The authors would like to thank Janelle Ryals, Rachel Supple, and Frank Wang for technical assistance. This work was supported by NIH grants R03 DK080182 (JAC), R01 DK099611 (JAC), R01 DK103872 (JAC), Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) grant P20 GM104936 (JAC), start-up funds and core support from the Kansas Institutional Development Award (IDeA) P20 GM103418, core support from the Kansas IDDRC P30 HD002528, and The Madison and Lila Self Fellowship Program (ANP).

이 프로토콜에 설명 된 모든 실험은 캔자스 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 지정된 지침에 따라 NIH 가이드 라인을 준수합니다. 1. 신생아 모자 분리 (NMS) <ol><li> 쓰레기 출생 매일 임신 댐을 모니터링합니다. 참고 : 태어난 쓰레기가 P0으로 간주되는 날. </li><li> (P1)에서 홈 케이지에서 댐을 제거하고 깨끗한 차 용기에 넣습니다. </li><li> 홈 케이지의 향기를 유지하기 위해 깨끗한 장갑을 낀 손 사이 침구의 소수를 문질러. </li><li> 적절하게 2 패 유리 비커를 표시, 깨끗한로 홈 케이지 침구 1-2cm의 깊이를 추가합니다. 유리 비커에 홈 케이지에 존재하는 추가 농축 침구 소재, 예를 들어, nestlet, 주름 종이의 약 절반을 추가합니다. </li><li> 부드럽게 같은 비커에, 개별적으로, 하나의 쓰레기에서 새끼를 모두 넣습니다. </li><li> 즉시 배치인큐베이터에서 비커는 180 분 동안 33 O C와 50 %의 습도에서 개최. </li><li> 차 컨테이너에서 댐을 제거하고 홈 케이지에 그녀를 돌려줍니다. 동식물 사육장 내에서 적절한 주택 위치로 홈 케이지를 돌려줍니다. </li><li> , NMS를 받고 각 쓰레기 / 댐 깨끗한 장갑 및 보조 용기를 사용하여 각 쓰레기에 대해이 절차를 반복합니다. </li><li> 그들은 제거로 180 분간 분리 기간의 끝에서와 같은 순서로 자신의 홈 케이지로 돌려 담가. </li><li> 이전에 하루에 분리 된 첫 번째 쓰레기의 홈 케이지를 검색합니다. 홈 케이지에서 댐을 제거하고 깨끗한 차 용기에 넣습니다. </li><li> 인큐베이터에서 첫 번째 비커를 제거하고 새끼를 처리하는 동안 홈 케이지의 향기를 유지하기 위해 깨끗한 장갑을 낀 손 사이 침구의 소수를 문질러. </li><li> 조심스럽게 집 케이지에 비커에서, 개별적으로, 새끼를 이동합니다. </li><li> 에 비커에 남아있는 우라늄 농축과 침구를 돌려줍니다홈 케이지. </li><li> 홈 케이지에 차 컨테이너에서 댐을 돌아 동식물 사육장 내에서 적절한 주택 위치로 돌아갑니다. </li><li> 물을 비이커를 씻어 인큐베이터로 돌아갑니다. 분리 절차를 통해 각각의 쓰레기에 대해 동일한 비커를 사용합니다. </li><li> 그들은 배양기에 넣고, 같은 순서로 NMS를 받고 각각의 쓰레기에 대해이 절차를 반복합니다. </li><li> 각각의 쓰레기 겪고 NMS (P21)를 통해 매일 매일이 전체 절차를 반복합니다. </li><li> 음식과 물을 완벽하게 깨끗한 케이지에서 함께 동성의 한배 새끼를 배치하여 P22에 NMS와 순진한 새끼를 유아. 순진한 새끼가 태어나 NMS 마우스와 같은 조건에서 보관하지만 일반 축산 작업 이외의 추가 처리를 받게 될 수 없습니다. </li></ol> 2. Perigenital 기계 감도 <ol><li> 프레이 장치 설치 <ol><li> 테스트 룸에 마우스를 가져오고 그들이 30 적응 할 수 있도록분은 자신의 홈 케이지에 남아있다. </li><li> 연구자는 마우스, 높이 약 55cm를 깜짝 놀랄없이 아래쪽에서 접근 할 수 있도록 충분한 공간을 제공하는 높은 와이어 메쉬 탑 테이블 (79cm X 28cm) 아래에 흡수 underpad을 배치하여 테스트 영역을 준비합니다. </li><li> 분명,이 뚫린 플라스틱 챔버에서, 개별적으로, 12 마우스에 철망 테이블 상단에 (11cm X 5cm X 3.5 cm)를 놓습니다. 탈출 마우스를 방지하기 위해 챔버 위에 무거운 물체를 놓습니다. </li><li> 움츠림 역치 평가 이전 화면에 추가로 30 분 동안 마우스를 적응. </li></ol></li><li> Perigenital 기계 감도 평가 <ol><li> 경사 본 프레이 모노 필라멘트 (43)의 표준 세트를 사용하는 업 - 다운 방법을 수행. 다음과 같은 모노 필라멘트를 사용하여 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g 및 4.74 g의. <ol><li> 3.22 G 모노 필라멘트의 기초를 잡고 후퇴 모노 노출필라멘트. 참고 : 일부 모델은 후퇴 모노 필라멘트가 없을 수 있습니다. </li><li> 모노 필라멘트가 수직 배향되도록 프로브를 놓다 및 마우스, 경보 움직이며, 그 체중이 뒷발에 고르게 분배 될 때 약간까지, 정중선을 피하고, 음낭 좌우 양측에 적용 벤드는 필라멘트에서 관찰된다. </li><li> 10 초 동안이나 동물이 긍정적 인 반응을 보일 때까지 자리에 모노 필라멘트를 잡습니다. 참고 : 긍정적 인 반응은 모노 필라멘트 응용 프로그램이나 핥아 또는 모노 필라멘트 지향 무는 행동에 대한 응답으로 활발한 바보 또는 점프로 간주됩니다. 이러한 행동을 표시하지 않고, 10 초 모노 필라멘트의인가 마우스 이동, 모노 필라멘트는 최소 1 분 길이의 휴지 기간 다음 재시험되어야한다면. 마우스 이동도도 10 초 모노 필라멘트인가에 나열된 전술 한 동작이 나타나는 경우, 부정 응답 여겨진다. </li><html><li> 실험실 노트북 또는 노트북에, 음 또는 양 중, 응답을 기록하고 3.22 g의 모노 필라멘트를 사용하여 나머지 쥐 모두에서이 절차를 반복합니다. </li><li> 다시 다음 적절한 모노 필라멘트를 사용하여 마우스를 모두 테스트합니다. 주 : 마우스 3.22 g 모노 필라멘트로 부정 응답을 나타내 경우 동일한 방법으로 3.61 g의 모노 필라멘트를 적용하고 반응을 기록한다. 마우스 3.22 g 모노 필라멘트에 양성 반응을 나타내 경우 2.83 g의 모노 필라멘트를 적용하고 반응을 기록한다. </li></ol></li><li> 제 양성 반응이 관찰 된 후에 추가의 애플리케이션을위한 4, 적절한 다음 크거나 작은 각 모노 필라멘트를 사용하여 마우스를 시험 계속. </li><li> 홈 케이지에 마우스를 돌려줍니다. </li><li> Chaplan 등. (43)에 기재된 바와 같이 50 % g 움츠림 역치를 계산하는 로그 단위 시험 시리즈인가 최종 본 프레이 모노 필라멘트의 값을 사용한다. </li></ol></li></ol>제목 &quot;&gt; 3. 산성화 톨루이딘 블루 비만 세포 염색 <ol><li> 조직 처리 <ol><li> intracardially 빙냉 4 % 파라 포름 알데히드 45 관류 된 마우스로부터 전립선 조직 44 해부. 후위 실온에서 1 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드에서 조직 한 후 4 ° CO / N에 1X PBS의 30 % 자당에 cryoprotect. </li><li> 헵탄의 작은 (30 ml)에 목욕을 준비하고 드라이 아이스에 놓습니다. </li><li> 1X PBS에서 전립선 조직을 씻어 빛 의무 닦아 사용하여 건조. </li><li> 이 동결 될 때까지 차가운 헵탄으로 전립선 조직을 삽입합니다. </li><li> 냉동 될 때까지 즉시 드라이 아이스에 장착 매체와 장소를 포함하는 cryomold에 냉동 전립선 조직을 배치합니다. </li><li> 스토어는 -20 ° C에서 cryomolds. </li><li> 가로 저온 유지 장치를 사용하여 7 μm의 두께 저온부로 전립선 조직을 잘라. </li><li> 긍정적으로 충전 된 현미경 슬라이드에, 조직의 길이에 걸쳐 12 비 직렬 저온부 - 8 놓습니다. </li><li> 저장소 추가 처리 할 때까지 -20 ° C에서 슬라이드를 마쳤다. </li></ol></li><li> 산성화 된 톨루이딘 블루 준비 <ol><li> 1 % 스톡 용액을 제조 할 때까지 용액에 100 ml의 70 % 에탄올과 와류에 톨루이딘 블루 O 1 g을 넣고. 원액은 최대 3 주 동안 실온에서 저장 될 수있다. </li><li> 교반 판의 상단에 배치 비커에 100ml의 물에 1g의 NaCl을 추가합니다. </li><li> 달성되는 1.0 - 0.5의 pH 범위까지 12 M 염산을 사용하여 NaCl 용액의 pH를 조정한다. </li><li> 톨루이딘 블루 스톡 용액 8 ml의 1 % NaCl 용액 32 ㎖에 결합하여 0.25 % 톨루이딘 블루 작업 용액을 준비한다. 톨루이딘 블루 원액의 전체 통합을 보장하고 소용돌이를 사용하여 혼합 아래로 피펫합니다. 작업 솔루션은 신선한 만든 및 사용 후 폐기해야합니다. </li></ol></li><li> 전립선 저온부 염색 <ol><li> 냉동고에서 처리되는 슬라이드를 제거하고 약 30 m에서 RT로 평형을 허용있다. </li><li> 개별적으로 슬라이드 마운트 조직 섹션 완전히 잠수되는 것을 보장하기 위해 1X PBS의 충분한 양을 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 약 1 초 동안 침지하여 슬라이드 조직 절편을 씻는다. 슬라이드는 종이 타월에 공기 건조하도록 허용합니다. </li><li> 충분히 0.25 % 작업 톨루이딘 블루 솔루션을 포함하는 유리 염색 항아리에 넣어 슬라이드는 슬라이드에 장착 된 조직 절편이 완전히 침수 될 수 있도록 10 동안 배양 - 동안 15 rpm으로 설정 플랫폼 로커에 15 분. </li><li> 약 1 초 동안 1X PBS에서 딥 슬라이드 초과 톨루이딘 블루를 씻어. </li><li> 슬라이드 배수를 허용하도록 그들의 양쪽되는 방식으로 슬라이드 박스 또는 선반 슬라이드를 놓는다. </li><li> 2 시간 또는 RT에서 O / N의 최소 37 ° C의 오븐에서 슬라이드를 건조. </li><li> 알코올 노출 사이의 슬라이드는 완전히 건조 있도록 신속 알코올을 사용하여 슬라이드를 탈수. 종이 수건에 배수에 의해 건조 슬라이드차 경량으로 닦아 백업 및 가장자리가 닦습니다. <ol><li> 약 1 초 동안 95 % EtOH로에서 슬라이드를 담그고 완전히 건조 할 수 있습니다. 조직이 보라색보다 더 푸른 건조 될 때까지 10 회 -이 절차 1을 반복합니다. </li><li> 약 1 초 동안 100 %의 EtOH에 슬라이드를 담그고 완전히 말리십시오. 조직이 매체 파란색으로 어두운하지만, 보라색되지 때까지 10 배 -이 절차 1을 반복합니다. </li></ol></li><li> 3 분 동안 100 % 크실렌의 슬라이드를 배양하여 얼룩을 수정합니다. 건조하도록 허용합니다. </li><li> 글리세롤, PBS, 또는 자일 렌 계 영구 장착 매체를 사용하여 슬라이드를 커버 슬립. 실온에서 초과 용지 및 저장을 배출합니다. </li></ol></li><li> 정량화 비만 세포 <ol><li> 20X 배율 광학 현미경을 사용하여 (그림 2)에서 톨루이딘 블루 스테인드 조직 섹션을 시각화. </li><li> 가시 영역 내에 존재하는 비만 세포의 총 수를 계산 및 비 degranulated degranulated 및 비만 세포를 구별. 40X의 MAGNIFICAT이온 일부 비만 세포에서 과립의 상태를 확인하기 위해 필요할 수있다. 참고 : 비 degranulated 비만 세포가 없거나 희미 핵 개요 및 / 또는 세포 주위에 세분화 된 압출과 밀도 metachromasia을 나타낸다. Degranulated 비만 세포는 덜 심한 metachromasia를 나타내고 세포질 내 및 셀 경계 외부 핵 및 / 또는 자유 과립 명백한 명확한 윤곽을 갖는다. </li><li> 현재 조직 절편의 전체 비 degranulated degranulated 및 비만 세포의 총 수를 지속적으로 평가. 길이 각 조직에 걸쳐, 최소 7 추가적인 별도의 섹션에서이 절차를 반복합니다. </li><li> 하기 식에 따라 각 조직 / 전체 마우스 비만 세포에 degranulated (DG)의 비율을 계산한다 (DG 비만 세포 / 총 비만 세포) × 100. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 성인 수컷 마우스에서 CP / CPPS 나타내는 symptomology를 유도하기 위해, NMS의 형태, 신생아 응력을 사용하는 방법을 제공한다. 성인, NMS 마우스는 상당한 perigenital 기계적 이질통뿐만 아니라 전립선 조직 비만 세포 탈과립의 증거를 표시. NMS의 사용으로, 그것은 종종 만성 골반통 12-14 환자에서보고 어릴 응력을 복제하는 것을 CP / CPPS의 전임상 모델을 개발할뿐만 아니라 비 침습?...

만성 골반통 자체가 질병이 아니라, 과민성 대장 증후군 (IBS)으로 진단 환자가 경험 지속적인 자발 및 / 또는 유발 통증, 간질 성 방광염 / 통증 방광 증후군 (IC / PBS), vulvodynia와 연관된 기간, 만성 전립선 염 / 만성 골반 통증 증후군 (CP / CPPS). 이러한 증후군은 종종 면역계, 중추 신경계, 말초 신경계 내에서 부전 이러한 질환 (1)의 유지 보수 및 진행에 기여하는 것으로되어 있지만, 그들이, 연관된 병리 또는 식별 근본적인 원인이 없다고 많은 특성을 동반하고 공유되고 -3. 만성 골반 통증 환자의 증상을 제시 할 가능성이 추가, 비 골반 관련 hypothalamic-의 변경된 기능과 관련되어 불안, 우울증과 공황 장애 4-6, 포함 기능 통증 질환 및 기분 장애를, pituitary-부신 (HPA) 축 7-10. 초기 생활 스트레스 나 외상에 노출 HPA 이상과 관련된 만성 통증 증후군 (10, 11)과 같은 개발을위한 중요한 위험 인자, 기능 골반 통증 장애 환자의 상당 부분 집합은 학대 나 방치 등의 부작용 어린 시절의 사건을 경험 한보고한다 12-14. preweaning 기간 동안 일정 시간 동안 자신의 댐에서 새끼를 제거하는 것을 포함 신생아 산모의 분리 (NMS)의 설치류 모델은 초기 생활 스트레스의 결과를 연구하기 위해 지난 20 년간 사용되어왔다. 일반적으로, NMS 직접 시상 하부 내에서 유전자 발현에 영향을 미칠뿐만 아니라, 변연 구조 15-18 하류 조절을 방해하여, HPA 축의 활성화 및 결과적인 불안 같은 행동을 증가시키는 것으로 나타났다. 적절한 HPA 축 작동 중단 증가 대장 19-22에 기여하는 것으로 나타났다 </sup&gt; 및 질 (16) 감도는 NMS 설치류 모델이 표시되지만 산후 방광 염증 23-25의 장기적인 효과의 광범위한 특성에도 불구하고, 초기 생명 응력의 영향은 크게 비뇨 기관에서 배우지왔다. 따라서, 다음의 연구는 마우스에서 NMS을 수행하고 나중에 CP / CPPS위한 전임상 모델로서 남성 NMS 마우스의 사용을 확인하는 전립선 perigenital 기계적 감도 및 비만 세포 침윤 / 활성화를 평가하는 방법을 설명한다. 진단 만성 골반 통증 질환의 모든 중, CP / CPPS는 요통이나 류마티스의 두 번 아마도 약 14 % (26)의 평생 유병률과 4,400달러 (추정 연간 환자 비용에도 불구하고 가장 잘 인식과 특징 증후군이다 관절염 27). 회음부, 항문이, 전립선, 음경, 고환, 및 / 또는 복부 (28)는, 하이를 경험에 CP / CPPS 보고서 통증 환자gher 대조군 (29)보다 심리적 스트레스의 정도, 그리고 나의 증상이 일반적으로 현재는 동반 만성 골반 통증이나 기분 장애 5,29-31으로 진단된다. 재발 성 감염, 누설 상피, 신경성 염증 및자가 면역 모두 기저 전위 / CPPS 2,32,33 CP의 요인뿐만 아니라, 비만 세포 활성 및 탈과립 (34)로 추측되고있다. 또한 증가하고, 비만 세포 활성화 마커 CP / CPPS 남성로부터 발현 전립선 분비물 비만 세포 트립 타제 및 신경 성장 인자 (NGF) 레벨 (34)이 증가하였고, 이후 연구 트립 타 아제를 확인하고 (CPA3)를 카르복시 CP / CPPS 환자 (35)의 소변. 발병 및 CP / CPPS의 유지 보수에 비만 세포의 잠재적 인 역할은 지금까지이 증후군에 대한 동물 연구의 주요 초점이되고있다. 가장 일반적으로 사용되는 설치류 모델이 CP를 연구하는 데 사용 / CPPS는 실험자가 면역 전립선 염이다 (EAP) 모델 겐34,36-39 사용 종과 변형에 따라 전립선 염증의 변화도 초래 완전 프로 인트 보조제, 전립선 항원의 피하 주사에 의해 erated. 비만 세포의 침윤 및 활성화 / 탈과립은 EAP 34,35,40의 다음 유도를 증가하는 것으로 나타났다. 비만 세포 (34) 또는 트립 타제 수용체 PAR2 (35) 중 하나에 결함이 형질 전환 마우스는 야생형 EAP 마우스와 달리 EAP 다음 전립선 전술 감도를 개발하지 않습니다. 이 전임상 모델은 인간의 CP / CPPS의 많은 특징을 복제하는 동안, 유도 프로토콜 직접적인 염증, 감염, 또는 전립선의 손상을 포함하지 않는 종종 다양한 원인을 가지고 있으며, 인간의 상태를 나타내는 아니다. 인간의 CP / CPPS의 개발에 초기 생활 스트레스의 영향은 크게 uninvestigated 갔다; 그러나, 후진타오, 등. (41)에 의해 연구는 나를 시연N 어린 시절 신체적, 감정적 인의 역사를보고, 및 / 또는 성적 학대는 CP / CPPS을 암시하는 증상을 경험 훨씬 더 많은 것으로 나타났다 사람들. 또한, 그들은 고통과 소변 점수가 모두 신체적, 정서적 학대의 역사를 가진 환자에서 증가 된 것으로 나타났다. 우리는 이전에 암컷 C57BL / 6 마우스에서 NMS 같은 패러다임에 질 과민증 비정상적인 유전자 발현을 생산하고 있음을 증명하고있다 양쪽 성기 및 역기능 HPA 축 (16)의 출력 암시 방광. 보다 명확 어릴 응력 노출 12-14과 연계되는 것으로 도시되었다 IC / PBS 및 기분 장애를 포함하는 다른 동반 질환 (42), 제시하는 CP / CPPS 환자의 높은 유병률과 결합이 증거는, 사용에 대한 근거를 제공한다 NMS 모델 생쥐에서 CP / CPPS을 알아보고자 하였다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pregnant C57BL/6 female mice&#160;</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>027</td>
			<td>Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L glass beaker(s)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS10002L</td>
			<td>Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Forced Air Incubator, Basic</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>414005-124</td>
			<td>The incubator should be held at 33&#176;C and 50% humidity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>58011</td>
			<td>The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Enclosure (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>435</td>
			<td>Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)</td>
			<td>IITC</td>
			<td>410</td>
			<td>Place stand on a stable table top for comfortable access.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4&#176;C overnight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>246654</td>
			<td>Chill heptane on dry ice to freeze tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Cryomold&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4557</td>
			<td>To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>12 x 125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Superfrost Plus Micro Slide</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>75 x 25 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>198161</td>
			<td>Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate Sterile 50 mL Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>C-3394</td>
			<td>Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-815</td>
			<td>Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes (Histological)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P</td>
			<td>Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Boxes, 100-Place</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003</td>
			<td>Boxes can be used for storage and transportation of slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Slide Box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-400</td>
			<td>These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Glycerol is a traditional mounting medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium, Richard-Allan Scientific</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>4111</td>
			<td>Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48393-106</td>
			<td>A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation

만성 전립선 염 / 만성 골반 통증 증후군 (CP / CPPS)은 14 %의 평생 유병률이 50 세 미만의 사람에 대한 가장 일반적인 비뇨기과 진단이다, 그러나 그것은 적어도 이해하고 연구 만성 골반 통증 질환이다. 만성 골반 통증 보고서 환자의 중요한 부분 집합은 현저하게 시상 하부 - 뇌하수체 - 부신 (HPA) 축의 기능 및 규제에 영향을 미칠 수있는 생애 초기 스트레스 또는 학대를 경험 한. 표시되었습니다 비만 세포의 활성화는, 부분적으로 HPA 축 다운 스트림 활성화에 의해 조절된다, 모두 소변으로 증가 CP / CPPS 환자의 전립선 분비물을 표현한다. 신생아 산모의 분리 (NMS)는 HPA 축과 내장 감도의 변화를 포함한 설치류 모델에서 초기 생활 스트레스의 결과를 연구하기 위해 20 년 이상 사용되어왔다. 여기에서 우리는 남성 C57BL / 6 마​​우스에서 CP / CPPS의 전임상 모델로 NMS를 사용하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 방법을 설명perigenital 기계적 이질통 및 비만 세포 활성화의 증거를 조직 학적 평가, NMS를 행하는. 우리는 또한 초기의 심리적 스트레스가 마우스에서 남성 비뇨 생식기 시스템에 오래 지속되는 영향을 미칠 수 있다는 증거를 제공한다.

NMS받은 마우스는 CP / CPPS를 나타내는 행동의 증거를 보여 주었다. 프레이 모노 필라멘트 8 주령 NMS 마우스의 등급 일련의 시험 할 때 (N = 4) 순진 대응에 비해 perigenital 기계적 이질통을 표시 (N = 5, 그림 2). 모노 필라멘트 지향 모노 필라멘트 응용 프로그램이나 핥아 또는 무는 행동에 대한 응답으로 활발한 바보 또는 점프로 기록, 긍정적 인 행동 반응을 이끌어 낸 기계 탈퇴 임계 값에?...

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Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

만성 전립선 염 / 만성 골반 통증 증후군의 전임상 모델을 유도하기 위해 신생아 산모의 분리, - 우리는 생애 초기 스트레스 패러다임을받은 남성 C57BL / 6 마​​우스의 전립선에 perigenital 기계적 감도와 비만 세포 활성화를 측정한다.

신생아 모자 분리의 마우스 모델에서 Perigenital 감도 및 전립선 비만 세포 활성화의 평가

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the ...

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Medicine

9.2K 조회수.  University of Kansas Medical Center.  만성 전립선 염 / 만성 골반 통증 증후군의 전임상 모델을 유도하기 위해 신생아 산모의 분리, - 우리는 생애 초기 스트레스 패러다임을받은 남성 C57BL / 6 마​​우스의 전립선에 perigenital 기계적 감도와 비만 세포 활성화를 측정한다. 

비디오: Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

의 마우스 모델 Utero에 이식

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

연구

의학

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

구강 편평 세포 암종의 Orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

A Swine Model of Neonatal Asphyxia

Annually more than 1 million neonates die worldwide as related to asphyxia. Asphyxiated neonates commonly have multi-organ failure including hypotension, perfusion deficit, hypoxic-ischemic encephalopathy, pulmonary hypertension, vasculopathic enterocolitis, renal failure and thrombo-embolic complications. Animal models are developed to help us understand the patho-physiology and pharmacology of neonatal asphyxia. In comparison to rodents and newborn lambs, the newborn piglet has been proven to be a valuable model. The newborn piglet has several advantages including similar development as that of 36-38 weeks human fetus with comparable body systems, large body size (&tilde;1.5-2 kg at birth) that allows the instrumentation and monitoring of the animal and controls the confounding variables of hypoxia and hemodynamic derangements.
We here describe an experimental protocol to simulate neonatal asphyxia and allow us to examine the systemic and regional hemodynamic changes during the asphyxiating and reoxygenation process as well as the respective effects of interventions. Further, the model has the advantage of studying multi-organ failure or dysfunction simultaneously and the interaction with various body systems. The experimental model is a non-survival procedure that involves the surgical instrumentation of newborn piglets (1-3 day-old and 1.5-2.5 kg weight, mixed breed) to allow the establishment of mechanical ventilation, vascular (arterial and central venous) access and the placement of catheters and flow probes (Transonic Inc.) for the continuously monitoring of intra-vascular pressure and blood flow across different arteries including main pulmonary, common carotid, superior mesenteric and left renal arteries. Using these surgically instrumented piglets, after stabilization for 30-60 minutes as defined by Z&lt;10% variation in hemodynamic parameters and normal blood gases, we commence an experimental protocol of severe hypoxemia which is induced via normocapnic alveolar hypoxia. The piglet is ventilated with 10-15% oxygen by increasing the inhaled concentration of nitrogen gas for 2h, aiming for arterial oxygen saturations of 30-40%. This degree of hypoxemia will produce clinical asphyxia with severe metabolic acidosis, systemic hypotension and cardiogenic shock with hypoperfusion to vital organs. The hypoxia is followed by reoxygenation with 100% oxygen for 0.5h and then 21% oxygen for 3.5h. Pharmacologic interventions can be introduced in due course and their effects investigated in a blinded, block-randomized fashion.

Large animal models have good translational values in the examination of physiology and pharmacology of neonatal asphyxia. Using newborn piglets, we develop an experimental protocol to simulate neonatal asphyxia which has advantages of studying the systemic and regional hemodynamics, oxygen transport with biochemical and pathologic pathways and correlations.

신생아 질식의 돼지 모델

Annually more than 1 million neonates die worldwide as related to asphyxia. Asphyxiated neonates commonly have multi-organ failure including hypotension, ...

A Piglet Model of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the world&#8217;s 2.9 million neonatal deaths. Animal models of HIE have contributed to the understanding of the pathophysiology in HIE, and have highlighted the dynamic process that occur in brain injury due to perinatal asphyxia. Thus, animal studies have suggested a time-window for post-insult treatment strategies. Hypothermia has been tested as a treatment for HIE in pdiglet models and subsequently proven effective in clinical trials. Variations of the model have been applied in the study of adjunctive neuroprotective methods and piglet studies of xenon and melatonin have led to clinical phase I and II trials1,2. The piglet HIE model is further used for neonatal resuscitation- and hemodynamic studies as well as in investigations of cerebral hypoxia on a cellular level. However, it is a technically challenging model and variations in the protocol may result in either too mild or too severe brain injury. In this article, we demonstrate the technical procedures necessary for establishing a stable piglet model of neonatal HIE. First, the newborn piglet (&#60; 24 hr old, median weight 1500 g) is anesthetized, intubated, and monitored in a setup comparable to that found in a neonatal intensive care unit. Global hypoxia-ischemia is induced by lowering the inspiratory oxygen fraction to achieve global hypoxia, ischemia through hypotension and a flat trace amplitude integrated EEG (aEEG) indicative of cerebral hypoxia. Survival is promoted by adjusting oxygenation according to the aEEG response and blood pressure. Brain injury is quantified by histopathology and magnetic resonance imaging after 72 hr.

Hypoxic-ischemic encephalopathy following perinatal asphyxia can be studied using animal models. We demonstrate the procedures necessary for establishing a piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy.

신생아 저산소 - 허혈성 뇌증의 돼지 모델

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

신생아 마우스 척수 압축 부상 모델

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

A Battery of Motor Tests in a Neonatal Mouse Model of Cerebral Palsy

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, standardized battery of neonatal mouse motor tests. These tests can validate injury or disease models, determine treatment efficacy and/or assess motor behaviors in new transgenic strains. This paper presents a series of neonatal motor tests to evaluate general motor function, including ambulation, hindlimb foot angle, surface righting, negative geotaxis, front- and hindlimb suspension, grasping reflex, four limb grip strength and cliff aversion. Mice between the ages of post-natal day 2 to 14 can be used. In addition, these tests can be used for a wide range of neurological and neuromuscular pathologies, including cerebral palsy, hypoxic-ischemic encephalopathy, traumatic brain injury, spinal cord injury, neurodegenerative diseases, and neuromuscular disorders. These tests can also be used to determine the effects of pharmacological agents, as well as other types of therapeutic interventions. In this paper, motor deficits were evaluated in a novel neonatal mouse model of cerebral palsy that combines hypoxia, ischemia and inflammation. Forty-eight hours after injury, five tests out of the nine showed significant motor deficits: ambulation, hindlimb angle, hindlimb suspension, four limb grip strength, and grasping reflex. These tests revealed weakness in the hindlimbs, as well as fine motor skills such as grasping, which are similar to the motor deficits seen in human cerebral palsy patients.

Presented is a concise battery of mouse neonatal motor tests. Using these tests, neonatal motor deficits can be demonstrated in a variety of neonatal motor disorders. By having a standardized set of tests, results from different studies can be compared, allowing for better and accurate reporting between groups.

뇌성 마비의 신생아 마우스 모델에서 모터 테스트의 배터리

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

신생아 쥐의 심근 경색, 심장 재생의 모델

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Myography 와이어를 사용 하 여 마우스 Mesenteric 동맥의 isometric 수축 측정

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we demonstrate a murine cryoinjury infarct model that generates precise infarct sizes with high reproducibility and replicability. In brief, after intubation and sternotomy of the animal, the heart is lifted from the thorax. The probe of a handheld liquid nitrogen delivery system is applied onto the myocardial wall to induce cryoinjury. Impaired ventricular function and electrical conduction can be monitored with echocardiography or optical mapping. Transmural myocardial remodeling of the infarcted area is characterized by collagen deposition and loss of cardiomyocytes. Compared to other models (e.g., LAD-ligation), this model utilizes a handheld liquid nitrogen delivery system to generate more uniform infarct sizes.

This article demonstrates a model to study cardiac remodeling after myocardial cryoinjury in mice.

마우스에서 심근 경색을 연구하는 극저온 손상 모델

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

괴사 장염의 신생아 BALB/c 마우스 모델

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight ...