The authors would like to thank Janelle Ryals, Rachel Supple, and Frank Wang for technical assistance. This work was supported by NIH grants R03 DK080182 (JAC), R01 DK099611 (JAC), R01 DK103872 (JAC), Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) grant P20 GM104936 (JAC), start-up funds and core support from the Kansas Institutional Development Award (IDeA) P20 GM103418, core support from the Kansas IDDRC P30 HD002528, and The Madison and Lila Self Fellowship Program (ANP).

このプロトコルで説明されているすべての実験は、カンザスメディカルセンター制度動物実験委員会の大学で指定されたガイドラインに従ってNIHガイドラインに準拠しています。 1.新生児母子分離（NMS） <ol><li>ごみの出生のために毎日妊娠ダムを監視します。 注：ゴミが生まれた日はP0と考えられています。 </li><li> P1には、ホームケージからダムを削除し、クリーンな二次容器内に配置します。 </li><li>ホームケージの香りを維持するために、クリーン手袋をはめた手の間のベッドのほんの一握りをこします。 </li><li>きれいな、適切に標識された2リットルのガラス製ビーカーにホームケージ寝具2cmの1 - 1の深さを追加します。ガラスビーカーに、ホームケージ内に存在する任意の追加の濃縮寝具材料、 例えば、nestlet、クリンクル紙の約半分を追加します。 </li><li>静か同じビーカーに、個別に、単一のごみから仔のすべてを配置します。 </li><li>すぐに場所インキュベーター中でビーカーを180分間、33 O Cおよび50％の湿度で開催されました。 </li><li>第2の容器からダムを外し、ホームケージに彼女を返します。ビバリウム内での適切な住宅の場所にホームケージを返します。 </li><li>各リットル/ダムのために清潔な手袋と二コンテナを使用して、NMSを受けて、各ごみについて、この手順を繰り返します。 </li><li> 180分の分離時間の終わりに、それらを除去したのと同じ順序でそれらのホームケージにリターを返します。 </li><li>以前の日に分離した最初のごみのホームケージを取得します。ホームケージからダムを取り外し、きれいな二次容器内に配置します。 </li><li>インキュベーターから第1のビーカーを削除し、子犬の処理中にホームケージの香りを維持するために、きれいな手袋をはめた手の間のベッドのほんの一握りをこします。 </li><li>静かにビーカーからホームケージに、個別に、子犬を移動します。 </li><li>のビーカーに残っている濃縮および寝具を返しますホームケージ。 </li><li>ホームケージに第2の容器からダムを返し、ビバリウム内の適切な住宅の場所に戻してください。 </li><li>水でビーカーをすすぎ、インキュベーターに戻します。分離手順を通して各ごみに同じビーカーを使用してください。 </li><li>彼らはインキュベーターに入れたのと同じ順序でNMSを受けて、各ごみについて、この手順を繰り返します。 </li><li>各リター受けるNMS P21を介して、毎日のために、この手順全体を繰り返します。 </li><li>食料と水との完全なクリーンケージに一緒に同性の同腹仔を配置することによって、P22のNMSとナイーブ子犬を離乳させます。ナイーブ仔が生まれ、収容されたNMSマウスと同様の条件ではなく、通常の畜産タスクの外で追加の取り扱いを受けるべきではありません。 </li></ol> 2. Perigenital機械的感受性<ol><li>フォン·フレイ装置のセットアップ<ol><li>試験室にマウスを持参し、それらを30順応することができます分は、ホームケージのまま。 </li><li>研究者は、マウス、高さ約55センチ驚くべきことなく、下側から接近できるようにするために十分なスペースを提供して上昇したワイヤーメッシュトップ·テーブル（79​​センチメートル×28センチ）の下に、吸収性アンダーパッドを配置することにより、テスト領域を準備します。 </li><li>ワイヤーメッシュテーブルの上に透明な、穿孔プラスチックチャンバー（12センチ×5センチメートル×3.5 cm）の下で、個別に、12匹まで入れます。逃げるのマウスを防止するために、チャンバーの上に重い物を配置します。 </li><li>離脱閾値の評価に先立って、画面上でさらに30分間、マウスを順応させます。 </li></ol></li><li> Perigenital機械的感受性評価<ol><li>傾斜のvon Freyモノフィラメント43の標準セットを使用して、アップダウンの方法を実行します。 1.65グラム、2.36グラム、2.83グラム、3.22グラム、3.61グラム、4.08グラム、4.31グラム、および4.74グラム以下のモノフィラメントを使用します。 <ol><li> 3.22グラムモノフィラメントのベースを持ち、後退モノを公開フィラメント。 注：一部のモデルでは、退避モノフィラメントがない場合があります。 </li><li>モノフィラメントが垂直に配向されるようにプローブを置くとマウスは、警告不動であり、その体重は後足の間で均等に分散されたときに、わずかになるまで、正中線を避け、陰嚢の左側または右側のいずれかに適用します曲げフィラメントで観察されます。 </li><li> 10秒間、または動物が陽性反応を示すまで、所​​定の位置にモノフィラメントを保持します。 注：正の応答がモノフィラメントアプリケーションまたは舐めるまたはモノフィラメントに向け痛烈な行動に応じて、活発なジャークまたはジャンプであると考えられています。これらの動作を表示せずに10秒モノフィラメントアプリケーションの間マウスが移動した場合、モノフィラメントは、最小1分、長い休止期間後の再テストする必要があります。マウスはどちらも移動でも10秒モノフィラメント中に記載されているアプリケーションの挙動上記のいずれかを示す場合には、否定応答とみなされます。 </li><html><li>実験ノートまたはラップトップに、正または負のいずれか、応答を記録し、3.22グラムのモノフィラメントを用いて、残りのマウスのすべてでこの手順を繰り返します。 </li><li>再び次の適切なモノフィラメントを用いて、全てのマウスをテストします。注：マウスは3.22グラムモノフィラメントに負の応答を示した場合は、同様にして3.61グラムのモノフィラメントを適用し、応答を記録します。マウスは3.22グラムモノフィラメントに陽性反応を示した場合は、2.83グラムのモノフィラメントを適用し、応答を記録します。 </li></ol></li><li>最初の陽性反応が観察された後、さらに4アプリケーションのために、必要に応じて、次に大きいか小さいモノフィラメントを用いて、各マウスのテストを続行。 </li><li>ホームケージにマウスを返します。 </li><li> Chaplan ら 43に記載されているように、50％のG引っ込め閾値を計算するためにログ単位で裁判シリーズに適用され、最終のvon Freyモノフィラメントの値を使用してください。 </li></ol></li></ol>タイトル &quot;&gt; 3。酸性化トルイジンブルーマスト細胞染色<ol><li>組織処理<ol><li>心臓内の氷冷4％パラホルムアルデヒド45で灌流されたマウスからの前立腺組織44を解剖。 PostfixのRTで1時間、4％パラホルムアルデヒド中で組織した後、4°CO / Nに1×PBS中30％スクロース中cryoprotect。 </li><li>ヘプタンの小さい（30ミリリットル）バスを準備し、ドライアイス上に置きます。 </li><li> 1×PBS中の前立腺組織をすすぎ、軽量ワイプ使用して乾燥させます。 </li><li>それが凍結されるまで冷ヘプタンに前立腺組織を挿入します。 </li><li>凍結まで直ちにドライアイス上に取り付けるメディアと場所を含むcryomoldで凍結前立腺組織を配置します。 </li><li>ストアを-20℃でcryomolds。 </li><li>横クライオスタットを用いて、7ミクロンの厚さの凍結切片に前立腺組織を切断します。 </li><li>正に帯電した顕微鏡スライド上に、組織の長さに及ぶ12の非連続凍結切片 - 8を配置します。 </li><li>ストアは、さらなる処理まで-20℃でスライドを終えました。 </li></ol></li><li>酸性化トルイジンブルーの準備<ol><li> 1％ストック溶液を調製し、溶液中まで100ミリリットルの70％エタノールと渦にトルイジンブルーO 1gを加えます。ストック溶液は、最大3週間室温で保存することができます。 </li><li>撹拌プレートの上に置いたビーカーに100mlの水に1グラムのNaClを加えます。 </li><li> 1.0が達成される - 0.5のpH範囲をするまで12 M HClを用いてNaCl溶液のpHを調整します。 </li><li>トルイジンブルーストック溶液8mlの1％NaCl溶液32 mlで組み合わせることによって、0.25％トルイジンブルー使用液を調製します。トルイジンブルーストック溶液の総取り込みを確保し、ボルテックスを用いて混合するために上下にピペット。作業溶液は、新たに作製し、使用後に廃棄しなければなりません。 </li></ol></li><li>前立腺凍結切片を染色<ol><li>冷凍庫から処理対象のスライドを削除し、約30メートルを室温に平衡化することを可能にしますです。 </li><li>個々のスライドに取り付けられた組織切片を完全に水没されることを保証するために、1×PBSの十分な量を含む50 mLのコニカルチューブに約1秒間スライドを浸漬することにより組織切片を洗浄します。スライドをペーパータオル上で空気乾燥することができます。 </li><li> 15 rpmで設定プラットフォームロッカー上ながら15分 - スライドに取り付けられた組織切片が完全に水没されていることを確認し、10インキュベートするのに十分な0.25％の作業トルイジンブルー溶液を含むガラス染色ジャーに入れスライド。 </li><li>ディップは、過剰なトルイジンブルーを洗い流すために、約1秒間、1×PBS中でスライドします。 </li><li>スライドは、排水を可能にするために彼らの側にあるような方法でスライドボックスやラックにスライドを置きます。 </li><li> 2時間または室温でO / Nの最低37℃のオーブンでスライドを乾燥させます。 </li><li>スライドはアルコール露光間の完全に乾燥させ、アルコールを使用して、迅速にスライドを脱水。ペーパータオルAに排出することによってドライスライドND軽量で拭い背中とエッジが拭いてください。 <ol><li>約1秒間95％エタノールでスライドを浸し、完全に乾燥することができます。組織が紫より青乾くまで10回 - この手順1を繰り返します。 </li><li>約1秒間100％エタノールでスライドを浸し、完全に乾燥することができます。組織は、中青に濃いが、紫色でなくなるまで10回 - この手順1を繰り返します。 </li></ol></li><li> 3分間、100％キシレン中でスライドをインキュベートすることによって汚れを修正しました。乾燥することができます。 </li><li>グリセロール、PBS、またはキシレン系永久マウント培地でスライドをカバースリップ。 RTで余分なメディアや店舗を排出します。 </li></ol></li><li>マスト細胞の定量化<ol><li>光学顕微鏡（ 図2）を用いて20X倍率でトルイジンブルー染色した組織切片を視覚化。 </li><li>可視化領域内に存在するマスト細胞の合計数をカウントし、非脱顆粒および脱顆粒マスト細胞を区別。 40Xのマニフィカイオンはいくつかのマスト細胞における造粒状態を確認する必要があるかもしれません。 注：非脱顆粒肥満細胞は、核の輪郭および/または細胞の周囲の無顆粒押出ないか、かすかに密な異染性を示します。脱顆粒肥満細胞は、あまり強く異染性を示し、細胞質内およびセル境界の外核および/または遊離顆粒の明らかな明確な輪郭を持っています。 </li><li>現在の組織切片の全体が非脱顆粒および脱顆粒肥満細胞の総数を評価し続けています。長さを各組織にまたがる、少なくとも7追加の別のセクションでこの手順を繰り返します。 </li><li>以下の式に従って各組織/マウスの合計肥満細胞の脱顆粒（DG）の割合を計算し（DGマスト細胞/総肥満細胞）×100。 </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

このプロトコルは、成体雄マウスにCP / CPPSを示す症状を誘導するために、NMSの形で、新生児のストレスを使用するための方法を提供します。大人として、NMSマウスはかなりのperigenital機械的異痛、ならびに前立腺組織における肥満細胞の脱顆粒の証拠が表示されます。 NMSを使用すると、として、それは多くの場合、慢性骨盤痛12-14の患者によって報告された初期の生活上のストレスを...

慢性骨盤痛自体は病気ではなく、過敏性腸症候群（IBS）と診断された患者が経験した継続的な自発的および/または誘発痛、間​​質性膀胱炎/膀胱痛症候群（IC / PBS）、外陰部痛に関連した用語、または慢性前立腺炎/慢性骨盤痛症候群（CP / CPPS）。これらの症候群は、機能不全が、免疫系、中枢神経系および末梢神経内のシステムは、これらの疾患1の維持および進行に寄与することが示されているが、彼 ​​らは、いかなる関連する病状または同定根底にある病因を持っていない多くの場合、合併され、その中に多くの特徴を共有します-3。慢性骨盤痛を有する患者は、視床の変更された機能に関連付けられている不安、うつ病、パニック障害4-6を含む追加の非骨盤に関連する機能性疼痛障害および気分障害の症状で存在する可能性が高いです下垂体副腎（HPA）軸7-10。初期生活ストレスやトラウマへの暴露がHPAの異常と関連する慢性疼痛症候群10,11と、などを開発するための重要な危険因子であり、機能性骨盤痛障害を有する患者のかなりの部分集合は、虐待やネグレクトなどの有害幼年期の事象を経験したと報告します12-14。 離乳前の期間に設定された時間のために彼らのダムから子犬を除去することを含む、新生児母体の分離（NMS）のげっ歯類モデルは、初期の生活上のストレスの成果を研究するために過去20年間のために使用されています。一般に、NMSは、直接視床下部内での遺伝子発現に影響を与えるだけでなく、辺縁構造15-18から下流調節を破壊することによって、HPA軸の活性化、及び得られた不安様行動を増加させることが示されています。適切なHPA軸機能の破壊が増加大腸19-22に寄与することが示されています</sup&gt;と膣16の感度は、げっ歯類NMSモデルによって表示されますが、出生後の膀胱炎23-25 ​​の長期的な効果の大規模な特性評価にもかかわらず、早期の生活上のストレスの影響は、主に尿生殖器官で自然と口から出た行ってきました。そのため、以下の研究は、マウスにおけるNMSを実行し、それ以降のCP / CPPSのための前臨床モデルとしての雄NMSマウスの使用を検証するために、前立腺にperigenital機械的感度および肥満細胞の浸潤/活性化を評価する方法について説明します。 診断慢性骨盤疼痛性障害のすべての、CP / CPPSは、おそらく最もよく認識し、シンドロームを特徴とする、約14〜26％の生涯有病率を有し、4400ドルで推定年間患者のコストにもかかわらず、（その倍腰痛やリウマチの関節炎27）。 CP / CPPS報告会陰部の痛み、直腸、前立腺、陰茎、睾丸、および/ ​​または腹部28の患者は、ハイテクを体験しますgher対照患者よりも心理的ストレス度29、およびまたは症状と共通して存在が併存する慢性骨盤痛や気分障害5,29-31と診断されています。再発感染、漏れやすい上皮、神経性炎症、および自己免疫は、すべての潜在的な基礎となるCP / CPPS 2,32,33の原因だけでなく、肥満細胞の活性化および脱顆粒34として推測されてきました。 CP / CPPS有する男性から発現前立腺分泌物は、マスト細胞トリプターゼおよび神経成長因子（NGF）のレベル34が増加した、後の研究では（CPA3）のトリプターゼおよびカルボキシペプチダーゼことが確認され、マスト細胞活性化のマーカーもで増加しましたCP / CPPS患者35の尿。 CP / CPPSの発症と維持に肥満細胞の潜在的な役割は、これまでにこの症候群の動物研究の主要な焦点となっています。 CP / CPPSを研究するために使用される最も一般的に用いられる齧歯類モデルは、実験的自己免疫性前立腺炎（EAP）モデルGENです34,36-39使用される種および株に依存前立腺の炎症の多様度になり、完全フロイントアジュバント、前立腺抗原の皮下注射によってerated。マスト細胞の浸潤および活性化/脱顆粒は、EAP 34,35,40の次の誘導を増加させることが示されています。マスト細胞34またはトリプターゼ受容体PAR2 35のいずれかを欠損したトランスジェニックマウスは、野生型EAPマウスとは異なり、EAP次の前立腺戦術感度を開発することはありません。この前臨床モデルがヒトのCP / CPPSの特徴の多くを複製しながら、誘導プロトコールは、多様な病因を持っており、多くの場合、直接炎症、感染、または前立腺の傷害を伴わない人間の状態、を示すものではありません。 ヒトでのCP / CPPSの開発に初期の生活上のストレスの影響は、主に未調査行ってきました。しかし、胡ら 41による研究では、私のことを実証しましたN人は、物理的、感情的、および/または性的虐待の子供時代の歴史は、CP / CPPSを示唆する症状を経験する可能性が有意に高かったと報告しました。さらに、彼らは痛みや尿のスコアの両方が物理的および精神的虐待の既往歴のある患者において増加していることが示されました。我々は以前の雌C57BL / 6マウスは、膣および機能不全HPA軸出力16の両方を示唆する膀胱内、膣過敏症および異常な遺伝子発現を生成するのと同じNMSパラダイムことを実証しました。より明確に初期生活ストレス暴露12-14と関連していることが示されているIC / PBSおよび気分障害を含む他の併存疾患42、と提示CP / CPPS患者の有病率が高いと組み合わせてこの証拠は、使用するための理論的根拠を提供しますNMSモデルは、マウスにおけるCP / CPPSを調査します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pregnant C57BL/6 female mice&#160;</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L glass beaker(s)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS10002L</td>
			<td>Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Forced Air Incubator, Basic</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>414005-124</td>
			<td>The incubator should be held at 33&#176;C and 50% humidity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>58011</td>
			<td>The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Enclosure (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>435</td>
			<td>Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>410</td>
			<td>Place stand on a stable table top for comfortable access.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4&#176;C overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>246654</td>
			<td>Chill heptane on dry ice to freeze tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Cryomold&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4557</td>
			<td>To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>12 x 125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Superfrost Plus Micro Slide</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>75 x 25 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198161</td>
			<td>Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate Sterile 50 mL Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>C-3394</td>
			<td>Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-815</td>
			<td>Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Histological)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P</td>
			<td>Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Boxes, 100-Place</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003</td>
			<td>Boxes can be used for storage and transportation of slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Slide Box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-400</td>
			<td>These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Glycerol is a traditional mounting medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium, Richard-Allan Scientific</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4111</td>
			<td>Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48393-106</td>
			<td>A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation

慢性前立腺炎/慢性骨盤痛症候群（CP / CPPS）14％の生涯有病率を持っており、50歳未満の男性のための最も一般的な泌尿器科診断である、まだそれは少なくとも、慢性骨盤痛障害を理解し、研究しています。著しく視床下部 - 下垂体 - 副腎（HPA）軸の機能および調節に影響を与える可能性が初期生活ストレスや虐待を経験した慢性骨盤痛の報告、患者のかなりの部分集合。両方の尿中で増加することが示されており、CP / CPPS患者の前立腺分泌物を発現しているマスト細胞の活性化は、部分的にHPA軸の下流の活性化によって調節されます。新生児母性分離（NMS）は、HPA軸と内臓感度の変更を含む、齧歯類モデルで初期生活ストレスの成果を研究するために20年以上前から使用されてきました。ここでは、雄のC57BL / 6マウスにおいて、CP / CPPSの前臨床モデルとしてNMSを使用するための詳細なプロトコルを提供します。我々は、方法論を記述しますNMSを行うため、perigenital機械的異痛症、及び肥満細胞の活性化の組織学的証拠を評価します。また、初期の心理的ストレスがマウスにおいて男性の泌尿生殖器系の長期的な効果を持つことができるという証拠を提供します。

NMSを受けたマウスは、CP / CPPSを示す行動の証拠を示しました。フォン·フレイモノフィラメント、8週齢のマウスNMS一連の段階的に試験した場合（N = 4）ナイーブ対応物と比較した場合、perigenital機械的異痛を表示（N = 5、 図2）。モノフィラメントに向けモノフィラメントアプリケーションまたは舐めるまたはかむ行動に応じて、活発なジャークまたはジャンプとして記録、正の?...

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Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

慢性前立腺炎/慢性骨盤痛症候群の前臨床モデルを誘導するために、新生児の母体の分離 - 私たちは、初期生活ストレスパラダイムを受けた雄のC57BL / 6マウスの前立腺におけるperigenital機械的感度および肥満細胞の活性化を測定しています。

新生児母子分離のマウスモデルにおけるPerigenital感度と前立腺肥満細胞の活性化の評価

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the ...

assessment-perigenital-sensitivity-prostatic-mast-cell-activation

Research

JoVE Journal

Medicine

9.2K ビュー.  University of Kansas Medical Center. 慢性前立腺炎/慢性骨盤痛症候群の前臨床モデルを誘導するために、新生児の母体の分離 - 私たちは、初期生活ストレスパラダイムを受けた雄のC57BL / 6マウスの前立腺におけるperigenital機械的感度および肥満細胞の活性化を測定しています。 

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A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

のマウスモデル子宮内で移植

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

医学

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

口腔扁平上皮癌の同所性マウスモデルにおける腫瘍細胞の浸潤の多光子イメージング

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

A Swine Model of Neonatal Asphyxia

Annually more than 1 million neonates die worldwide as related to asphyxia. Asphyxiated neonates commonly have multi-organ failure including hypotension, perfusion deficit, hypoxic-ischemic encephalopathy, pulmonary hypertension, vasculopathic enterocolitis, renal failure and thrombo-embolic complications. Animal models are developed to help us understand the patho-physiology and pharmacology of neonatal asphyxia. In comparison to rodents and newborn lambs, the newborn piglet has been proven to be a valuable model. The newborn piglet has several advantages including similar development as that of 36-38 weeks human fetus with comparable body systems, large body size (&tilde;1.5-2 kg at birth) that allows the instrumentation and monitoring of the animal and controls the confounding variables of hypoxia and hemodynamic derangements.
We here describe an experimental protocol to simulate neonatal asphyxia and allow us to examine the systemic and regional hemodynamic changes during the asphyxiating and reoxygenation process as well as the respective effects of interventions. Further, the model has the advantage of studying multi-organ failure or dysfunction simultaneously and the interaction with various body systems. The experimental model is a non-survival procedure that involves the surgical instrumentation of newborn piglets (1-3 day-old and 1.5-2.5 kg weight, mixed breed) to allow the establishment of mechanical ventilation, vascular (arterial and central venous) access and the placement of catheters and flow probes (Transonic Inc.) for the continuously monitoring of intra-vascular pressure and blood flow across different arteries including main pulmonary, common carotid, superior mesenteric and left renal arteries. Using these surgically instrumented piglets, after stabilization for 30-60 minutes as defined by Z&lt;10% variation in hemodynamic parameters and normal blood gases, we commence an experimental protocol of severe hypoxemia which is induced via normocapnic alveolar hypoxia. The piglet is ventilated with 10-15% oxygen by increasing the inhaled concentration of nitrogen gas for 2h, aiming for arterial oxygen saturations of 30-40%. This degree of hypoxemia will produce clinical asphyxia with severe metabolic acidosis, systemic hypotension and cardiogenic shock with hypoperfusion to vital organs. The hypoxia is followed by reoxygenation with 100% oxygen for 0.5h and then 21% oxygen for 3.5h. Pharmacologic interventions can be introduced in due course and their effects investigated in a blinded, block-randomized fashion.

Large animal models have good translational values in the examination of physiology and pharmacology of neonatal asphyxia. Using newborn piglets, we develop an experimental protocol to simulate neonatal asphyxia which has advantages of studying the systemic and regional hemodynamics, oxygen transport with biochemical and pathologic pathways and correlations.

新生児仮死の新型モデル

Annually more than 1 million neonates die worldwide as related to asphyxia. Asphyxiated neonates commonly have multi-organ failure including hypotension, ...

A Piglet Model of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the world&#8217;s 2.9 million neonatal deaths. Animal models of HIE have contributed to the understanding of the pathophysiology in HIE, and have highlighted the dynamic process that occur in brain injury due to perinatal asphyxia. Thus, animal studies have suggested a time-window for post-insult treatment strategies. Hypothermia has been tested as a treatment for HIE in pdiglet models and subsequently proven effective in clinical trials. Variations of the model have been applied in the study of adjunctive neuroprotective methods and piglet studies of xenon and melatonin have led to clinical phase I and II trials1,2. The piglet HIE model is further used for neonatal resuscitation- and hemodynamic studies as well as in investigations of cerebral hypoxia on a cellular level. However, it is a technically challenging model and variations in the protocol may result in either too mild or too severe brain injury. In this article, we demonstrate the technical procedures necessary for establishing a stable piglet model of neonatal HIE. First, the newborn piglet (&#60; 24 hr old, median weight 1500 g) is anesthetized, intubated, and monitored in a setup comparable to that found in a neonatal intensive care unit. Global hypoxia-ischemia is induced by lowering the inspiratory oxygen fraction to achieve global hypoxia, ischemia through hypotension and a flat trace amplitude integrated EEG (aEEG) indicative of cerebral hypoxia. Survival is promoted by adjusting oxygenation according to the aEEG response and blood pressure. Brain injury is quantified by histopathology and magnetic resonance imaging after 72 hr.

Hypoxic-ischemic encephalopathy following perinatal asphyxia can be studied using animal models. We demonstrate the procedures necessary for establishing a piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy.

新生児低酸素性虚血性脳症の子豚モデル

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the ...

Motor and Hippocampal Dependent Spatial Learning and Reference Memory Assessment in a Transgenic Rat Model of Alzheimer's Disease with Stroke

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease that results in neurodegeneration and memory loss. While age is a major risk factor for AD, stroke has also been implicated as a risk factor and an exacerbating factor. The co-morbidity of stroke and AD results in worsened stroke-related motor control and AD-related cognitive deficits when compared to each condition alone. To model the combined condition of stroke and AD, a novel transgenic rat model of AD, with a mutated form of amyloid precursor protein (a key protein involved in the development of AD) incorporated into its DNA, is given a small unilateral striatal stroke.
For a model with the combination of both stroke and AD, behavioral tests that assess stroke-related motor control, locomotion and AD-related cognitive function must be implemented. The cylinder task involves a cost-efficient, multipurpose apparatus that assesses spontaneous forelimb motor use. In this task, a rat is placed in a cylindrical apparatus, where the rat will spontaneously rear and contact the wall of the cylinder with its forelimbs. These contacts are considered forelimb motor use and quantified during video analysis after testing. Another cost-efficient motor task implemented is the beam-walk task, which assesses forelimb control, hindlimb control and locomotion. This task involves a rat walking across a wooden beam allowing for the assessment of limb motor control through analysis of forelimb slips, hindlimb slips and falls. Assessment of learning and memory is completed with Morris water maze for this behavioral paradigm. The protocol starts with spatial learning, whereby the rat locates a stationary hidden platform. After spatial learning, the platform is removed and both short-term and long-term spatial reference memory is assessed. All three of these tasks are sensitive to behavioral differences and completed within 28 days for this model, making this paradigm time-efficient and cost-efficient.

To investigate the co-morbid Alzheimer&#39;s disease (AD) and stroke condition in a novel model, three behavior tasks are described that assess both motor control and cognitive behaviors. These tasks include the beam-walk task, cylinder task and Morris water maze.

モーターと脳卒中とアルツハイマー病のトランスジェニックラットモデルにおける海馬依存性の空間学習とリファレンスメモリ評価

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease that results in neurodegeneration and memory loss. While age is a major risk ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

新生児マウス脊髄圧縮損傷モデル

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

A Battery of Motor Tests in a Neonatal Mouse Model of Cerebral Palsy

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, standardized battery of neonatal mouse motor tests. These tests can validate injury or disease models, determine treatment efficacy and/or assess motor behaviors in new transgenic strains. This paper presents a series of neonatal motor tests to evaluate general motor function, including ambulation, hindlimb foot angle, surface righting, negative geotaxis, front- and hindlimb suspension, grasping reflex, four limb grip strength and cliff aversion. Mice between the ages of post-natal day 2 to 14 can be used. In addition, these tests can be used for a wide range of neurological and neuromuscular pathologies, including cerebral palsy, hypoxic-ischemic encephalopathy, traumatic brain injury, spinal cord injury, neurodegenerative diseases, and neuromuscular disorders. These tests can also be used to determine the effects of pharmacological agents, as well as other types of therapeutic interventions. In this paper, motor deficits were evaluated in a novel neonatal mouse model of cerebral palsy that combines hypoxia, ischemia and inflammation. Forty-eight hours after injury, five tests out of the nine showed significant motor deficits: ambulation, hindlimb angle, hindlimb suspension, four limb grip strength, and grasping reflex. These tests revealed weakness in the hindlimbs, as well as fine motor skills such as grasping, which are similar to the motor deficits seen in human cerebral palsy patients.

Presented is a concise battery of mouse neonatal motor tests. Using these tests, neonatal motor deficits can be demonstrated in a variety of neonatal motor disorders. By having a standardized set of tests, results from different studies can be compared, allowing for better and accurate reporting between groups.

脳性麻痺の新生児マウスモデルにおける運動テストのバッテリー

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

新生児マウスの心筋梗塞、心臓再生のモデル

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

ワイヤー図法を使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮力測定

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Intraoperative Assessment of Resection Margins in Oral Cavity Cancer: This is the Way

The goal of head and neck oncological surgery is complete tumor resection with adequate resection margins while preserving acceptable function and appearance. For oral cavity squamous cell carcinoma (OCSCC), different studies showed that only 15%-26% of all resections are adequate. A major reason for the low number of adequate resections is the lack of information during surgery; the margin status is only available after the final histopathologic assessment, days after surgery.
The surgeons and pathologists at the Erasmus MC University Medical Center in Rotterdam started the implementation of specimen-driven intraoperative assessment of resection margins (IOARM) in 2013, which became the standard of care in 2015. This method enables the surgeon to turn an inadequate resection into an adequate resection by performing an additional resection during the initial surgery. Intraoperative assessment is supported by a relocation method procedure that allows accurate identification of inadequate margins (found on the specimen) in the wound bed.
The implementation of this protocol resulted in an improvement of adequate resections from 15%-40%. However, the specimen-driven IOARM is not widely adopted because grossing fresh tissue is counter-intuitive for pathologists. The fear exists that grossing fresh tissue will deteriorate the anatomical orientation, shape, and size of the specimen and therefore will affect the final histopathologic assessment. These possible negative effects are countered by the described protocol. Here, the protocol for specimen-driven IOARM is presented in detail, as performed at the institute.

The goal of this protocol is to provide a clear overview of specimen-driven intraoperative assessment of resection margins. It is encouraged to implement this protocol to improve patient care at other institutes.