Ce protocole fournit une nouvelle approche pour quantifier la dynamique des branches de la tonnelle dendritique et développer des neurones à l’aide de l’imagerie en temps réel et d’un logiciel d’annotation d’image 3D. Cette technique images et suit les terminaux de branche fournissant une méthode rapide et efficace pour mesurer les comportements dynamiques de filopodia dendritique. La recherche utilisant cette méthode donne un aperçu de la façon dont le développement et l’activité régulent la morphogenèse dendrite.
Nos méthodes s’appliquent aux neurones peu étiquetés dans les milieux in vitro et in vivo. Lors de l’exécution de cette procédure, n’oubliez pas que les paramètres d’imagerie doivent être soigneusement ajustés pour atteindre une résolution temporelle et spatiale suffisante. Pour récolter les cerveaux de la drosophile larvaire, sous un microscope disséquant, utilisez une paire de forceps standard de dissection de pointe numéro cinq pour maintenir un spécimen larvaire en place tout en utilisant l’autre pour disséquer soigneusement le cerveau, en préservant les disques oculaires, les lobes cérébraux et le cordon nerveux ventral.
Retirez ensuite les muscles attachés pour minimiser tout mouvement de l’échantillon pendant l’imagerie. Lorsque tous les cerveaux ont été récoltés, utilisez de la graisse sous vide pour dessiner une chambre carrée sur une glissière en verre et ajouter 20 microlitres de solution saline externe à la chambre. Utilisez les forceps pour transférer le cerveau à la chambre et ajuster les positions du cerveau sous le microscope avec les côtés dorsal face vers le haut.
Couvrez la chambre d’un slip de couverture en verre et appuyez doucement sur le bordereau de couverture pour réduire la dérive de l’échantillon pendant la procédure d’imagerie. Pour identifier les explantations cérébrales contenant des neurones étiquetés individuellement, dans les 30 minutes qui ont pris la dissection, choisissez un objectif d’immersion d’eau de 40 X et une source de lumière épifluorescence. Sélectionnez un laser à deux photons réglé à 920 nanomètres et un détecteur non Dscan et définissez les paramètres d’imagerie pour recueillir les images à 512 par 512 pixels par image et une minute par Z-stack pendant 10 minutes.
Ensuite, ajustez le zoom optique et numérique pour obtenir une résolution X, Y, Z suffisante tout en assurant la couverture de toute la tonnelle dendritique en moins d’une minute. Les paramètres généreront des images avec une résolution typique X, Y, Z de 0,11 par 0,11 par 0,25 micromètre. Pour la correction de la dérive, ouvrez le fichier d’intérêt dans un logiciel de correction de dérive approprié et cliquez sur Modifier et modifier les paramètres microscopiques.
Réglez le type de microscope sur Wide Field pour les deux images photons s’il existe une option de deux photons et suivez le flux de travail défini par le logiciel. Pour la déconvolution, ouvrez l’image corrigée de dérive dans le logiciel de déconvolution et suivez le flux de travail. Ensuite, enregistrez l’image décontvolvée dans un type de fichier qui est pris en charge par le logiciel d’annotation d’image ultérieur capable d’analyser les données 4D et de signaler les coordonnées spatiales des taches définies dans l’image.
Pour l’annotation de l’image, ouvrez l’image décontvolvée dans le logiciel d’annotation de l’image et examinez et marquez les conseils de branche à tout moment en 3D. Le logiciel d’annotation d’image signalera et stockera les coordonnées spatiales et temporelles des pointes marquées de branche. Exportez les informations de coordonnées en tant que fichier CSV pour des calculs ultérieurs.
Dans le module Spots, cliquez sur Sauter la création automatique, modifier manuellement, et coché l’autoconnect à la case à cochée Spot sélectionné. Passez en revue les images de la série de temps et sélectionnez une branche pour l’annotation. En tenant la touche Shift, cliquez sur la pointe du terminal de branche pour ajouter une place.
Ensuite, cliquez sur l’onglet Statistiques, sélectionnez Valeurs détaillées et spécifiques et Position. Les informations de coordonnées spatiales et temporelles enregistrées seront affichées. Cliquez sur Enregistrer pour exporter les données en tant que fichier CSV.
Pour calculer le placement de pointe de branche en 3D, ouvrez le fichier CSV comme feuille de calcul et sélectionnez la colonne D’identification de la voie. Cliquez sur Trier le plus petit pour le plus grand et accepter d’élargir la sélection. Après le tri, Track ID identifiera chaque branche dendritique unique et les taches de la même branche partagent la même colonne Track ID.The Time stockera les informations à partir de différents délais.
Dans la feuille de calcul, ajoutez une colonne Distance et utilisez les coordonnées pour calculer la distance de chaque deux endroits adjacents temporellement. Pour mesurer les mouvements mineurs au niveau voxel unique, réinitialisez toutes les valeurs de distance inférieures à 0,3 micromètre pour filtrer toute annotation d’image non corrigée à la dérive ou imparfaite. Ensuite, créez une colonne Déplacement et copiez les valeurs de la colonne Distance à la colonne Déplacement.
Attribuez manuellement les événements d’extension et de rétractation pour chaque conseil de branche. S’il s’agit d’une extension, laissez la valeur de déplacement positive inchangée. S’il s’agit d’une rétractation, modifiez la valeur de déplacement correspondante en valeur négative.
Ensuite, dans une nouvelle colonne Événement, résumez les valeurs de déplacement pour les événements individuels d’extension et de rétractation. Dans cette vidéo, une série d’images projetées d’intensité maximale recueillies auprès d’un représentant étiqueté individuellement neurone latéral ventral peut être observée. Les images à cadre unique permettent d’évaluer les événements de rétractation et d’extension.
Le suivi 4D semi-automatique des terminaux de branche permet l’annotation des terminaux dynamiques de branche des neurones latéraux ventral individuellement étiquetés comme démontré. Le calcul de la direction et de la distance des mouvements de branche à chaque point de temps permet une comparaison de la dynamique de branche dendritique pour les neurones latéraux ventraux étiquetés individuellement à différents stades de développement. L’étape la plus importante est de préserver l’intégrité du tissu cérébral et de la morpholoy dendrite pendant la dissection et le montage.
La qualité des séries d’images brutes est également essentielle au succès du suivi et de la quantification. En utilisant cette technique, nous avons acquis la capacité d’effectuer l’analyse quantitative de la filopodie dendrite dans le développement des neurones centraux de drosophile et d’explorer les machines moléculaires relatives à la maturation et à la synaptogenèse des dendrites.
