Name: assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation
Uploaded: 2015-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
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The authors would like to thank Janelle Ryals, Rachel Supple, and Frank Wang for technical assistance. This work was supported by NIH grants R03 DK080182 (JAC), R01 DK099611 (JAC), R01 DK103872 (JAC), Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) grant P20 GM104936 (JAC), start-up funds and core support from the Kansas Institutional Development Award (IDeA) P20 GM103418, core support from the Kansas IDDRC P30 HD002528, and The Madison and Lila Self Fellowship Program (ANP).

このプロトコルで説明されているすべての実験は、カンザスメディカルセンター制度動物実験委員会の大学で指定されたガイドラインに従ってNIHガイドラインに準拠しています。 1.新生児母子分離（NMS） <ol><li>ごみの出生のために毎日妊娠ダムを監視します。 注：ゴミが生まれた日はP0と考えられています。 </li><li> P1には、ホームケージからダムを削除し、クリーンな二次容器内に配置します。 </li><li>ホームケージの香りを維持するために、クリーン手袋をはめた手の間のベッドのほんの一握りをこします。 </li><li>きれいな、適切に標識された2リットルのガラス製ビーカーにホームケージ寝具2cmの1 - 1の深さを追加します。ガラスビーカーに、ホームケージ内に存在する任意の追加の濃縮寝具材料、 例えば、nestlet、クリンクル紙の約半分を追加します。 </li><li>静か同じビーカーに、個別に、単一のごみから仔のすべてを配置します。 </li><li>すぐに場所インキュベーター中でビーカーを180分間、33 O Cおよび50％の湿度で開催されました。 </li><li>第2の容器からダムを外し、ホームケージに彼女を返します。ビバリウム内での適切な住宅の場所にホームケージを返します。 </li><li>各リットル/ダムのために清潔な手袋と二コンテナを使用して、NMSを受けて、各ごみについて、この手順を繰り返します。 </li><li> 180分の分離時間の終わりに、それらを除去したのと同じ順序でそれらのホームケージにリターを返します。 </li><li>以前の日に分離した最初のごみのホームケージを取得します。ホームケージからダムを取り外し、きれいな二次容器内に配置します。 </li><li>インキュベーターから第1のビーカーを削除し、子犬の処理中にホームケージの香りを維持するために、きれいな手袋をはめた手の間のベッドのほんの一握りをこします。 </li><li>静かにビーカーからホームケージに、個別に、子犬を移動します。 </li><li>のビーカーに残っている濃縮および寝具を返しますホームケージ。 </li><li>ホームケージに第2の容器からダムを返し、ビバリウム内の適切な住宅の場所に戻してください。 </li><li>水でビーカーをすすぎ、インキュベーターに戻します。分離手順を通して各ごみに同じビーカーを使用してください。 </li><li>彼らはインキュベーターに入れたのと同じ順序でNMSを受けて、各ごみについて、この手順を繰り返します。 </li><li>各リター受けるNMS P21を介して、毎日のために、この手順全体を繰り返します。 </li><li>食料と水との完全なクリーンケージに一緒に同性の同腹仔を配置することによって、P22のNMSとナイーブ子犬を離乳させます。ナイーブ仔が生まれ、収容されたNMSマウスと同様の条件ではなく、通常の畜産タスクの外で追加の取り扱いを受けるべきではありません。 </li></ol> 2. Perigenital機械的感受性<ol><li>フォン·フレイ装置のセットアップ<ol><li>試験室にマウスを持参し、それらを30順応することができます分は、ホームケージのまま。 </li><li>研究者は、マウス、高さ約55センチ驚くべきことなく、下側から接近できるようにするために十分なスペースを提供して上昇したワイヤーメッシュトップ·テーブル（79​​センチメートル×28センチ）の下に、吸収性アンダーパッドを配置することにより、テスト領域を準備します。 </li><li>ワイヤーメッシュテーブルの上に透明な、穿孔プラスチックチャンバー（12センチ×5センチメートル×3.5 cm）の下で、個別に、12匹まで入れます。逃げるのマウスを防止するために、チャンバーの上に重い物を配置します。 </li><li>離脱閾値の評価に先立って、画面上でさらに30分間、マウスを順応させます。 </li></ol></li><li> Perigenital機械的感受性評価<ol><li>傾斜のvon Freyモノフィラメント43の標準セットを使用して、アップダウンの方法を実行します。 1.65グラム、2.36グラム、2.83グラム、3.22グラム、3.61グラム、4.08グラム、4.31グラム、および4.74グラム以下のモノフィラメントを使用します。 <ol><li> 3.22グラムモノフィラメントのベースを持ち、後退モノを公開フィラメント。 注：一部のモデルでは、退避モノフィラメントがない場合があります。 </li><li>モノフィラメントが垂直に配向されるようにプローブを置くとマウスは、警告不動であり、その体重は後足の間で均等に分散されたときに、わずかになるまで、正中線を避け、陰嚢の左側または右側のいずれかに適用します曲げフィラメントで観察されます。 </li><li> 10秒間、または動物が陽性反応を示すまで、所​​定の位置にモノフィラメントを保持します。 注：正の応答がモノフィラメントアプリケーションまたは舐めるまたはモノフィラメントに向け痛烈な行動に応じて、活発なジャークまたはジャンプであると考えられています。これらの動作を表示せずに10秒モノフィラメントアプリケーションの間マウスが移動した場合、モノフィラメントは、最小1分、長い休止期間後の再テストする必要があります。マウスはどちらも移動でも10秒モノフィラメント中に記載されているアプリケーションの挙動上記のいずれかを示す場合には、否定応答とみなされます。 </li><html><li>実験ノートまたはラップトップに、正または負のいずれか、応答を記録し、3.22グラムのモノフィラメントを用いて、残りのマウスのすべてでこの手順を繰り返します。 </li><li>再び次の適切なモノフィラメントを用いて、全てのマウスをテストします。注：マウスは3.22グラムモノフィラメントに負の応答を示した場合は、同様にして3.61グラムのモノフィラメントを適用し、応答を記録します。マウスは3.22グラムモノフィラメントに陽性反応を示した場合は、2.83グラムのモノフィラメントを適用し、応答を記録します。 </li></ol></li><li>最初の陽性反応が観察された後、さらに4アプリケーションのために、必要に応じて、次に大きいか小さいモノフィラメントを用いて、各マウスのテストを続行。 </li><li>ホームケージにマウスを返します。 </li><li> Chaplan ら 43に記載されているように、50％のG引っ込め閾値を計算するためにログ単位で裁判シリーズに適用され、最終のvon Freyモノフィラメントの値を使用してください。 </li></ol></li></ol>タイトル &quot;&gt; 3。酸性化トルイジンブルーマスト細胞染色<ol><li>組織処理<ol><li>心臓内の氷冷4％パラホルムアルデヒド45で灌流されたマウスからの前立腺組織44を解剖。 PostfixのRTで1時間、4％パラホルムアルデヒド中で組織した後、4°CO / Nに1×PBS中30％スクロース中cryoprotect。 </li><li>ヘプタンの小さい（30ミリリットル）バスを準備し、ドライアイス上に置きます。 </li><li> 1×PBS中の前立腺組織をすすぎ、軽量ワイプ使用して乾燥させます。 </li><li>それが凍結されるまで冷ヘプタンに前立腺組織を挿入します。 </li><li>凍結まで直ちにドライアイス上に取り付けるメディアと場所を含むcryomoldで凍結前立腺組織を配置します。 </li><li>ストアを-20℃でcryomolds。 </li><li>横クライオスタットを用いて、7ミクロンの厚さの凍結切片に前立腺組織を切断します。 </li><li>正に帯電した顕微鏡スライド上に、組織の長さに及ぶ12の非連続凍結切片 - 8を配置します。 </li><li>ストアは、さらなる処理まで-20℃でスライドを終えました。 </li></ol></li><li>酸性化トルイジンブルーの準備<ol><li> 1％ストック溶液を調製し、溶液中まで100ミリリットルの70％エタノールと渦にトルイジンブルーO 1gを加えます。ストック溶液は、最大3週間室温で保存することができます。 </li><li>撹拌プレートの上に置いたビーカーに100mlの水に1グラムのNaClを加えます。 </li><li> 1.0が達成される - 0.5のpH範囲をするまで12 M HClを用いてNaCl溶液のpHを調整します。 </li><li>トルイジンブルーストック溶液8mlの1％NaCl溶液32 mlで組み合わせることによって、0.25％トルイジンブルー使用液を調製します。トルイジンブルーストック溶液の総取り込みを確保し、ボルテックスを用いて混合するために上下にピペット。作業溶液は、新たに作製し、使用後に廃棄しなければなりません。 </li></ol></li><li>前立腺凍結切片を染色<ol><li>冷凍庫から処理対象のスライドを削除し、約30メートルを室温に平衡化することを可能にしますです。 </li><li>個々のスライドに取り付けられた組織切片を完全に水没されることを保証するために、1×PBSの十分な量を含む50 mLのコニカルチューブに約1秒間スライドを浸漬することにより組織切片を洗浄します。スライドをペーパータオル上で空気乾燥することができます。 </li><li> 15 rpmで設定プラットフォームロッカー上ながら15分 - スライドに取り付けられた組織切片が完全に水没されていることを確認し、10インキュベートするのに十分な0.25％の作業トルイジンブルー溶液を含むガラス染色ジャーに入れスライド。 </li><li>ディップは、過剰なトルイジンブルーを洗い流すために、約1秒間、1×PBS中でスライドします。 </li><li>スライドは、排水を可能にするために彼らの側にあるような方法でスライドボックスやラックにスライドを置きます。 </li><li> 2時間または室温でO / Nの最低37℃のオーブンでスライドを乾燥させます。 </li><li>スライドはアルコール露光間の完全に乾燥させ、アルコールを使用して、迅速にスライドを脱水。ペーパータオルAに排出することによってドライスライドND軽量で拭い背中とエッジが拭いてください。 <ol><li>約1秒間95％エタノールでスライドを浸し、完全に乾燥することができます。組織が紫より青乾くまで10回 - この手順1を繰り返します。 </li><li>約1秒間100％エタノールでスライドを浸し、完全に乾燥することができます。組織は、中青に濃いが、紫色でなくなるまで10回 - この手順1を繰り返します。 </li></ol></li><li> 3分間、100％キシレン中でスライドをインキュベートすることによって汚れを修正しました。乾燥することができます。 </li><li>グリセロール、PBS、またはキシレン系永久マウント培地でスライドをカバースリップ。 RTで余分なメディアや店舗を排出します。 </li></ol></li><li>マスト細胞の定量化<ol><li>光学顕微鏡（ 図2）を用いて20X倍率でトルイジンブルー染色した組織切片を視覚化。 </li><li>可視化領域内に存在するマスト細胞の合計数をカウントし、非脱顆粒および脱顆粒マスト細胞を区別。 40Xのマニフィカイオンはいくつかのマスト細胞における造粒状態を確認する必要があるかもしれません。 注：非脱顆粒肥満細胞は、核の輪郭および/または細胞の周囲の無顆粒押出ないか、かすかに密な異染性を示します。脱顆粒肥満細胞は、あまり強く異染性を示し、細胞質内およびセル境界の外核および/または遊離顆粒の明らかな明確な輪郭を持っています。 </li><li>現在の組織切片の全体が非脱顆粒および脱顆粒肥満細胞の総数を評価し続けています。長さを各組織にまたがる、少なくとも7追加の別のセクションでこの手順を繰り返します。 </li><li>以下の式に従って各組織/マウスの合計肥満細胞の脱顆粒（DG）の割合を計算し（DGマスト細胞/総肥満細胞）×100。 </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

このプロトコルは、成体雄マウスにCP / CPPSを示す症状を誘導するために、NMSの形で、新生児のストレスを使用するための方法を提供します。大人として、NMSマウスはかなりのperigenital機械的異痛、ならびに前立腺組織における肥満細胞の脱顆粒の証拠が表示されます。 NMSを使用すると、として、それは多くの場合、慢性骨盤痛12-14の患者によって報告された初期の生活上のストレスを...

慢性骨盤痛自体は病気ではなく、過敏性腸症候群（IBS）と診断された患者が経験した継続的な自発的および/または誘発痛、間​​質性膀胱炎/膀胱痛症候群（IC / PBS）、外陰部痛に関連した用語、または慢性前立腺炎/慢性骨盤痛症候群（CP / CPPS）。これらの症候群は、機能不全が、免疫系、中枢神経系および末梢神経内のシステムは、これらの疾患1の維持および進行に寄与することが示されているが、彼 ​​らは、いかなる関連する病状または同定根底にある病因を持っていない多くの場合、合併され、その中に多くの特徴を共有します-3。慢性骨盤痛を有する患者は、視床の変更された機能に関連付けられている不安、うつ病、パニック障害4-6を含む追加の非骨盤に関連する機能性疼痛障害および気分障害の症状で存在する可能性が高いです下垂体副腎（HPA）軸7-10。初期生活ストレスやトラウマへの暴露がHPAの異常と関連する慢性疼痛症候群10,11と、などを開発するための重要な危険因子であり、機能性骨盤痛障害を有する患者のかなりの部分集合は、虐待やネグレクトなどの有害幼年期の事象を経験したと報告します12-14。 離乳前の期間に設定された時間のために彼らのダムから子犬を除去することを含む、新生児母体の分離（NMS）のげっ歯類モデルは、初期の生活上のストレスの成果を研究するために過去20年間のために使用されています。一般に、NMSは、直接視床下部内での遺伝子発現に影響を与えるだけでなく、辺縁構造15-18から下流調節を破壊することによって、HPA軸の活性化、及び得られた不安様行動を増加させることが示されています。適切なHPA軸機能の破壊が増加大腸19-22に寄与することが示されています</sup&gt;と膣16の感度は、げっ歯類NMSモデルによって表示されますが、出生後の膀胱炎23-25 ​​の長期的な効果の大規模な特性評価にもかかわらず、早期の生活上のストレスの影響は、主に尿生殖器官で自然と口から出た行ってきました。そのため、以下の研究は、マウスにおけるNMSを実行し、それ以降のCP / CPPSのための前臨床モデルとしての雄NMSマウスの使用を検証するために、前立腺にperigenital機械的感度および肥満細胞の浸潤/活性化を評価する方法について説明します。 診断慢性骨盤疼痛性障害のすべての、CP / CPPSは、おそらく最もよく認識し、シンドロームを特徴とする、約14〜26％の生涯有病率を有し、4400ドルで推定年間患者のコストにもかかわらず、（その倍腰痛やリウマチの関節炎27）。 CP / CPPS報告会陰部の痛み、直腸、前立腺、陰茎、睾丸、および/ ​​または腹部28の患者は、ハイテクを体験しますgher対照患者よりも心理的ストレス度29、およびまたは症状と共通して存在が併存する慢性骨盤痛や気分障害5,29-31と診断されています。再発感染、漏れやすい上皮、神経性炎症、および自己免疫は、すべての潜在的な基礎となるCP / CPPS 2,32,33の原因だけでなく、肥満細胞の活性化および脱顆粒34として推測されてきました。 CP / CPPS有する男性から発現前立腺分泌物は、マスト細胞トリプターゼおよび神経成長因子（NGF）のレベル34が増加した、後の研究では（CPA3）のトリプターゼおよびカルボキシペプチダーゼことが確認され、マスト細胞活性化のマーカーもで増加しましたCP / CPPS患者35の尿。 CP / CPPSの発症と維持に肥満細胞の潜在的な役割は、これまでにこの症候群の動物研究の主要な焦点となっています。 CP / CPPSを研究するために使用される最も一般的に用いられる齧歯類モデルは、実験的自己免疫性前立腺炎（EAP）モデルGENです34,36-39使用される種および株に依存前立腺の炎症の多様度になり、完全フロイントアジュバント、前立腺抗原の皮下注射によってerated。マスト細胞の浸潤および活性化/脱顆粒は、EAP 34,35,40の次の誘導を増加させることが示されています。マスト細胞34またはトリプターゼ受容体PAR2 35のいずれかを欠損したトランスジェニックマウスは、野生型EAPマウスとは異なり、EAP次の前立腺戦術感度を開発することはありません。この前臨床モデルがヒトのCP / CPPSの特徴の多くを複製しながら、誘導プロトコールは、多様な病因を持っており、多くの場合、直接炎症、感染、または前立腺の傷害を伴わない人間の状態、を示すものではありません。 ヒトでのCP / CPPSの開発に初期の生活上のストレスの影響は、主に未調査行ってきました。しかし、胡ら 41による研究では、私のことを実証しましたN人は、物理的、感情的、および/または性的虐待の子供時代の歴史は、CP / CPPSを示唆する症状を経験する可能性が有意に高かったと報告しました。さらに、彼らは痛みや尿のスコアの両方が物理的および精神的虐待の既往歴のある患者において増加していることが示されました。我々は以前の雌C57BL / 6マウスは、膣および機能不全HPA軸出力16の両方を示唆する膀胱内、膣過敏症および異常な遺伝子発現を生成するのと同じNMSパラダイムことを実証しました。より明確に初期生活ストレス暴露12-14と関連していることが示されているIC / PBSおよび気分障害を含む他の併存疾患42、と提示CP / CPPS患者の有病率が高いと組み合わせてこの証拠は、使用するための理論的根拠を提供しますNMSモデルは、マウスにおけるCP / CPPSを調査します。

<table><tbody><tr><td>Pregnant C57BL/6 female mice&amp;nbsp;</td><td>Charles River</td><td>027</td><td>Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.</td></tr><tr><td>2 L glass beaker(s)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS10002L</td><td>Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.</td></tr><tr><td>VWR Forced Air Incubator, Basic</td><td>VWR International</td><td>414005-124</td><td>The incubator should be held at 33&amp;deg;C and 50% humidity.</td></tr><tr><td>Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)</td><td>Stoelting</td><td>58011</td><td>The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.</td></tr><tr><td>Animal Enclosure (12 mice 6 rats)</td><td>IITC</td><td>435</td><td>Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)</td><td>IITC</td><td>410</td><td>Place stand on a stable table top for comfortable access.</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td>Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4&amp;deg;C overnight.</td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246654</td><td>Chill heptane on dry ice to freeze tissue.</td></tr><tr><td>Standard Cryomold&amp;nbsp;</td><td>VWR International</td><td>4557</td><td>To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>12 x 125 ml</td></tr><tr><td>VWR Superfrost Plus Micro Slide</td><td>VWR International</td><td>48311-703</td><td>75 x 25 x 1 mm</td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198161</td><td>Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.</td></tr><tr><td>Ethanol, Absolute (200 Proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td>Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.</td></tr><tr><td>GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes&amp;nbsp;</td><td>BioExpress</td><td>C-3394</td><td>Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.</td></tr><tr><td>Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-815</td><td>Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.</td></tr><tr><td>Xylenes (Histological)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P</td><td>Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.</td></tr><tr><td>Microscope Slide Boxes, 100-Place</td><td>VWR International</td><td>82003</td><td>Boxes can be used for storage and transportation of slides.</td></tr><tr><td>Fisherbrand Microscope Slide Box</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-400</td><td>These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Glycerol is a traditional mounting medium.</td></tr><tr><td>Mounting Medium, Richard-Allan Scientific</td><td>VWR International</td><td>4111</td><td>Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.</td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1</td><td>VWR International</td><td>48393-106</td><td>A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.</td></tr><tr><td>Light Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation

慢性前立腺炎/慢性骨盤痛症候群（CP / CPPS）14％の生涯有病率を持っており、50歳未満の男性のための最も一般的な泌尿器科診断である、まだそれは少なくとも、慢性骨盤痛障害を理解し、研究しています。著しく視床下部 - 下垂体 - 副腎（HPA）軸の機能および調節に影響を与える可能性が初期生活ストレスや虐待を経験した慢性骨盤痛の報告、患者のかなりの部分集合。両方の尿中で増加することが示されており、CP / CPPS患者の前立腺分泌物を発現しているマスト細胞の活性化は、部分的にHPA軸の下流の活性化によって調節されます。新生児母性分離（NMS）は、HPA軸と内臓感度の変更を含む、齧歯類モデルで初期生活ストレスの成果を研究するために20年以上前から使用されてきました。ここでは、雄のC57BL / 6マウスにおいて、CP / CPPSの前臨床モデルとしてNMSを使用するための詳細なプロトコルを提供します。我々は、方法論を記述しますNMSを行うため、perigenital機械的異痛症、及び肥満細胞の活性化の組織学的証拠を評価します。また、初期の心理的ストレスがマウスにおいて男性の泌尿生殖器系の長期的な効果を持つことができるという証拠を提供します。

NMSを受けたマウスは、CP / CPPSを示す行動の証拠を示しました。フォン·フレイモノフィラメント、8週齢のマウスNMS一連の段階的に試験した場合（N = 4）ナイーブ対応物と比較した場合、perigenital機械的異痛を表示（N = 5、 図2）。モノフィラメントに向けモノフィラメントアプリケーションまたは舐めるまたはかむ行動に応じて、活発なジャークまたはジャンプとして記録、正の?...

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Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

慢性前立腺炎/慢性骨盤痛症候群の前臨床モデルを誘導するために、新生児の母体の分離 - 私たちは、初期生活ストレスパラダイムを受けた雄のC57BL / 6マウスの前立腺におけるperigenital機械的感度および肥満細胞の活性化を測定しています。

新生児母子分離のマウスモデルにおけるPerigenital感度と前立腺肥満細胞の活性化の評価

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

9.2K ビュー.  University of Kansas Medical Center. 慢性前立腺炎/慢性骨盤痛症候群の前臨床モデルを誘導するために、新生児の母体の分離 - 私たちは、初期生活ストレスパラダイムを受けた雄のC57BL / 6マウスの前立腺におけるperigenital機械的感度および肥満細胞の活性化を測定しています。 

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Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors. Using animal models to accomplish this goal, many methodological strategies require invasive techniques to manipulate the intensity of the behavior of interest (e.g., lesion methods, pharmacological manipulations, microdialysis techniques, genetically-engineered animal models). The utilization of a comparative species approach allows researchers to take advantage of naturally occurring differences in response strategies existing in closely related species. In our lab, we use two species of the Peromyscus genus that differ in paternal responses. The male California deer mouse (Peromyscus californicus) exhibits the same parental responses as the female whereas its cousin, the common deer mouse (Peromyscus maniculatus) exhibits virtually no nurturing/parental responses in the presence of pups. Of specific interest in this article is an exploration of the neurobiological factors associated with the affiliative social responses exhibited by the paternal California deer mouse. Because the behavioral neuroscience approach is multifaceted, the following key components of the study will be briefly addressed: the identification of appropriate species for this type of research; data collection for behavioral analysis; preparation and sectioning of the brains; basic steps involved in immunocytochemistry for the quantification of vasopressin-immunoreactivity; the use of neuroimaging software to quantify the brain tissue; the use of a microsequencing video analysis to score behavior and, finally, the appropriate statistical analyses to provide the most informed interpretations of the research findings.

The comparative species approach allows behavioral neuroscientists to explore various neurobiological factors associated with specific behaviors viewed as characteristic of a specific animal model. Taking advantage of naturally occurring differences in behavior between closely related species, this technique doesn&#x2019;t require invasive techniques to manipulate the expression of the behavior.

父親の応答の神経生物学を調査するための比較種のアプローチを使用する

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors.  Using animal models to accomplish ...

神経科学

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently shown that UPEC have an important role in the initiation of chronic pelvic pain2, a feature of Chronic prostatitis/Chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS)3,4. Infection of the prostate by clinically relevant UPEC can initiate and establish chronic pain through mechanisms that may involve tissue damage and the initiation of mechanisms of autoimmunity5.
A challenge to understanding the pathogenesis of UPEC in the prostate is the relative inaccessibility of the prostate gland to manipulation. We utilized a previously described intraurethral infection method6 to deliver a clinical strain of UPEC into male mice thereby establishing an ascending infection of the prostate. Here, we describe our protocols for standardizing the bacterial inoculum7 as well as the procedure for catheterizing anesthetized male mice for instillation of bacteria.
CP/CPPS is primarily characterized by the presence of tactile allodynia4. Behavior testing was based on the concept of cutaneous hyperalgesia resulting from referred visceral pain8-10. An irritable focus in visceral tissues reduces cutaneous pain thresholds allowing for an exaggerated response to normally non-painful stimuli (allodynia). Application of normal force to the skin result in abnormal responses that tend to increase with the intensity of the underlying visceral pain. We describe methodology in NOD/ShiLtJ mice that utilize von Frey fibers to quantify tactile allodynia over time in response to a single infection with UPEC bacteria.

Infection of the prostate may be a contributing factor in mediating pelvic pain in chronic prostatitis. We describe the procedure for preparation of standardized bacterial inoculum, instillation of bacteria into the urethra of male mice and methodology for measuring tactile allodynia in mice over time.

細菌性前立腺炎のマウスモデルにおける接触性アロディニアの測定

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

免疫・感染学

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

マウス新生児から保護免疫表現と機能皮質ミクログリアの分離

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain perception in rodents. Withdrawal thresholds can be measured first at baseline and then following drug, venom, injury, allergen,&#160;or otherwise evoked inflammation by applying an accurate force on very specific areas of the skin. An electronic von Frey apparatus allows precise assessment of mouse hind paw withdrawal thresholds that are not limited by the available filament sizes in contrast to classical von Frey measurements. The ease and rapidity of measurements allow for incorporation of assessment of tactile sensitivity outcomes in diverse models of rapid-onset inflammatory and neuropathic pain as multiple measurements can be taken within a short time period. Experimental measurements for individual rodent subjects can be internally controlled against individual baseline responses and exclusion criteria easily established to standardize baseline responses within and across experimental groups. Thus, measurements using an electronic von Frey apparatus represent a useful modification of the well-established classical von Frey filament-based assays for rodent mechanical allodynia that may also be applied to other nonhuman mammalian models.

Electronic von Frey measurements are an effective and improved alternative to classical von Frey filaments, as they allow rapid and precise measurement of changes in rodent mechanical withdrawal thresholds to continuously applied pressure stimuli before and after an inflammatory event.

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain ...

Using a Murine Model of Psychosocial Stress in Pregnancy as a Translationally Relevant Paradigm for Psychiatric Disorders in Mothers and Infants

The peripartum period is considered a sensitive period where adverse maternal exposures can result in long-term negative consequences for both mother and offspring, including the development of neuropsychiatric disorders. Risk factors linked to the emergence of affective dysregulation in the maternal-infant dyad have been extensively studied. Exposure to psychosocial stress during pregnancy has consistently emerged as one of the strongest predictors. Several rodent models have been created to explore this association; however, these models rely on the use of physical stressors or a limited number of psychosocial stressors presented in a repetitive fashion, which do not accurately capture the type, intensity, and frequency of stressors experienced by women. To overcome these limitations, a chronic psychosocial stress (CGS) paradigm was generated that employs various psychosocial insults of different intensity presented in an unpredictable fashion. The manuscript describes this novel CGS paradigm where pregnant female mice, from gestational day 6.5 to 17.5, are exposed to various stressors during the day and overnight. Day stressors, two per day separated by a 2 h break, range from exposure to foreign objects or predator odor to frequent changes in bedding, removal of bedding, and cage tilting. Overnight stressors include continuous light exposure, changing cage mates, or wetting bedding. We have previously shown that exposure to CGS results in the development of maternal neuroendocrine and behavioral abnormalities, including increased stress reactivity, the emergence of fragmented maternal care patterns, anhedonia, and anxiety-related behaviors, core features of women suffering from perinatal mood and anxiety disorders. This CGS model, therefore, becomes a unique tool that can be used to elucidate molecular defects underlying maternal affective dysregulation, as well as trans-placental mechanisms that impact fetal neurodevelopment and result in negative long-term behavioral consequences in the offspring.

The chronic psychosocial stress (CGS) paradigm employs clinically relevant stressors during pregnancy in mice to model psychiatric disorders of mothers and infants. Here, we provide a step-by-step procedure of applying the CGS paradigm and downstream assessments to validate this model.

母親と乳児の精神疾患に対する翻訳的に関連するパラダイムとしての妊娠における心理社会的ストレスのマウスモデルの使用

The peripartum period is considered a sensitive period where adverse maternal exposures can result in long-term negative consequences for both mother and ...

行動学

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

新生児マウス脊髄圧縮損傷モデル

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

医学

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse polymicrobial sepsis can be induced by injecting cecal slurry intraperitoneally into day of life 7 mice and monitoring them for the following week. Presented here are the detailed steps necessary for the implementation of this neonatal sepsis model. This includes making a homogeneous cecal slurry stock, diluting it to a weight- and litter-adjusted dose, an outline of the monitoring schedule, and a definition of observed health categories used to define humane endpoints. The generation of a homogeneous cecal slurry stock from pooled donors allows for the administration into many litters over time, reducing the variation between donors, and preventing the use of potentially toxic glycerol. The monitoring strategy used allows for the anticipation of survival outcome and the identification of mice that would later progress to death, allowing for an earlier identification of the humane endpoint. Two main behavioral features are used to define the health scores, namely, the ability of the neonatal mice to right themselves when placed on their back and their level of mobility. These criteria could potentially be applied to address humane endpoints in other studies of neonatal disease in mice, as long as a pilot study is performed to confirm accuracy. In conclusion, this approach provides a standardized method to model newborn sepsis in mice, while providing resources to assess animal welfare used to define early humane endpoints for challenged animals.

This protocol provides the necessary steps to establish and evaluate neonatal sepsis in 7-day-old mice.

新生児モデル敗血症マウスの制御モデル

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing enterocolitis (NEC). However, a mechanistic link between these two conditions remains yet to be discovered. We have adopted a murine model of chorioamnionitis involving lipopolysaccharide (LPS)-induced fetal exposure to maternal inflammation (FEMI). This model of FEMI induces a sterile maternal, placental, and fetal inflammatory cascade, which is also present in many cases of clinical chorioamnionitis. Although models exist that utilize live bacteria and more accurately mimic the pathophysiology of an ascending infection resulting in chorioamnionitis, these methods may cause indirect effects on development of the immature intestinal tract and the associated developing microbiome. Using this protocol, we have demonstrated that LPS-induced FEMI results in a dose-dependent increase in pregnancy loss and preterm birth, as well as disruption of normal intestinal development in offspring. Further, we have demonstrated that FEMI significantly increases intestinal injury and serum cytokines in offspring, while simultaneously decreasing goblet and Paneth cells, both of which provide a first line of innate immunity against intestinal inflammation. Although a similar model of LPS-induced FEMI has been used to model the association between chorioamnionitis and subsequent abnormalities of the central nervous system, to our knowledge, this protocol is the first to attempt to elucidate a mechanistic link between chorioamnionitis and later perturbations in intestinal development as a potential link between chorioamnionitis and NEC.

We developed a model of chorioamnionitis to simulate fetal exposure to maternal inflammation (FEMI) without complications of live organisms to examine the effects of FEMI on development of the offspring&#8217;s intestinal tract. This allows for study of mechanistic causes for development of intestinal injury following chorioamnionitis.

新生児腸管の発達に及ぼす急性絨毛膜炎の影響を研究する母体炎症への胎児暴露のマウスモデル

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Generating a Reproducible Model of Mid-Gestational Maternal Immune Activation using Poly(I:C) to Study Susceptibility and Resilience in Offspring

Maternal immune activation (MIA) during pregnancy is consistently linked to increased risk of neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders in offspring. Animal models of MIA are used to test causality, investigate mechanisms, and develop diagnostics and treatments for these disorders. Despite their widespread use, many MIA models suffer from a lack of reproducibility and almost all ignore two important aspects of this risk factor: (i) many offspring are resilient to MIA, and (ii) susceptible offspring can exhibit distinct combinations of phenotypes. To increase reproducibility and model both susceptibility and resilience to MIA, the baseline immunoreactivity (BIR) of female mice before pregnancy is used to predict which pregnancies will result in either resilient offspring or offspring with defined behavioral and molecular abnormalities after exposure to MIA. Here, a detailed method of inducing MIA via intraperitoneal (i.p.) injection of the double stranded RNA (dsRNA) viral mimic poly(I:C) at 12.5 days of gestation is provided. This method induces an acute inflammatory response in the dam, which results in perturbations in brain development in mice that map onto similarly impacted domains in human psychiatric and neurodevelopmental disorders (NDDs).

Generating a Reproducible Model of Mid-Gestational Maternal Immune Activation using PolyI:C to Study Susceptibility and Resilience in Offspring

Maternal infection is a risk factor for neurodevelopmental disorders. Mouse models of maternal immune activation (MIA) may elucidate infection's impact on brain development and function. Here, general guidelines and a procedure are provided to produce reliably resilient and susceptible offspring exposed to MIA.

ポリ(I:C)を用いた妊娠中期の母体免疫活性化の再現モデルの生成による子孫の感受性と回復力の研究

Maternal immune activation (MIA) during pregnancy is consistently linked to increased risk of neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders in ...

<meta charset="utf8"></head><body>早期産後疼痛研究のための早産ラットモデルの作成

A Preterm Rat Model for Pain Studies

This research delves into the consequences of consistent pinprick stimulation on preterm offspring to ascertain its long-term implications for pain sensitivity. The primary objective of this protocol was to investigate the impact of neonatal pinprick stimuli on the pain threshold in the later stages of life using a preterm rat model. By establishing this model, we aim to advance the research on understanding and managing early postnatal pain associated with prematurity. The findings of this study indicate that while the baseline thresholds to mechanical stimuli remained unaffected, there was a notable increase in mechanical hypersensitivity following complete Freund's adjuvant (CFA) injection in adult rats. Interestingly, compared with male rats, female rats demonstrated heightened inflammatory hypersensitivity. Notably, maternal behavior, the weight of the litters, and the growth trajectory of the offspring remained unchanged by the stimulation. The manifestation of altered nociceptive responses in adulthood after neonatal painful stimuli could be indicative of changes in sensory processing and the functioning of glucocorticoid receptors. However, further research is needed to understand the underlying mechanisms involved and to develop interventions for the consequences of prematurity and neonatal pain in adults.

<meta charset="utf8"></head><body>疼痛研究のための早産ラットモデル

Here, we present a concise protocol for creating a preterm rat model, facilitating research on early postnatal pain management. The method involves performing a cesarean section three days before the expected birth, extracting preterm rat pups via hysterectomy, and integrating them with the biological offspring of a surrogate dam.

疼痛研究のための早産ラットモデル

This research delves into the consequences of consistent pinprick stimulation on preterm offspring to ascertain its long-term implications for pain ...