The authors would like to thank Janelle Ryals, Rachel Supple, and Frank Wang for technical assistance. This work was supported by NIH grants R03 DK080182 (JAC), R01 DK099611 (JAC), R01 DK103872 (JAC), Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) grant P20 GM104936 (JAC), start-up funds and core support from the Kansas Institutional Development Award (IDeA) P20 GM103418, core support from the Kansas IDDRC P30 HD002528, and The Madison and Lila Self Fellowship Program (ANP).

Todas as experiências descritas neste protocolo estão em conformidade com as diretrizes do NIH, em conformidade com as orientações especificadas pela University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care e do Comitê Use. 1. Separação Materna Neonatal (SMN) <ol><li> Monitorar barragens grávidas diariamente para nascimentos de maca. Nota: O dia da ninhada nasce é considerado P0. </li><li> No P1, retire a barragem da gaiola e coloque em um recipiente secundário limpo. </li><li> Esfregue um punhado de roupas de cama entre as mãos limpas de luvas para manter cheiro da gaiola. </li><li> Adicionar uma profundidade de 1-2 cm da cama gaiola em um ambiente limpo, devidamente rotulados 2 copo de vidro G. Adicionar aproximadamente metade de qualquer material adicional enriquecimento de cama que está presente na gaiola, por exemplo, nestlet, papel da dobra, para a taça de vidro. </li><li> Suavemente colocar todas as crias de uma única ninhada, individualmente, no mesmo copo. </li><li> Coloque imediatamenteo copo numa incubadora mantida a 33 ° C e 50% de humidade durante 180 minutos. </li><li> Remova a barragem do recipiente secundário e devolvê-la para a gaiola casa. Retorne a gaiola para seu local de moradia adequada dentro do viveiro. </li><li> Repita esse procedimento para cada ninhada passando por NMS, usando luvas limpas e recipientes secundários para cada ninhada / barragem. </li><li> No final do período de separação de 180 min, as ninhadas retornar às suas gaiolas de alojamento na mesma ordem em que foram removidos. </li><li> Recuperar a gaiola da primeira ninhada que foi separado no início do dia. Remova a barragem da gaiola e coloque em um recipiente secundário limpo. </li><li> Remova a primeira taça da incubadora e esfregue um punhado de roupas de cama entre as mãos enluvadas limpas para manter cheiro da gaiola durante o manuseio dos filhotes. </li><li> Suavemente mover os filhotes, individualmente, a partir da taça para a gaiola de origem. </li><li> Retorne qualquer enriquecimento e roupa de cama restante no copo dea gaiola de origem. </li><li> Retornar à barragem do reservatório secundário para a gaiola para casa e devolvê-lo ao seu local de moradia adequada dentro do viveiro. </li><li> Lavar o copo com água e devolvê-lo para a incubadora. Utilizar o mesmo copo para cada ninhada durante todo o procedimento de separação. </li><li> Repetir este procedimento para cada ninhada submetidos NMS na mesma ordem em que foram colocados na incubadora. </li><li> Repita este procedimento inteiro para cada ninhada NMS submetidos todos os dias através de P21. </li><li> Desmamar filhotes NMS e ingênuos sobre P22, colocando ninhada do mesmo sexo juntos em gaiolas limpas completas com comida e água. Filhotes ingênuos devem nascer e ser alojados sob as mesmas condições que os ratos NMS, mas passam por nenhum tratamento adicional fora das tarefas normais de produção animal. </li></ol> 2. Perigenital sensibilidade mecânica <ol><li> von Frey Setup Aparelho <ol><li> Traga os ratos para a sala de ensaios e permitir-lhes para se aclimatar para 30minutos mantendo-se nas suas gaiolas. </li><li> Preparar a área de teste, colocando um resguardo absorvente embaixo de um mesa-top de malha de arame elevada (79 centímetros x 28 cm) que oferece espaço suficiente para permitir que o investigador se aproximar do lado de baixo, sem assustar os ratos, cerca de 55 centímetros de altura. </li><li> Coloque até 12 ratos, individualmente, em câmaras de plástico transparente, perfurado (11 cm x 5 cm x 3,5 cm) na parte superior da tabela de malha de arame. Coloque um objecto pesado em cima das câmaras para evitar ratos de escapar. </li><li> Aclimatar os ratos durante mais 30 minutos adicionais na tela antes da determinação do limiar de retirada. </li></ol></li><li> Avaliação Perigenital sensibilidade mecânica <ol><li> Execute o método de cima para baixo usando um conjunto padrão de classificados monofilamentos de von Frey 43. Use as seguintes monofilamentos: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g e 4,74 g. <ol><li> Segurar a base do monofilamento de 3,22 g e expor o mono retraídafilamento. Nota: Alguns modelos podem não ter um monofilamento retraída. </li><li> Situar a sonda de modo que o monofilamento é orientado verticalmente e quando o mouse está em alerta, imóvel, e seu peso do corpo é distribuído igualmente entre as patas traseiras aplicá-lo a qualquer um o lado esquerdo ou direito do escroto, evitando a linha média, até um ligeiro curvatura é observado no filamento. </li><li> Segurar o monofilamento no lugar durante 10 segundos ou até que o animal apresenta uma resposta positiva. Nota: Uma resposta positiva é considerada um empurrão rápido ou saltar em resposta à aplicação de monofilamento ou lamber ou morder comportamento dirigido para o monofilamento. Se o mouse se move durante a aplicação de monofilamento de 10 segundos sem exibir estes comportamentos, o monofilamento deve ser testada novamente após um período mínimo de descanso de 1 min de duração. Se um rato nem se move nem apresenta qualquer um dos comportamentos listados acima durante a aplicação de monofilamento de 10 segundos, é considerada uma resposta negativa. </li><html><li> Grave a resposta, seja positiva ou negativa, em um caderno de anotações ou laptop e repetir este procedimento em todos os restantes ratos usando a 3,22 g monofilamento. </li><li> Testar todos os ratos novamente usando o seguinte monofilamento apropriada. Nota: Se o rato exibiram uma resposta negativa ao monofilamento de 3,22 g, aplicam-se a 3,61 g de monofilamento do mesmo modo e gravar a resposta. Se o mouse exibiram uma resposta positiva para o monofilamento 3,22 g, aplique a 2,83 g monofilamentos e gravar a resposta. </li></ol></li><li> Continue testando cada rato utilizando a próxima monofilamento maior ou menor, consoante o caso, durante quatro aplicações adicionais após a primeira resposta positiva é observada. </li><li> Retorno ratos para gaiolas. </li><li> Utilizar o valor da última monofilamentos de von Frey aplicado na série experimental em unidades logarítmicas para calcular um limiar de retirada de 50% g como descrito em Chaplan et ai. 43. </li></ol></li></ol>title &quot;&gt; 3. Acidificado Toluidine azul mastro de coloração celular <ol><li> Processamento de Tecidos <ol><li> Dissecar tecido da próstata 44 a partir de ratos que foram perfundidos com intracardial gelada paraformaldeído a 4% 45. Sufixo o tecido em paraformaldeído a 4% durante 1 h à TA e depois cryoprotect em sacarose a 30% em 1x PBS a 4 ° CO / N. </li><li> Prepara-se uma pequena (30 ml) Banho de heptano e colocá-lo em gelo seco. </li><li> Lavar o tecido da próstata em 1x PBS e secar com um dever luz wipe. </li><li> Insira o tecido da próstata para o heptano frio até que seja congelado. </li><li> Imediatamente coloque o tecido da próstata congelado em um cryomold contendo meios de montagem e colocar no gelo seco até congelados. </li><li> Loja cryomolds a -20 ° C. </li><li> Transversalmente cortar o tecido da próstata em 7 criocortes micrometros de espessura, utilizando um criostato. </li><li> Colocar 8-12 criocortes não seriados que abrangem o comprimento do tecido, em lâminas de microscópio com carga positiva. </li><li> Loja terminado lâminas a -20 ° C até posterior processamento. </li></ol></li><li> Preparando Acidificado Azul de Toluidina <ol><li> Adicionar 1 g de Azul de Toluidina O para 100 ml de etanol a 70% e vortex até que em solução para preparar uma solução stock de 1%. A solução-mãe pode ser armazenado à temperatura ambiente durante até três semanas. </li><li> Adicionar 1 g de NaCl a 100 ml de água num copo colocado no topo de uma placa de agitação. </li><li> Ajustar o pH da solução de NaCl utilizando HCl 12 M até uma gama de pH 0,5 - 1,0 é alcançado. </li><li> Preparar a solução de azul de toluidina a trabalhar a 0,25% por combinação de 8 mL da solução stock de Toluidina Azul e 32 ml de solução de NaCl a 1%. Pipeta cima e para baixo para garantir a incorporação total da solução estoque Azul de Toluidina e misturar utilizando um vórtice. A solução de trabalho deve ser feito fresco e descartados após o uso. </li></ol></li><li> A coloração da próstata Cortes congelados <ol><li> Retirar as lâminas a serem processados ​​a partir do congelador e deixar equilibrar à temperatura ambiente durante cerca de 30 mdentro. </li><li> Lavam-se as secções de tecido por imersão individualmente as lâminas durante cerca de 1 segundo para um tubo cónico de 50 ml contendo um volume suficiente de 1x PBS para assegurar que as secções de tecido em lâminas vão ser completamente submerso. Deixar as lâminas secar ao ar numa toalha de papel. </li><li> Colocar as lâminas em um frasco de vidro para coloração contendo suficiente trabalhar solução azul de toluidina a 0,25% para assegurar que as secções de tecido em lâminas vão ser completamente submerso e incubar durante 10 - 15 min, enquanto numa plataforma oscilante fixada em 15 rpm. </li><li> Dip slides em 1x PBS para aproximadamente 1 segundo para lavar o excesso de Azul de Toluidina. </li><li> Colocar as lâminas em uma caixa de corrediça ou cremalheira, de tal maneira que as lâminas estão nos seus lados para permitir a drenagem. </li><li> Secam-se as lâminas em um forno a 37 ° C durante um mínimo de 2 horas ou O / N à temperatura ambiente. </li><li> Desidratam rapidamente os slides usando álcool, permitindo que os slides para secar completamente entre as exposições de álcool. Lâminas secas por drenagem em uma toalha de papel umand de limpeza costas e bordas com um dever luz wipe. <ol><li> Mergulhe as lâminas em 95% EtOH durante cerca de 1 seg e deixe secar completamente. Repita este procedimento 1-10 vezes até que o tecido seca mais azul do que roxo. </li><li> Mergulhe as lâminas em EtOH a 100% para aproximadamente 1 segundo e deixe secar completamente. Repita este procedimento 1-10 vezes até que o tecido é escuro para azul médio, mas não roxo. </li></ol></li><li> Corrigir a mancha por incubação das lâminas em 100% de xileno por 3 min. Deixe secar. </li><li> Lamela os slides com glicerol, PBS ou mídia de montagem permanente à base de xileno. Escorra o excesso de mídia e armazenar a RT. </li></ol></li><li> Quantificando mastócitos <ol><li> Visualize as secções de tecido azul-toluidina manchadas com ampliação de 20x usando microscopia de luz (Figura 2). </li><li> Contar o número total de mastócitos presentes dentro da área visualizada e diferenciar entre mastócitos desgranulados e não-desgranulados. 40X Magnificatião pode ser necessário para confirmar o estado de granulação em alguns mastócitos. Nota: os mastócitos desgranulados não exibem metacromasia densa com nenhuma ou esboço fraco nuclear e / ou não granular extrusão em torno da célula. Mastócitos desgranulados exibem menos intensa metacromasia e ter uma visão clara óbvio do núcleo e / ou grânulos livres dentro do citoplasma e fora da borda da célula. </li><li> Continuar para avaliar o número total de mastócitos desgranulados e não-desgranulados na totalidade da secção de tecido actual. Repita este procedimento em pelo menos sete seções separadas adicionais, que mede o comprimento cada tecido. </li><li> Calcula-se a percentagem de desgranulados (DG) para células totais mastro para cada tecido / rato de acordo com a seguinte equação: (mastócitos dg / células totais x 100) de mastro. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Este protocolo fornece metodologia para usar o estresse neonatal, sob a forma de NMS, para induzir a sintomatologia indicativa de CP / CPPS em ratos machos adultos. Como adultos, os ratos NMS exibir alodinia mecânica perigenital significativa, bem como provas de degranulação dos mastócitos no tecido da próstata. O uso de NMS é uma nova abordagem para o desenvolvimento de um modelo pré-clínico da CP / CPPS na medida em que reproduz o início da vida stress que muitas vezes é relatada pelos pacientes com dor pél...

A dor pélvica crônica não é em si uma doença, mas sim um termo associado com a dor espontânea em curso e / ou evocado experimentado por pacientes com diagnóstico de síndrome do intestino irritável (IBS), cistite / síndrome da bexiga dolorosa intersticial (IC / PBS), vulvodynia, ou síndrome de prostatite crônica / dor pélvica crônica (CP / CPPS). Estas síndromes são frequentemente comorbidade e partilham muitas características em que eles não têm qualquer patologia associada ou etiologia subjacente identificado, embora a disfunção no sistema imunológico, sistema nervoso central, sistema nervoso periférico e tem sido demonstrado que contribuem para a manutenção e a progressão dessas doenças 1 -3. Os pacientes com dor pélvica crónica são mais propensos a apresentar sintomas de adicional, não-relacionadas distúrbios de dor pélvica funcionais e transtornos de humor, incluindo a ansiedade, depressão, distúrbios de pânico e 4-6, que tem sido associado com a funcionamento alterado do hipotálamo hipófiseadrenal (HPA) 7-10. A exposição ao estresse precoce ou trauma é um importante fator de risco para o desenvolvimento de anormalidades HPA e síndromes de dor crônica associados 10,11 e, como tal, um subconjunto significativo de pacientes com transtornos de dor pélvica funcionais relatam ter experimentado efeitos adversos da infância, como abuso ou negligência 12-14. Modelos de roedores de separação materna neonatal (SMN), que envolve a remoção os filhotes de suas mães por um determinado período de tempo durante o período de pré-desmame, foram utilizados para as últimas duas décadas a estudar os resultados de estresse precoce. Em geral, a NMS foi mostrada para aumentar a ativação do eixo HPA, e comportamentos de ansiedade semelhante resultantes, afectando directamente a expressão de genes dentro do hipotálamo, bem como perturbando a regulação a jusante a partir de estruturas límbicas 15-18. Perturbação de funcionamento correcto do eixo HPA foi mostrado para contribuir para o aumento da colorrectal 19-22 </sup&gt; Vaginal e 16 sensibilidade apresentada por roedores NMS modelos, mas, apesar de extensa caracterização do efeito a longo prazo de inflamação da bexiga pós-natal 23-25, o impacto do estresse precoce foi amplamente ido unstudied nos órgãos urogenitais. Portanto, o estudo a seguir descrevem como executar NMS em ratos e, posteriormente, avaliar a sensibilidade mecânica perigenital e infiltração de mastócitos / activação na próstata para validar o uso de camundongos machos NMS como um modelo pré-clínico para CP / CPPS. De todos os distúrbios da dor pélvica crônica diagnosticada, CP / CPPS é talvez a síndrome menos bem reconhecido e caracterizado, apesar de ter uma prevalência de cerca de 14% 26 e custos anuais de doentes estimados em 4,400 dólares (o dobro da dor lombar ou artrite artrite 27). Os pacientes com CP relatório / CPPS dor no períneo, reto, próstata, pênis, testículos, e / ou abdômen 28, experimentar um oigher grau de estresse psicológico do que os pacientes de controle 29, e comumente presentes com sintomas de ou são diagnosticados com dor ou transtornos de humor pélvicas crônicas de comorbidade 5,29-31. Infecção recorrente, epitélio com goteiras, inflamação neurogênica, e autoimunidade têm sido imaginado como potenciais causas subjacentes da CP / CPPS 2,32,33, assim como a ativação de mastócitos e degranulation 34. Secreções prostáticas expressa a partir de homens com CP / CPPS tinha aumentado triptase de mastócitos e factor de crescimento do nervo (NGF), os níveis 34, e um estudo mais tarde confirmado que a triptase e carboxipeptidase A (CPA3), um marcador de activação de mastócitos, foram também aumentadas no urina de pacientes com CP / CPPS 35. O papel potencial de mastócitos no início e manutenção da CP / CPPS tem sido um importante foco de pesquisas com animais sobre essa síndrome até agora. O modelo de roedor mais comumente empregado usado para estudar CP / CPPS é uma prostatite auto-imune experimental (EAP) modelo genrado pela injecção subcutânea do antigénio da próstata em adjuvante completo de Freund, o que resulta em graus variados de inflamação prostática dependendo das espécies e estirpes utilizadas 34,36-39. Infiltração de mastócitos e ativação / desgranulação foi mostrado para aumentar após a indução da EAP 34,35,40. Camundongos transgênicos deficientes em ambos os mastócitos 34 ou o receptor tryptase PAR2 35 não desenvolver a sensibilidade tática prostática seguinte EAP, ao contrário de ratos do tipo selvagem EAP. Embora este modelo pré-clínico replica muitas das características de PB humano / CPPS, o protocolo de indução não é indicativo da condição humana, que tem uma etiologia diversa e muitas vezes não envolvem inflamação directa, infecção ou lesão da próstata. A influência do estresse precoce no desenvolvimento de CP / CPPS em seres humanos foi amplamente ido sem investigação; no entanto, um estudo realizado por Hu et al. 41, demonstrou que men que relatou uma história de infância físico, emocional e / ou abuso sexual foram significativamente mais propensos a apresentar sintomas sugestivos de CP / CPPS. Além disso, eles mostraram que tanto a dor e escores urinários foram aumentados em pacientes com história de abuso físico e emocional. Nós já demonstrado que o mesmo paradigma NMS em fêmea C57BL / 6 ratos produz hipersensibilidade vaginal e a expressão do gene anormal tanto na vagina e bexiga sugestivo de HPA disfuncional eixo de saída 16. Esta evidência combinada com a alta prevalência de CP / CPPS pacientes que apresentam outras comorbidades 42, incluindo IC / PBS e transtornos de humor, que foram mais claramente demonstrado que é relacionada com a exposição estresse precoce 12-14, fornece a justificativa para o uso de um modelo NMS para investigar CP / CPPS em camundongos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pregnant C57BL/6 female mice&#160;</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L glass beaker(s)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS10002L</td>
			<td>Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Forced Air Incubator, Basic</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>414005-124</td>
			<td>The incubator should be held at 33&#176;C and 50% humidity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>58011</td>
			<td>The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Enclosure (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>435</td>
			<td>Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>410</td>
			<td>Place stand on a stable table top for comfortable access.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4&#176;C overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>246654</td>
			<td>Chill heptane on dry ice to freeze tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Cryomold&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4557</td>
			<td>To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>12 x 125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Superfrost Plus Micro Slide</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>75 x 25 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198161</td>
			<td>Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate Sterile 50 mL Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>C-3394</td>
			<td>Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-815</td>
			<td>Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Histological)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P</td>
			<td>Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Boxes, 100-Place</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003</td>
			<td>Boxes can be used for storage and transportation of slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Slide Box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-400</td>
			<td>These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Glycerol is a traditional mounting medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium, Richard-Allan Scientific</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4111</td>
			<td>Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48393-106</td>
			<td>A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation

Prostatite crônica / síndrome de dor pélvica crônica (CP / CPPS) tem uma prevalência de 14% e é o diagnóstico urológico mais comum entre homens com idade inferior a 50, no entanto, é a desordem de dor pélvica crônica menos compreendidas e estudadas. Um subconjunto significativo de pacientes com dor pélvica crônica relatório ter experimentado estresse precoce ou abuso, que pode afetar significativamente o funcionamento ea regulação do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA). Activação de mastócitos, que se demonstrou ser aumentada na urina e expresso de secreções prostáticas doentes CP / CPPS, é parcialmente regulado por activação a jusante do eixo HPA. Neonatal separação materna (SMN) tem sido usado por mais de duas décadas a estudar os resultados de estresse precoce em modelos de roedores, incluindo alterações no eixo HPA e sensibilidade visceral. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a utilização NMS como um modelo pré-clínico da CP / CPPS em machos C57BL / 6. Nós descrevemos a metodologiapara a realização de NMS, avaliando a alodinia mecânica perigenital, e evidência histológica de ativação de mastócitos. Nós também fornecemos evidências de que o estresse psicológico precoce pode ter efeitos duradouros sobre o sistema urogenital masculina em ratos.

Os ratos que foram submetidos a NMS mostrou evidências comportamentais indicativo de CP / CPPS. Quando testado com uma série graduada de monofilamentos de von Frey, 8 semanas de idade, ratinhos NMS (n = 4) exibido alodinia mecânica perigenital quando comparado com homólogos naive (n = 5, Figura 2). Isto é evidenciado como uma redução significativa (p &lt;0,01; teste t de Student) no limiar mecânico de retirada que provocou uma resposta comportamental positiva, registrado como um empurr?...

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Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

Estamos medindo a sensibilidade ea ativação de células mastro mecânico perigenital na próstata masculina de camundongos C57BL / 6 que foram submetidos a um paradigma de estresse precoce - separação materna neonatal, de modo a induzir um modelo pré-clínico de síndrome de dor pélvica / crônica prostatite crônica.

Avaliação da Perigenital Sensibilidade e Prostatic Mast Ativação celular em um rato modelo de Separação Materna Neonatal

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

9.2K visualizações.  University of Kansas Medical Center.  Estamos medindo a sensibilidade ea ativação de células mastro mecânico perigenital na próstata masculina de camundongos C57BL / 6 que foram submetidos a um paradigma de estresse precoce - separação materna neonatal, de modo a induzir um modelo pré-clínico de síndrome de dor pélvica / crônica prostatite crônica. 

Vídeo: Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Um modelo do rato de No Utero Transplante

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Medicina

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotão imagem de invasão das células tumorais em um modelo de camundongo ortotópico de carcinoma epidermóide oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

A Swine Model of Neonatal Asphyxia

Annually more than 1 million neonates die worldwide as related to asphyxia. Asphyxiated neonates commonly have multi-organ failure including hypotension, perfusion deficit, hypoxic-ischemic encephalopathy, pulmonary hypertension, vasculopathic enterocolitis, renal failure and thrombo-embolic complications. Animal models are developed to help us understand the patho-physiology and pharmacology of neonatal asphyxia. In comparison to rodents and newborn lambs, the newborn piglet has been proven to be a valuable model. The newborn piglet has several advantages including similar development as that of 36-38 weeks human fetus with comparable body systems, large body size (&tilde;1.5-2 kg at birth) that allows the instrumentation and monitoring of the animal and controls the confounding variables of hypoxia and hemodynamic derangements.
We here describe an experimental protocol to simulate neonatal asphyxia and allow us to examine the systemic and regional hemodynamic changes during the asphyxiating and reoxygenation process as well as the respective effects of interventions. Further, the model has the advantage of studying multi-organ failure or dysfunction simultaneously and the interaction with various body systems. The experimental model is a non-survival procedure that involves the surgical instrumentation of newborn piglets (1-3 day-old and 1.5-2.5 kg weight, mixed breed) to allow the establishment of mechanical ventilation, vascular (arterial and central venous) access and the placement of catheters and flow probes (Transonic Inc.) for the continuously monitoring of intra-vascular pressure and blood flow across different arteries including main pulmonary, common carotid, superior mesenteric and left renal arteries. Using these surgically instrumented piglets, after stabilization for 30-60 minutes as defined by Z&lt;10% variation in hemodynamic parameters and normal blood gases, we commence an experimental protocol of severe hypoxemia which is induced via normocapnic alveolar hypoxia. The piglet is ventilated with 10-15% oxygen by increasing the inhaled concentration of nitrogen gas for 2h, aiming for arterial oxygen saturations of 30-40%. This degree of hypoxemia will produce clinical asphyxia with severe metabolic acidosis, systemic hypotension and cardiogenic shock with hypoperfusion to vital organs. The hypoxia is followed by reoxygenation with 100% oxygen for 0.5h and then 21% oxygen for 3.5h. Pharmacologic interventions can be introduced in due course and their effects investigated in a blinded, block-randomized fashion.

Large animal models have good translational values in the examination of physiology and pharmacology of neonatal asphyxia. Using newborn piglets, we develop an experimental protocol to simulate neonatal asphyxia which has advantages of studying the systemic and regional hemodynamics, oxygen transport with biochemical and pathologic pathways and correlations.

Um Modelo de Suínos de asfixia neonatal

Annually more than 1 million neonates die worldwide as related to asphyxia. Asphyxiated neonates commonly have multi-organ failure including hypotension, ...

A Piglet Model of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the world&#8217;s 2.9 million neonatal deaths. Animal models of HIE have contributed to the understanding of the pathophysiology in HIE, and have highlighted the dynamic process that occur in brain injury due to perinatal asphyxia. Thus, animal studies have suggested a time-window for post-insult treatment strategies. Hypothermia has been tested as a treatment for HIE in pdiglet models and subsequently proven effective in clinical trials. Variations of the model have been applied in the study of adjunctive neuroprotective methods and piglet studies of xenon and melatonin have led to clinical phase I and II trials1,2. The piglet HIE model is further used for neonatal resuscitation- and hemodynamic studies as well as in investigations of cerebral hypoxia on a cellular level. However, it is a technically challenging model and variations in the protocol may result in either too mild or too severe brain injury. In this article, we demonstrate the technical procedures necessary for establishing a stable piglet model of neonatal HIE. First, the newborn piglet (&#60; 24 hr old, median weight 1500 g) is anesthetized, intubated, and monitored in a setup comparable to that found in a neonatal intensive care unit. Global hypoxia-ischemia is induced by lowering the inspiratory oxygen fraction to achieve global hypoxia, ischemia through hypotension and a flat trace amplitude integrated EEG (aEEG) indicative of cerebral hypoxia. Survival is promoted by adjusting oxygenation according to the aEEG response and blood pressure. Brain injury is quantified by histopathology and magnetic resonance imaging after 72 hr.

Hypoxic-ischemic encephalopathy following perinatal asphyxia can be studied using animal models. We demonstrate the procedures necessary for establishing a piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy.

Um Modelo de Leitão Neonatal encefalopatia hipóxico-isquêmica

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

A Neonatal do rato Spinal Cord Injury Compression Modelo

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

A Battery of Motor Tests in a Neonatal Mouse Model of Cerebral Palsy

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, standardized battery of neonatal mouse motor tests. These tests can validate injury or disease models, determine treatment efficacy and/or assess motor behaviors in new transgenic strains. This paper presents a series of neonatal motor tests to evaluate general motor function, including ambulation, hindlimb foot angle, surface righting, negative geotaxis, front- and hindlimb suspension, grasping reflex, four limb grip strength and cliff aversion. Mice between the ages of post-natal day 2 to 14 can be used. In addition, these tests can be used for a wide range of neurological and neuromuscular pathologies, including cerebral palsy, hypoxic-ischemic encephalopathy, traumatic brain injury, spinal cord injury, neurodegenerative diseases, and neuromuscular disorders. These tests can also be used to determine the effects of pharmacological agents, as well as other types of therapeutic interventions. In this paper, motor deficits were evaluated in a novel neonatal mouse model of cerebral palsy that combines hypoxia, ischemia and inflammation. Forty-eight hours after injury, five tests out of the nine showed significant motor deficits: ambulation, hindlimb angle, hindlimb suspension, four limb grip strength, and grasping reflex. These tests revealed weakness in the hindlimbs, as well as fine motor skills such as grasping, which are similar to the motor deficits seen in human cerebral palsy patients.

Presented is a concise battery of mouse neonatal motor tests. Using these tests, neonatal motor deficits can be demonstrated in a variety of neonatal motor disorders. By having a standardized set of tests, results from different studies can be compared, allowing for better and accurate reporting between groups.

Uma bateria de testes de motor em um Neonatal Rato Modelo de Paralisia Cerebral

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Infarto do miocárdio em ratos neonatais, um modelo de regeneração cardíaca

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we demonstrate a murine cryoinjury infarct model that generates precise infarct sizes with high reproducibility and replicability. In brief, after intubation and sternotomy of the animal, the heart is lifted from the thorax. The probe of a handheld liquid nitrogen delivery system is applied onto the myocardial wall to induce cryoinjury. Impaired ventricular function and electrical conduction can be monitored with echocardiography or optical mapping. Transmural myocardial remodeling of the infarcted area is characterized by collagen deposition and loss of cardiomyocytes. Compared to other models (e.g., LAD-ligation), this model utilizes a handheld liquid nitrogen delivery system to generate more uniform infarct sizes.

This article demonstrates a model to study cardiac remodeling after myocardial cryoinjury in mice.

Um modelo Crioferimento para estudar infarto do miocárdio no mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Um modelo de rato BALB/c neonatal de Enterocolite Necrotizante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight ...