas for 2h, aiming for arterial oxygen saturations of 30-40%. This degree of hypoxemia will produce clinical asphyxia with severe metabolic acidosis, systemic hypotension and cardiogenic shock with hypoperfusion to vital organs. The hypoxia is followed by reoxygenation with 100% oxygen for 0.5h and then 21% oxygen for 3.5h. Pharmacologic interventions can be introduced in due course and their effects investigated in a blinded, block-randomized fashion.

Large animal models have good translational values in the examination of physiology and pharmacology of neonatal asphyxia. Using newborn piglets, we develop an experimental protocol to simulate neonatal asphyxia which has advantages of studying the systemic and regional hemodynamics, oxygen transport with biochemical and pathologic pathways and correlations.

Un modelo porcino de la asfixia neonatal

Annually more than 1 million neonates die worldwide as related to asphyxia. Asphyxiated neonates commonly have multi-organ failure including hypotension, ...

A Piglet Model of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the world&#8217;s 2.9 million neonatal deaths. Animal models of HIE have contributed to the understanding of the pathophysiology in HIE, and have highlighted the dynamic process that occur in brain injury due to perinatal asphyxia. Thus, animal studies have suggested a time-window for post-insult treatment strategies. Hypothermia has been tested as a treatment for HIE in pdiglet models and subsequently proven effective in clinical trials. Variations of the model have been applied in the study of adjunctive neuroprotective methods and piglet studies of xenon and melatonin have led to clinical phase I and II trials1,2. The piglet HIE model is further used for neonatal resuscitation- and hemodynamic studies as well as in investigations of cerebral hypoxia on a cellular level. However, it is a technically challenging model and variations in the protocol may result in either too mild or too severe brain injury. In this article, we demonstrate the technical procedures necessary for establishing a stable piglet model of neonatal HIE. First, the newborn piglet (&#60; 24 hr old, median weight 1500 g) is anesthetized, intubated, and monitored in a setup comparable to that found in a neonatal intensive care unit. Global hypoxia-ischemia is induced by lowering the inspiratory oxygen fraction to achieve global hypoxia, ischemia through hypotension and a flat trace amplitude integrated EEG (aEEG) indicative of cerebral hypoxia. Survival is promoted by adjusting oxygenation according to the aEEG response and blood pressure. Brain injury is quantified by histopathology and magnetic resonance imaging after 72 hr.

Hypoxic-ischemic encephalopathy following perinatal asphyxia can be studied using animal models. We demonstrate the procedures necessary for establishing a piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy.

Un modelo del cochinillo de Neonatología encefalopatía hipóxico-isquémica

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

Un ratón neonatal lesión de médula espinal de compresión Modelo

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

A Battery of Motor Tests in a Neonatal Mouse Model of Cerebral Palsy

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, standardized battery of neonatal mouse motor tests. These tests can validate injury or disease models, determine treatment efficacy and/or assess motor behaviors in new transgenic strains. This paper presents a series of neonatal motor tests to evaluate general motor function, including ambulation, hindlimb foot angle, surface righting, negative geotaxis, front- and hindlimb suspension, grasping reflex, four limb grip strength and cliff aversion. Mice between the ages of post-natal day 2 to 14 can be used. In addition, these tests can be used for a wide range of neurological and neuromuscular pathologies, including cerebral palsy, hypoxic-ischemic encephalopathy, traumatic brain injury, spinal cord injury, neurodegenerative diseases, and neuromuscular disorders. These tests can also be used to determine the effects of pharmacological agents, as well as other types of therapeutic interventions. In this paper, motor deficits were evaluated in a novel neonatal mouse model of cerebral palsy that combines hypoxia, ischemia and inflammation. Forty-eight hours after injury, five tests out of the nine showed significant motor deficits: ambulation, hindlimb angle, hindlimb suspension, four limb grip strength, and grasping reflex. These tests revealed weakness in the hindlimbs, as well as fine motor skills such as grasping, which are similar to the motor deficits seen in human cerebral palsy patients.

Presented is a concise battery of mouse neonatal motor tests. Using these tests, neonatal motor deficits can be demonstrated in a variety of neonatal motor disorders. By having a standardized set of tests, results from different studies can be compared, allowing for better and accurate reporting between groups.

Una batería de pruebas de motor en un modelo de ratón neonatal de la parálisis cerebral

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

El infarto de miocardio en ratones recién nacidos, un modelo de regeneración cardiaca

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we demonstrate a murine cryoinjury infarct model that generates precise infarct sizes with high reproducibility and replicability. In brief, after intubation and sternotomy of the animal, the heart is lifted from the thorax. The probe of a handheld liquid nitrogen delivery system is applied onto the myocardial wall to induce cryoinjury. Impaired ventricular function and electrical conduction can be monitored with echocardiography or optical mapping. Transmural myocardial remodeling of the infarcted area is characterized by collagen deposition and loss of cardiomyocytes. Compared to other models (e.g., LAD-ligation), this model utilizes a handheld liquid nitrogen delivery system to generate more uniform infarct sizes.

This article demonstrates a model to study cardiac remodeling after myocardial cryoinjury in mice.

Un modelo de criolesiones para estudiar el infarto de miocardio en el ratón

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Un modelo de ratón BALB/c neonatal de enterocolitis necrosante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight ...